CN110257485A - 一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：S1原料选取、S2扩增纯化、S3质检筛选、S4确定拷贝数、S5荧光测定、S6测定结果；本发明的有益效果是：通过特异性引物Lactobacillusplantarum‑ R、Lactobacillusplantarum‑F与Lactobacillusparacasei‑F、Lactobacillusparacasei‑R，进而大量扩增出所需的两种目的基因；通过利用搭载不同目的基因的大肠杆菌显色不同，方便后期确定拷贝数；通过利用随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低的这一特性，当达到特征峰温度时，特异产物与其它产物区分开，进而可以确定具体产物。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌的荧光定量PCR领域，具体是一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法。
背景技术
益生乳制品因其丰富的营养价值和特殊的益生功效成为人们关注的热点。目前市场上益生菌及含有益生菌的乳制品种类繁多。近几年，发酵豆乳产品在日本及欧美地区备受欢迎，尤其作为一种调节血脂的保健食品在日本市场十分活跃。发酵豆乳是以豆乳为主要原料，利用豆乳含有优质的大豆蛋白以及人体必需的氨基酸、膳食纤维、异黄酮和矿物质等特性，通过益生菌发酵制成。它改善了豆乳风味，更利于人体吸收，兼有大豆和益生菌双重保健作用，但对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。
传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理、生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。因此，利用传统方法对益生菌含量的测定和确认，极容易受到环境因素影响，从而导致益生菌含量测定出现较大波动，导致不必要的经济损失和食品安全问题。PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域，其中实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。采用乳杆菌种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、准确的发酵豆乳中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的定性、定量测定方法，可以简化益生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的检测能力，完善保健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，以至少达到快速检测、高效率检测的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1原料选取：选取实验室自制的发酵豆乳中的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌，同时针对植物乳杆菌、副干酪乳杆菌中的目的基因分别筛选特异性引物F与R，并选取载体质粒；
S2扩增纯化：将扩增所用反应试剂置于PCR仪中，按照预变性、变性、退火、延伸，分别扩增S1中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌中的目的基因，同时采用PCR试剂盒分别对扩增出的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因进行纯化；
S3质检筛选：利用T-A克隆法将S2中扩增纯化后目的基因分别与S1中选取的载体质粒连接，同时将转入目的基因的载体质粒转化到大肠杆菌中，并通过LB培养基进行扩增培养，培养72-86h后通过培养皿上蓝白斑筛选出显色单菌落，运用质粒盒分别提取筛选出的显色单菌落的质粒，针对提取出的质粒分别进行测序。
S4确定拷贝数：将S3中测序鉴定无误后的质粒分别通过紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过拷贝数公式将测定的质粒浓度通过标准曲线转化为拷贝数(copies/μL)
S5荧光测定：a.主混液配制：选用16.5μL的2x ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix，0.8μL的5μM引物F(5uM)，0.8μL的5μM引物R(5uM)，2μL的T emplate(DNA)；b.PCR扩增循环：95℃条件下预变性5min，95℃条件下变性5s，56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s，72℃条件下延伸40s，将上述步骤循环40次；c.将所得的两种样本置于96孔板上在荧光定量PCR仪中进行反应；
S6测定结果：测定S5中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线，并通过所测数据推算出基因浓度。
优选的，所述所述S1、S5中引物F与引物R分别为：
植物乳杆菌： 5’-3’
Lactobacillusplantarum-R -AGGTGTTATCCCCCGCTTCT-
Lactobacillusplantarum-F -TTACATTTGAGTGAGTGGCGAACT-；
副干酪乳杆菌：
Lactobacillusparacasei-F -TCCGGGAACTGCTCAGC-
Lactobacillusparacasei-R -TGTTTCACGAACAGGTG-；
通过选用特异性的引物对，进而使选定的目的基因扩增足够数量。
优选的，所述的载体质粒为pMD18-T，质粒大小为2692bp，通过选取常见的pMD18-T质粒，限定大小，方便搭载时质粒更好转化入大肠杆菌中。
优选的，所述的S3中显色单菌落中蓝白斑为：蓝色菌落斑为搭载副干酪乳杆菌中目的基因的大肠杆菌菌落、白色菌落斑为搭载植物乳杆菌中目的基因的大肠杆菌菌落，通过不同目的基因的大肠杆菌菌落显色不同，进而筛选出不同目的基因。
优选的，所述的溶解曲线通过测定扩增反应后不断加温时的荧光信号强度得到，通过利用随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低的这一特性，当达到特征峰温度时，特异产物与其它产物区分开，进而可以确定具体产物。
优选的，所述的S3中针对提取出的质粒进行测序，保证进行拷贝数确定时，所用质粒中包含有目的基因。
本发明的有益效果是：1.通过针对植物乳杆菌、副干酪乳杆菌中目的基因而设计的特异性引物Lactobacillusplantarum-R、Lactobacillusplantarum-F与Lactobacillusparacasei-F、Lactobacillusparacasei-R，进而大量扩增出所需的两种目的基因。
2.通过利用搭载植物乳杆菌目的基因与副干酪乳杆菌目的基因的大肠杆菌显色不同，进而更准确得到含有不同目的基因质粒的大肠杆菌，方便后期确定拷贝数。
3.通过利用随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低的这一特性，当达到特征峰温度时，特异产物与其它产物区分开，进而可以确定两种菌种目的基因具体产物以及浓度。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线；
图3为本发明的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因标准品荧光PCR扩增曲线和熔解曲线；
图4为本发明的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
如图1所示，种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1原料选取：选取实验室自制的发酵豆乳中的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌，同时针对植物乳杆菌、副干酪乳杆菌中的目的基因分别筛选特异性引物F与R，具体引物如下：植物乳杆菌： 5’-3’
Lactobacillusplantarum-R -AGGTGTTATCCCCCGCTTCT-
Lactobacillusplantarum-F -TTACATTTGAGTGAGTGGCGAACT-；
副干酪乳杆菌：
Lactobacillusparacasei-F -TCCGGGAACTGCTCAGC-
Lactobacillusparacasei-R -TGTTTCACGAACAGGTG-；
通过选用特异性的引物对，进而使选定的目的基因扩增足够数量；选取载体质粒为pMD18-T，质粒大小为2692bp，通过选取常见的pMD18-T质粒，限定大小，方便搭载时质粒更好转化入大肠杆菌中；
S2扩增纯化：将扩增所用反应试剂置于PCR仪中，通过如下步骤得到S1中目的基因扩增产物：
a.原料选取：选取10μL的2X的Taq Plus Master Mix，选取0.8μL的引物LactobacillusplantarumF与引物LactobacillusplantarumR、0.8μL的引物LactobacillusparacaseiF与引物LactobacillusparacaseiR、1μL的DNA模板、7.4μL的ddH2O；
b.反应进程：将选取的原料根据目的基因不同分别混合置于PCR扩增仪中，95℃条件下预变性5min，循环一次；95℃条件下变性30s，循环35次；56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s；72摄氏度条件下延伸1min
S3质检筛选：利用T-A克隆法将S2中扩增纯化后目的基因分别与S1中选取的载体质粒连接，同时将转入目的基因的载体质粒转化到大肠杆菌中，并通过LB培养基进行扩增培养，培养72-86h后通过培养皿上蓝白斑筛选出显色单菌落，具体筛选原理为：通过不同目的基因的大肠杆菌菌落显色不同，进而筛选出不同目的基因；随后运用质粒盒分别提取筛选出的显色单菌落的质粒，针对提取出的质粒分别进行测序，具体的测序步骤为：破碎提取出的质粒，超速离心出破碎物中DNA，利用DNA探针进行杂交，确定所述提取出的质粒为所需质粒。
S4确定拷贝数：将S3中测序鉴定无误后的质粒分别通过紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过拷贝数公式将测定的质粒浓度通过标准曲线转化为拷贝数(copies/μL)，所述公式为：
拷贝数(copies/μL)＝浓度(ng/μL)×10-9×6.02×1023/(分子量×660)，
所述分子量为载体的大小加上目的基因的片段大小；
同时标准曲线通过采用45μL稀释液加入5μL质粒，通过预实验分别选取标准品的10-2～10-7稀释液制备得到，具体如图3所示，其中(a)为植物乳杆菌标准品扩增曲线，(b)为植物乳杆菌标准品熔解曲线，(c)为副干酪乳杆菌标准品扩增曲线，(d)为副干酪乳杆菌标准品熔解曲线；
S5荧光测定：a.主混液配制：选用16.5μL的2x ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix，0.8μL的5μM引物F(5uM)，0.8μL的5μM引物R(5uM)，2μL的T emplate(DNA)；b.PCR扩增循环：95℃条件下预变性5min，95℃条件下变性5s，56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s，72℃条件下延伸40s，将上述步骤循环40次；c.将所得的两种样本置于96孔板上在荧光定量PCR仪中进行反应；
S6测定结果：测定S5中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线，如图2所示，其中(a)为植物乳杆菌扩增曲线，1为发酵豆乳中植物乳杆菌扩增曲线，2为标准植物乳杆菌扩增曲线，3为近源菌株扩增曲线；(b)为植物乳杆菌熔解曲线，1为标准植物乳杆菌溶解曲线，2为发酵豆乳中植物乳杆菌溶解曲线，3为近源菌株溶解曲线；(c)为副干酪乳杆菌扩增曲线，1为发酵豆乳中副干酪乳杆菌扩增曲线，2为标准副干酪乳杆菌扩增曲线，3为近源菌株扩增曲线；(d)为副干酪乳杆菌熔解曲线，1为发酵豆乳中副干酪乳杆菌溶解曲线，2为标准副干酪乳杆菌溶解曲线，3为近源菌株溶解曲线。
从图3中的(a)中选取5个点、(c)中选取6个点制作循环数及基因浓度的标准曲线，即为图4，图4中(a)为植物乳杆菌基因标准曲线、(b)为副干酪乳杆菌标准曲线，通过图2与图3可分析出循环数(Ct值)，进而得到样本的基因浓度，如表1所示。
表1样本基因Ct值及定量结果
| 乳酸菌名称 | Ct值 | 定量值(cfu/ml) |
| 植物乳杆菌 | 10.17±0.27 | (4.5361±0.85)×10<sup>9</sup> |
| 副干酪乳杆菌 | 12.43±0.04 | (1.0417±0.03)×10<sup>9</sup> |
通过表1可以确定植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的比例为4:1；同时通过图2以及图3可得到植物乳杆菌的标准品扩增效率为95.69％，副干酪乳杆菌标准品扩增效率为97.41％，进而达到高效检测发酵豆乳中复合益生菌比例的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1原料选取：选取实验室自制的发酵豆乳中的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌，同时针对植物乳杆菌、副干酪乳杆菌中的目的基因分别筛选特异性引物F与R，并选取载体质粒；
S2扩增纯化：将扩增所用反应试剂置于PCR仪中，按照预变性、变性、退火、延伸，分别扩增S1中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌中的目的基因，同时采用PCR试剂盒分别对扩增出的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因进行纯化；
S3质检筛选：利用T-A克隆法将S2中扩增纯化后目的基因分别与S1中选取的载体质粒连接，同时将转入目的基因的载体质粒转化到大肠杆菌中，并通过LB培养基进行扩增培养，培养72-86h后通过培养皿上蓝白斑筛选出显色单菌落，运用质粒盒分别提取筛选出的显色单菌落的质粒，针对提取出的质粒分别进行测序。
S4确定拷贝数：将S3中测序鉴定无误后的质粒分别通过紫外分光光度计测定质粒OD260的值，通过拷贝数公式将测定的质粒浓度通过标准曲线转化为拷贝数(copies/μL)
S5荧光测定：a.主混液配制：选用16.5μL的2x ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8μL的5μM引物F(5uM)，0.8μL的5μM引物R(5uM)，2μL的T emplate(DNA)；b.PCR扩增循环：95℃条件下预变性5min，95℃条件下变性5s，56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s，72℃条件下延伸40s，将上述步骤循环40次；c.将所得的两种样本置于96孔板上在荧光定量PCR仪中进行反应；
S6测定结果：测定S5中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线，同时。
2.根据权利要求1所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述S1、S5中引物F与引物R分别为：
3.根据权利要求1所述的，其特征在于一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法：所述的载体质粒为pMD18-T，质粒大小为2692bp。
4.根据权利要求1所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的S3中显色单菌落中蓝白斑为：蓝色菌落斑为搭载副干酪乳杆菌菌落中目的基因的大肠杆菌菌落、白色菌落斑为搭载植物乳杆菌目的基因的大肠杆菌菌落。
5.根据权利要求1所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的S2中PCR扩增具体流程为：
a.原料选取：选取10μL的2X的Taq Plus Master Mix，选取0.8μL的引物LactobacillusplantarumF与引物LactobacillusplantarumR、0.8μL的引物LactobacillusparacaseiF与引物LactobacillusparacaseiR、1μL的DNA模板、7.4μL的ddH2O；
b.反应进程：将选取的原料根据目的基因不同分别混合置于PCR扩增仪中，95℃条件下预变性5min，循环一次；95℃条件下变性30s，循环35次；56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s；72摄氏度条件下延伸1min。
6.根据权利要求1所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的溶解曲线通过测定扩增反应后不断加温时的荧光信号强度得到。
7.根据权利要求6所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的荧光信号强度随温度变化的溶解曲线有一特征峰。
8.根据权利要求1所述的一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的S3中针对提取出的质粒进行测序，流程如下：破碎提取出的质粒，超速离心出破碎物中DNA，利用DNA探针进行杂交，确定所述提取出的质粒为所需质粒。
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