CN110256545A

CN110256545A - ZmAER蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110256545A
Application number: CN201910531550.9A
Authority: CN
Inventors: 王喜庆; 王祎; 刘芳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110256545B

Abstract

本发明公开了一种ZmAER蛋白及其编码基因和应用。本发明保护ZmAER蛋白或其相关生物材料在调控植物耐低氮能力中的应用。本发明提供的玉米ZmAER基因编码的烯醛氧化还原酶可以调节活性羰基化合物含量进而影响耐低氮能力，可为研究作物氮高效机理提供新的思路，从而为培育氮高效品种提供新的策略。

Description

ZmAER蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体涉及一种ZmAER蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

氮是植物生长发育所必须的大量营养元素，也是影响作物生长和产量的主要限制因子之一。缺氮不仅严重影响根系的生长，而且影响叶绿素含量、硝酸还原酶和谷氨酸合成酶活性等生化指标，进而影响植株的光合效率，最终导致产量的降低。

研究表明，非豆科作物每产生1千克干物质量需要吸收20到50克氮，因此在大多数农业种植体系下土壤自然供应的氮素远不能满足作物的生长所需。氮肥的施用和优良品种的选育能有效地缓解全球人口增长带来的粮食危机。但是，氮肥所带来的粮食增产是以大量的能源消耗和极大的环境风险为代价的，氮肥的不合理施用已经对大气、水和土壤安全造成了威胁。因此，降低氮肥的投入，提高作物的氮效率是目前农业生产所面临的紧迫问题。加深对作物低氮耐受性的机理研究，可以为提高作物氮高效品种的培育指明方向。

对植株氮高效的研究围绕氮素营养本身开展了许多卓有成效的工作，包括氮吸收高效(硝酸根转运蛋白、铵转运蛋白)、氮同化高效(硝酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因)以及体内氮转运高效相关基因的克隆和分析。但是对低氮胁迫下，植株生长受到抑制的细胞水平的变化研究较少。植物光合作用中会产生大量的活性氧，在正常生长环境下，这些物质进入碳氮代谢被消耗掉，维持细胞正常的氧化还原状态。但是，当植物处于低氮等逆境胁迫时，光合作用的电子传递链遭到破坏，导致活性氧的积累，氧化细胞不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，进而发生脂质过氧化级联反应，生成活性不饱和羰基化合物，例如丙烯醛、乙二醛、壬烯醛、己烯醛等。这些脂源性活性羰基化合物富含亲电子基团，会对细胞中的生物大分子，蛋白质、DNA、RNA，以及细胞膜中的亲核基团进行攻击，导致生物大分子结构破坏，进而使得细胞功能紊乱。植物细胞通过体内的烯醛氧化还原酶等活性羰基化合物清除酶的作用，清除活性羰基化合物，维持细胞活力。现有研究表明，低氮等逆境胁迫均会增加细胞中的活性氧含量，使细胞受到氧化胁迫，体内活性羰基化合物含量增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种ZmAER蛋白及其编码基因和应用。

第一方面，本发明保护ZmAER蛋白或其相关生物材料在调控植物耐低氮能力中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述ZmAER蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述ZmAER蛋白来源于玉米。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明保护ZmAER蛋白或其相关生物材料在如下(A)-(E)中至少一种的应用：

(A)调控植物低氮胁迫下生长情况；

(B)调控植物氮利用率；

(C)调控植物烯醛还原酶活性；

(D)调控植物低氮胁迫下硝酸还原酶活性；

(E)缓解植物低氮胁迫下氧化胁迫；

所述相关生物材料为能够表达所述ZmAER蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述ZmAER蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

以上任一所述应用的具体体现如下：

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物耐低氮能力增加；

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物低氮胁迫下株高和/或生物量增加；

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物氮利用率增加；

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物烯醛还原酶活性增加；

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物低氮胁迫下硝酸还原酶活性增加；

所述ZmAER蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物低氮胁迫下丙二醛和过氧化氢含量降低。

第三方面，本发明保护下述任一方法：

(B1)培育耐低氮能力增加的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmAER蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

(B2)培育氮利用率增加的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmAER蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

(B3)培育烯醛还原酶活性增加的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmAER蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

(B4)培育低氮胁迫下硝酸还原酶活性增加的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmAER蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述ZmAER蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明要求保护下述任一方法：

(C1)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物耐低氮能力大于受体植物；

(C2)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物氮利用率大于受体植物；

(C3)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物烯醛还原酶活性大于受体植物；

(C4)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物低氮胁迫下硝酸还原酶活性大于受体植物；

所述ZmAER蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述“向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述ZmAER蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

可用现有的表达载体构建含有所述ZmAER蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用ZmAER蛋白的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用ZmAER蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明中，所述重组表达载体具体可为将序列表的序列2所示的DNA分子通过TA克隆方法连接到pBCXUN载体上得到的重组表达载体。

在上述方法中，将携带有所述ZmAER蛋白的编码基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

上述ZmAER蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：

(D1)序列表的序列2所示的DNA分子；

(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述ZmAER蛋白的DNA分子；

(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述ZmAER蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第四方面，本发明要求保护本发明要求保护上述ZmAER蛋白或其相关生物材料，或，以上任一所述的方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的是选育耐低氮能力高的植物。

在上述各方面中，所述植物可为(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)双子叶植物或单子叶植物；

(C2)禾本科植物；

(C3)玉米。

所述玉米具体可为玉米自交系B73-329。

本发明提供的玉米ZmAER基因编码的烯醛氧化还原酶可以调节活性羰基化合物含量进而影响耐低氮能力，可为研究作物氮高效机理提供新的思路，从而为培育氮高效品种提供新的策略。

附图说明

图1为ZmAER表达模式分析。

图2为PCR方法检测Ubi:ZmAER是否插入基因组。

图3为qRT-PCR检测转基因株系和WT(B73-329)中ZmAER的表达水平。

图4为ZmAER过量表达株系水培表型观察。

图5为ZmAER过量表达株系水培分叶位表型观察。

图6为水培条件下ZmAER过量表达株系生物量分析。

图7为水培条件下ZmAER过量表达株系地上部和根中氮含量及氮累积量分析。

图8为水培条件下ZmAER过量表达株系的氮利用效率。A：地上部氮利用率；B：根系氮利用效率；C：整个植株氮利用效率。n＝6。*,P≤0.05水平下过表达株系与WT差异显著；**,P≤0.01水平下过表达株系与WT差异显著。

图9为水培条件下ZmAER过量表达株系叶片NR和GS酶活性。*,P≤0.05水平下过表达株系与WT差异显著；**,P≤0.01水平下过表达株系与WT差异显著。

图10为水培条件下ZmAER过量表达株系叶片和根中MDA和H₂O₂含量。*,P≤0.05水平下过表达株系与WT差异显著；**,P≤0.01水平下过表达株系与WT差异显著。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

玉米自交系B73-329：参考文献：冯汉宇,江颖,张立全,etal.利用花青素基因标记研究正反交对玉米杂交种主要性状的影响[J].玉米科学,2018,26(2):16-22.；公众可以从中国农业大学获得。

pBCXUN载体：参考文献：闫蕾.玉米隐花色素基因CRY1a的克隆及功能分析[D].2016.；公众可以从中国农业大学获得。

实施例1、ZmAER及其编码基因的获得

提取玉米自交系B73-329多个组织的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为ZmAER蛋白。将编码ZmAER蛋白的基因命名为ZmAER基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、ZmAER的组织表达模式分析

1、挑选籽粒饱满的玉米自交系B73-329种子，浸泡于10％H₂O₂中消毒30min，保证种子充分接触到消毒液。

2、完成步骤1后，将种子用纯水漂洗种子3-5次，直至冲洗干净，然后将种子浸泡于纯水中过夜。

3、完成步骤2后，将种子平铺于放有湿润滤纸的平皿中，黑暗催芽，至露白0.5cm左右。

4、完成步骤3后，将露白的种子播种于蛭石中萌发，直至长出两片叶。

完成步骤4后，挑选长势一致的一叶一心幼苗，小心去除胚乳及胚，并用去离子水清洗掉幼苗根部附着的蛭石，用1‰多菌灵溶液涂抹去胚的伤口，期间保证幼苗根部湿润。

5、配制1/2离子浓度的全营养液(全营养液配方见表1，1/2离子浓度即为全量配方各离子浓度减半)，调pH6.0，分装20L至蓝色塑料盒(长45cm×宽35cm×高14cm)中。

表1玉米水培全营养液配方

7、用洁净海绵条夹住步骤5处理后的幼苗紧靠第一叶叶枕以下的位置，将幼苗固定在定制的PVC板上的孔洞中，将该PVC板盖于步骤6制备的盛有水培营养液的蓝盒中，培养两天；水培地点为玻璃温室，每天6:00—9:00、17:00—21:00使用全光谱钠灯进行补光，温室条件基本保持在光照强度150至200μmol/m-2/s-1；温度为28℃(光照)/23℃(黑暗)，湿度为60％。

8、完成步骤7后，将幼苗分别移入高氮(HN,4mMNO₃--N)和低氮(LN,0.05mM NO₃ ^--N)全营养液(配方同表1，高氮和低氮浓度通过调节Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度实现)中继续培养(培养条件同步骤7)，期间3天更换一次营养液，直至收苗。

9、完成步骤8后，提取玉米自交系B73-329水培植株V4期的多个组织器官(根、叶、叶鞘)的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，通过qRT-PCR检测ZmAER基因的表达情况(以玉米UBQ基因作为内参基因)，ZmAER基因特异引物和内参基因的引物如下：

ZmAER-Q-F：5’-TCAGGAGCCGTTGGTCAG-3’；

ZmAER-Q-R：5’-ATCATTCCGCAGGTAGGG-3’；

ZmUBQ-Q-F：5’-CTGGTGCCCTCTCCATATGG-3’；

ZmUBQ-Q-R：5’-CAACACTGACACGACTCATGACA-3’。

结果如图1所示。

结果表明，ZmAER主要在叶片中表达，在根中表达量很低，在叶鞘中也有部分表达。高低氮水培条件下，ZmAER表达量的变化并不显著。

实施例2、过表达ZmAER的玉米的获得

一、转ZmAER玉米的获得

1、将序列表的序列2所示的DNA分子通过TA克隆方法连接到pBCXUN载体上，得到重组表达载体pBXCUN-ZmAER(已经测序验证)。

2、将步骤1得到的重组表达载体pBXCUN-ZmAER导入农杆菌EHA105菌株，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌通过农杆菌介导法导入玉米自交系B73-329中，获得T0代转基因植株。

4、取步骤3得到的T0代转基因植株(OE1、OE3、OE4、OE6、OE7、OE8)的幼苗叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物Ubip-F(针对重组表达载体pBXCUN-ZmAER的Ubiquitin启动子5’端设计)和引物ZmAER-R(针对ZmAERCDS3’端设计)组成的引物对进行PCR扩增；同时采用引物ZmAER-F(针对ZmAERCDS的5’端设计)和引物ZmAER-R组成的引物对进行PCR扩增。

将上述扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。同时设置采用玉米自交系B73-329幼苗叶片的基因组DNA作为模板的对照(WT)。

结果如图2所示。结果表明，转基因植株能扩增出约1000bp大小的单一条带，而亲本B73-329没有扩增出相应条带，说明Ubi:ZmAER被成功插入到亲本基因组中。

5、将步骤4鉴定正确的T0代阳性转基因植株进行自交获得T1代转基因子代，T1代转基因子代再进行自交，得到T2代转基因子代，T2代转基因子代再进行自交，得到T3代转基因子代。在每一代采用步骤4的方法进行鉴定。以T3代阳性转ZmAER玉米纯合株系作为后续功能分析实验的材料。

二、转空载体玉米的获得

采用pBCXUN载体替代重组表达载体pBXCUN-ZmAER导入玉米自交系B73-329中并进行传代，以T3代阳性转空载体玉米纯合株系作为后续功能分析实验的对照。

三、Realtime-PCR对转基因玉米幼苗中ZmAER表达量进行分析

待测植株：T3代阳性转ZmAER玉米纯合株系(OE1、OE3、OE4、OE6、OE7、OE8)、T3代阳性转空载体玉米纯合株系和玉米自交系B73-329。

提取待测植株V4期的根、叶、叶鞘的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，通过qRT-PCR检测ZmAER基因的表达情况(以玉米UBQ基因作为内参基因)，ZmAER基因特异引物和内参基因的引物如下：

ZmAER-Q-F：5’-TCAGGAGCCGTTGGTCAG-3’；

ZmAER-Q-R：5’-ATCATTCCGCAGGTAGGG-3’；

ZmUBQ-Q-F：5’-CTGGTGCCCTCTCCATATGG-3’；

ZmUBQ-Q-R：5’-CAACACTGACACGACTCATGACA-3’。

每个株系检测3株。

结果如图3所示。结果表明，过表达株系的ZmAER的表达量均显著高于玉米自交系B73-329(WT)，其中OE7的表达量最高，ZmAER的表达水平大约是B73-329的140倍，OE3和OE4的表达量较低，大约是B73-329的15倍。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

上述结果表明Ubi:ZmAER成功插入到转基因株系中，并且可以高量表达。

实施例3、水培条件下ZmAER过量表达株系低氮下的表型鉴定

按照实施例2的步骤1-5进行操作。观察植株表型及分叶位表型，统计地上部和根的生物量，测定植株的氮含量和氮利用效率。

每个株系检测6株。

氮含量测定方法如下：玉米植株鲜样在105℃杀青后于70℃烘干至恒重，测定各部位干重。粉碎机粉碎后用万分之一天平称取0.1g干样于消化管中，采用H₂SO₄-H₂O₂法进行消煮，通过流动注射分析仪测定总氮浓度。用组织干重乘以氮浓度计算植株氮累积量。

低氮(LN)处理14天时表型观察结果见图4。图4A为高氮(HN)条件下表型观察结果，图4B为低氮胁迫下表型观察结果。结果表明，高氮条件下转ZmAER玉米纯合株系与玉米自交系B73-329(WT)在外形上没有差异，低氮胁迫下可明显观察到转ZmAER玉米纯合株系OE1、OE3、OE6、OE7和OE8的植株高于玉米自交系B73-329(WT)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

分叶位观察结果见图5。结果表明，高氮(HN)条件下完全展开叶转ZmAER玉米纯合株系和玉米自交系B73-329(WT)大小没有明显差异，第7、8、9片新叶大小上存在一定差异，并且差别并不一致(图5A)。低氮(LN)胁迫14天后，可明显观察到植株显著小于高氮培养条件，植株叶鞘发红，第一、二片叶完全干枯，第三片叶可看到明显的缺氮黄化症状，其他叶片叶色变浅(图5B)。分叶位观察可发现，转ZmAER玉米纯合株系第6片叶显著大于玉米自交系B73-329(WT)(图5B)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

植株生物量统计结果见图6。

结果显示，高氮(HN)条件下转ZmAER玉米纯合株系植株地上部和根的生物量与玉米自交系B73-329(WT)相比均无显著差异。但是，低氮(LN)胁迫下，转ZmAER玉米纯合株系植株地上部生物量显著高于玉米自交系B73-329(WT)，各株系地上部生物量比玉米自交系B73-329(WT)分别增加了43％、44％、18％、69％、82％和28％(图6A)，根部生物量除OE4和OE8外，其他株系均显著高于玉米自交系B73-329(WT)(图6B)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

上述结果表明，在玉米中过量表达ZmAER可以显著提高植株对低氮的耐受性。

氮含量的测定结果见图7。

结果显示，高氮(HN)条件下，转ZmAER玉米纯合株系植株地上部氮含量与玉米自交系B73-329(WT)没有显著差异；低氮(LN)条件下，OE4、OE6和OE7的地上部氮含量显著低于玉米自交系B73-329(WT)，其他株系没有显著差异(图7A)。高氮条件下，转ZmAER玉米纯合株系植株多数根中氮含量低于玉米自交系B73-329(WT)，而低氮条件下，只有OE1含量显著低于玉米自交系B73-329(WT)，其他株系差异不显著(图7B)。低氮胁迫下，转基因植株地上部氮累积量显著高于玉米自交系B73-329(WT)(OE4无显著差异)，相对于玉米自交系B73-329(WT)分别增加了29％、29％、50％、29％和25％(图7C)。过量表达ZmAER对低氮下植株根的氮累积量没有显著影响，仅OE6高于玉米自交系B73-329(WT)。然而高氮条件下，株系OE3、OE4、OE6和OE7根中的氮累积量显著低于玉米自交系B73-329(WT)，与氮含量的差异类似(图7D)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

植株氮利用效率(植株生物量/植株氮累积量)统计结果见图8。结果显示，低氮(LN)胁迫下，除OE8外，其他转基因植株地上部的氮利用率显著高于玉米自交系B73-329(WT)，NUE分别增加22％、37％、38％、24％和33％(图8A)。高氮(HN)条件下，多数转基因株系根的NUE均显著高于玉米自交系B73-329(WT)(图8B)。除OE8以外，其他5个过量表达株系在低氮胁迫下，整株氮利用率均显著高于玉米自交系B73-329(WT)，分别增加24％、18％、30％、19％和34％(图8C)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

上述结果表明，过量表达ZmAER显著影响了植株的氮利用效率。

实施例4、ZmAER过量表达提高玉米植株体内AER酶活性

待测植株：T3代阳性转ZmAER玉米纯合株系(OE1、OE3、OE4、OE6、OE7、OE8)、T3代阳性转空载体玉米纯合株系和玉米自交系B73-329(WT)。

按照实施例中的步骤1-8操作，以反式-2-壬烯醛作为底物(Sigma公司，货号：255653)，对水培不同氮条件下玉米叶片和根部的烯醛还原酶活性进行测定，测定方法参考文献：Takagi,D.,Ifuku,K.,Ikeda,K.,Inoue,K.I.,Park,P.,Tamoi,M.,Inoue,H.,Sakamoto,K.,Saito,R.,andMiyake,C.(2016).SuppressionofchloroplasticAlkenal/OneoxidoreductaserepressesthecarboncatabolicpathwayinArabidopsisleavesduringnight.PlantPhysiol.170:2024–2039.。

每个株系检测4株。

叶片烯醛还原酶活性测定结果如表2所示。结果显示，低氮胁迫下植株的AER酶活性显著升高。过量表达ZmAER可以显著提高玉米叶片中的AER酶活性，高氮条件下转基因株系酶活性提高了32％到83％，而在低氮胁迫下，过量表达株系的酶活性比WT增加了2倍左右，最高AER酶活性可达WT的3倍以上(OE1)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

表2水培条件下叶片烯醛还原酶活性

注：括号中的数字表示将WT的活性作为100，其他过量表达株系的酶活性与之比较后的相对数值。

根部烯醛还原酶活性测定结果如表3所示。结果显示，根中AER酶活性低于叶片中的活性。过量表达AER酶显著提高了玉米根中的AER酶活性，活性为WT的2倍左右。与叶片中的结果不同，低氮胁迫下，虽然转基因植株酶活性显著高于WT，但是各株系相对于高氮条件而言，根中的AER酶活性没有显著变化。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

表3水培条件下根中烯醛还原酶活性

实施例5、ZmAER过量表达影响植株氮代谢

按照实施例2的步骤1-8进行操作，取水培条件下各处理植株的最上部完全展开叶(高氮处理为第五片叶，低氮处理为第4片叶)液氮研磨后测定硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，方法参照NR活性测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0085)和GS活性测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0915)说明书。

每个株系检测4株。

结果如图9所示。

结果显示，低氮(LN)胁迫下，玉米叶片中的NR和GS酶活性均显著提高。高氮(HN)条件下，过量表达株系与WT叶片NR酶活性差异不明显，仅OE6的活性显著高于WT。但是，在低氮条件下，除了OE1外，其他株系的NR活性均显著或极显著高于WT植株，相对于WT的活性，分别增加了58％、45％、34％和130％(图9A)。过量表达ZmAER的玉米株系的GS活性与WT在低氮胁迫下没有显著差异，仅OE1和OE6在高氮水平下高于WT植株(图9B)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

以上结果说明，低氮胁迫下，过量表达ZmAER可能主要通过影响NR活性，进而影响植株氮代谢能力。

实施例6、ZmAER过量表达缓解低氮下玉米体内的氧化胁迫

按照实施例2的步骤1-8进行操作，取水培条件下各处理植株的最上部完全展开叶(高氮处理为第五片叶，低氮处理为第4片叶)和根系液氮研磨后测定丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)的活性，方法参照丙二醛微量法测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0025)和过氧化氢微量法测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC3595)说明书。

每个株系检测4株。

结果如图10所示。

结果显示，低氮(LN)胁迫后玉米叶片和根系中的丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)含量极显著增加，说明低氮胁迫加剧了玉米植株体内的氧化胁迫。高氮(HN)条件下，转基因玉米叶片和根中的MDA含量与WT基本没有显著差异，仅OE6株系叶片的MDA含量显著低于WT。但是，低氮胁迫下，过量表达ZmAER显著降低了玉米体内的MDA含量，相对于WT植株，转基因株系中叶片的MDA含量降低了10％到30％，根中降低了8％到37％(图10A,C)。过量表达ZmAER对玉米叶片中的过氧化氢含量具有显著的降低效果，高氮条件下，过量表达株系叶片H₂O₂含量比WT降低了14％到22％；低氮胁迫下，过量表达株系叶片H₂O₂含量比WT降低了12％到25％(图10B)。但是，过量表达ZmAER对玉米根中的H₂O₂含量没有显著影响(图10D)。转空载体玉米纯合株系的结果与玉米自交系B73-329无显著差异。

以上结果说明，过量表达ZmAER可显著降低低氮胁迫下玉米植株体内的丙二醛和过氧化氢含量，缓解氧化胁迫。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> ZmAER蛋白及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays Linn.)

<400> 1

Met Ala Gly Gln Glu Val Ala Asn Lys Arg Val Val Leu Lys Arg Tyr

1 5 10 15

Val Thr Gly Phe Pro Gly Ala Asp Asp Met Glu Val Val Thr Gly Thr

20 25 30

Ala Arg Val Ala Val Pro Pro Gly Ser Thr Ala Met Val Leu Lys Asn

35 40 45

Leu Tyr Val Ser Cys Asp Pro Tyr Met Arg Gly Arg Met Thr Lys His

50 55 60

Glu Arg Pro Ser Tyr Val Pro Asp Phe Val Val Gly Glu Val Leu Glu

65 70 75 80

Asn Phe Gly Val Cys Lys Val Ile Ala Ser Gly His Gln Asp Phe Lys

85 90 95

Val Gly Asp Leu Val Trp Gly Met Thr Gly Trp Glu Glu Tyr Thr Leu

100 105 110

Ile His Asn Pro Glu Ser Phe Phe Lys Ile Lys His Pro Glu Leu Pro

115 120 125

Leu Ser Tyr Tyr Thr Gly Val Leu Gly Met Pro Gly Leu Thr Ala Trp

130 135 140

Ala Gly Phe Phe Asp Val Gly Lys Pro Lys Lys Gly Asp Tyr Val Phe

145 150 155 160

Val Ser Ala Ala Ser Gly Ala Val Gly Gln Leu Val Gly Gln Phe Ala

165 170 175

Lys Leu Thr Gly Cys Tyr Val Val Gly Ser Ala Gly Ser Asp Glu Lys

180 185 190

Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Phe Gly Phe Asp Glu Ala Phe Asn Tyr

195 200 205

Lys Lys Glu Gln Asp Leu Asp Ala Ala Leu Arg Arg Tyr Phe Pro Glu

210 215 220

Gly Ile Asp Ile Tyr Phe Glu Asn Val Gly Gly Ser Thr Leu Glu Ala

225 230 235 240

Val Leu Pro Asn Met Arg Ile His Gly Arg Ile Pro Thr Cys Gly Met

245 250 255

Ile Ser Gln Tyr Asn Leu Glu Glu Pro Glu Gly Val His Asn Leu Phe

260 265 270

Glu Ile Ile Thr Lys Arg Leu Arg Met Glu Gly Phe Met Val Phe Asp

275 280 285

Tyr Tyr Gly Gln Tyr His Lys Phe Glu Gln Glu Met Val Gly Tyr Leu

290 295 300

Lys Ala Gly Lys Ile Ala Tyr Val Glu Asp Ile Ala Glu Gly Leu Glu

305 310 315 320

Lys Ala Pro Glu Ala Leu Ile Gly Leu Phe Thr Gly Arg Asn Val Gly

325 330 335

Lys Gln Leu Val Ala Ile Ala Arg Glu

340 345

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays Linn.)

<400> 2

atggcggggc aggaggtggc gaacaagcgg gtggtactga agcgctacgt gacggggttc 60

cccggcgcgg acgacatgga ggtggtcaca ggcaccgcgc gcgtggccgt gccgccgggg 120

tcgacggcca tggtgctcaa gaacctctac gtgtcgtgcg acccttacat gcgcggccgt 180

atgaccaagc acgagaggcc cagctacgtc ccggacttcg tcgtggggga ggttttggaa 240

aactttggcg tctgcaaggt gatagcatct gggcaccagg atttcaaggt tggcgatctt 300

gtgtggggga tgaccggatg ggaggagtac actctcatcc ataacccgga gtcatttttc 360

aagatcaagc atcctgaatt gcctctgtcc tactacacag gcgttcttgg catgccgggc 420

cttactgctt gggctggatt tttcgatgtg ggcaagccca agaaaggcga ctatgtcttc 480

gtctcagcag catcaggagc cgttggtcag cttgttgggc agtttgctaa gctcacagga 540

tgttatgttg tcggcagtgc tggttctgac gagaaggtta atcttctgaa aacaaagttt 600

ggcttcgatg aagcattcaa ctacaagaaa gagcaggacc tcgatgccgc cttgaggagg 660

tacttcccag agggcattga catctacttc gagaacgtgg gtggcagcac actggaagcc 720

gtgcttccca acatgcgtat ccatggtcgg atccctacct gcggaatgat ctcgcagtac 780

aatctggagg agccagaggg tgtgcacaac ctatttgaaa tcatcactaa gcgcctgcgc 840

atggagggtt tcatggtctt cgactactac ggccagtacc acaagttcga gcaagagatg 900

gtcgggtacc tcaaggcggg gaagatagcc tacgtcgagg acattgctga ggggctagag 960

aaggcgccgg aggcactcat cgggctcttc accgggcgca acgtcggcaa gcaactggtc 1020

gccattgcgc gggaatga 1038

Claims

1.ZmAER蛋白或其相关生物材料在调控植物耐低氮能力中的应用；

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.ZmAER蛋白或其相关生物材料在如下(A)-(E)中至少一种的应用：

(A)调控植物低氮胁迫下生长情况；

(B)调控植物氮利用率；

(C)调控植物烯醛还原酶活性；

(D)调控植物低氮胁迫下硝酸还原酶活性；

(E)缓解植物低氮胁迫下氧化胁迫；

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述应用的具体体现如下：

4.下述任一方法：

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

5.下述任一方法：

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达ZmAER蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述ZmAER蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“ZmAER蛋白的编码基因”是如下任一所述的DNA分子：

(D1)序列表的序列2所示的DNA分子；

8.ZmAER蛋白或其相关生物材料，或，权利要求4至7任一所述的方法在植物育种中的应用；

所述ZmAER蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述育种的目的是选育耐低氮能力高的植物。

10.如权利要求1至9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)双子叶植物或单子叶植物；

(C2)禾本科植物；

(C3)玉米。