CN110251607A - 一种缓解视力疲劳的中药复方制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供了一种缓解视力疲劳的中药复方制剂及其制备方法，该复方制剂是由原料枸杞、桑叶、蒺藜、菊花、山药，辅料蜂蜜、白砂糖、蔗糖、甜菊糖、乳糖、山梨酸钾、香精、糊精、淀粉、微粉硅胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、阿斯巴甜、硬脂酸镁和交联聚维酮制成口服液或片剂。本发明所述的复方制剂具有补肾健脾，平肝明目，减轻视疲劳的作用。适用于弱视者，如能较长时间服用，能显著改善眼疲劳症状且安全无副作用。

Description

一种缓解视力疲劳的中药复方制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及缓解视力疲劳的中药复方制剂及其制备方法。
背景技术
视疲劳，又称眼疲劳，是一种眼科常见病，能够引起眼干、眼涩、眼酸胀，视物模糊甚至视力下降。随着科技的发展和工作节奏的加快以及视频终端的大量普及，视疲劳的发病率呈逐渐上升的趋势，严重影响了患者的生活质量。
在日常生活中影响视力的因素复杂：(1)视力屈光异常因素导致远视、近视或散光问题；尤其在当前各类用眼过度或视力光线问题影响极易引发屈光不正问题。(2)晶状体浑浊影响。(3)眼角膜疾病影响。(4)眼部营养缺乏也对视觉产生一定的影响。
中医学早在古代即对视觉疲劳问题有着一定的研究记载，并按照病理因素划分为3种类型。(1)肝肾亏损：孙思邈曾对视觉疲劳描述为“其读书、博弈过度患目者，名日肝劳”称作“肝劳”。中医认为高度近视眼及其黄斑病变是以肝肾亏损为主要病机。(2)脾气虚弱：脾主运化，为气血生化之源，脾运健旺，眼部得到气血精气濡养，则目光有神；脾若失运，则目失所养而目昏。故脾气旺，则目亮。(3)心血亏虚：血主濡养，血将营养物质传送全身，包括眼部。目得血而能视，心血亏虚，目失濡养，则影响视力。所以心血足，则目有神。
现有技术中对于缓解视疲劳的药物多是西药滴眼液，副作用较大，治标不治本，且眼部敏感的部分人群使用不方便。
发明内容
本发明目的在于，为了解决现有技术中缓解视力疲劳的药物中存在的问题，提供了一种缓解视力疲劳的中药复方制剂及其制备方法，该复方制剂是由原料枸杞、桑叶、蒺藜、菊花、山药，辅料蜂蜜、白砂糖、蔗糖、甜菊糖、乳糖、山梨酸钾、香精、糊精、淀粉、微粉硅胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、阿斯巴甜、硬脂酸镁和交联聚维酮制成口服液或片剂。本发明所述的复方制剂具有补肾健脾，平肝明目，减轻视疲劳的作用。适用于弱视者，如能较长时间服用，能显著改善眼疲劳症状且安全无副作用。
本发明所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，该制剂是由原料枸杞220-260g、桑叶190-250g、蒺藜160-210g、菊花50-110g、山药140-180g，辅料蜂蜜100-160g、白砂糖100-160g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、山梨酸钾1-5g、香精2-10mL、糊精30-600g、淀粉30-600g、微粉硅胶5-30g、微晶纤维素30-600g、羧甲基纤维素钠5-30g、阿斯巴甜15-60g、硬脂酸镁5-30g和交联聚维酮10-90g制成口服液或片剂。
所述一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，该制剂是由原料枸杞230-250g、桑叶200-230g、蒺藜170-200g、菊花70-100g、山药150-170g，辅料蜂蜜120-150g、白砂糖120-150g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、山梨酸钾2-4g、香精6-8mL糊精100-500g、淀粉100-500g、微粉硅胶10-20g、微晶纤维素100-500g、羧甲基纤维素钠10-20g、阿斯巴甜20-50g、硬脂酸镁10-20g和交联聚维酮20-80g制成口服液或片剂。
所述一种缓解视力疲劳的中药复方制剂的制备方法，制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞220-260g、山药140-180g加入多功能提取罐，用浓度0-40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80-100℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶190-250g、菊花50-110g、蒺藜160-210g加入多功能提取罐，用体积浓度40-60％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70-90℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量2-5％的ZTC1+1天然澄清剂，静置2-5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，按常规制药方法即得口服液；
或将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，加入蜂蜜100-160g、白砂糖100-160g、香精2-10mL及山梨酸钾1-5g混合均匀，按常规制药方法即得口服液。
所述一种缓解视力疲劳的中药复方制剂的制备方法，制备1000g片剂，具体操作按下列步骤进行：
a、称取枸杞220-260g、山药140-180g加入多功能提取罐，用浓度0-40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80-100℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液；
b、称取桑叶190-250g、菊花50-110g、蒺藜160-210g加入多功能提取罐，用体积浓度40-60％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70-90℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液；
c、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上层药液浓缩后，加入原液质量2-5％的ZTC1+1天然澄清剂，静置2-5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
d、将步骤c得到的滤液浓缩至干膏，粉碎，过80目筛备用；
e、将步骤d得到的干膏粉末加入辅料糊精30-600g、淀粉30-600g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、微粉硅胶5-30g、微晶纤维素30-600g、羧甲基纤维素钠5-30g、阿斯巴甜15-60g、硬脂酸镁5-30g、交联聚维酮10-90g、香精2-6mL，再加浓度为70-90％乙醇制软材，过筛制粒，再将制得湿粒于温度40-50℃烘箱中干燥，过筛整粒，加润滑剂1-5％混合均匀，按常规方法压片即得。
本发明所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂具有补肾健脾，平肝明目，减轻视疲劳的功效。
本发明所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，该制剂中各组分性能如下：
枸杞子，本品为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实。夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干，除去果梗，或晾至皮皱后，晒干，除去果梗。性甘，平。归肝、肾经。可滋补肝肾，益精明目；用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，阳萎遗精，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。
桑叶，本品为桑科植物桑的干燥叶。初霜后采收，除去杂质，晒干。性甘、苦，寒。归肺、肝经。可疏散风热，清肺润燥，清肝明目；用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。
蒺藜，本品为蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，除去杂质。性辛、苦，微温；有小毒。归肝经。可平肝解郁，活血祛风，明目，止痒；用于头痛眩晕，胸胁胀痛，乳闭乳痈，目赤翳障，风疹瘙痒。
菊花，本品为菊科植物菊的干燥头状花序。9～11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干。性甘、苦，微寒。归肺、肝经。可散风清热，平肝明目，清热解毒；用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒。
山药，本品为薯蓣科植物薯蓣的干燥根茎。冬季茎叶枯萎后采挖，切去根头，洗净，除去外皮和须根，干燥，习称“毛山药片”；或除去外皮，趁鲜切厚片，干燥，称为“山药片”；也有选择肥大顺直的干燥山药，置清水中，浸至无干心，闷透，切齐两端，用木板搓成圆柱状，晒干，打光，习称“光山药”。性甘，平。归脾、肺、肾经。可补脾养胃，生津益肺，补肾涩精。用于脾虚食少，久泻不止，肺虚喘咳，肾虚遗精，带下，尿频，虚热消渴。
本发明所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，该制剂中枸杞子、桑叶、蒺藜、菊花等滋补肝肾、益精明目，山药健脾养胃、补肾涩精。通过补肾健脾，平肝明目的药物配合，既能减轻视疲劳，又能从根本上滋补肝肾。
附图说明
图1为本发明口服液对肌细胞凋亡的影响；
图2为本发明A673细胞凋亡变化图。
具体实施方式
制备口服液：
洗瓶干燥：取低硼硅玻璃瓶(规格10mL)、瓶塞一次用饮用水、纯化水洗净，然后将低硼硅玻璃瓶干热灭菌，瓶塞沸水煮灭菌30min，备用；
灌装、压塞：开启机器，调整灌装量为10mL/瓶，将半成品口服液在自动灌封机中灌装、压塞，并检查压塞的密封性；
灭菌：将灌装好的口服液高压蒸汽灭菌，温度115℃，时间30min；
灯检：剔除不合格样品，存放于有不合格标识的专用容器；
包装、成品检验、入库；
生产洁净要求：配液、过滤、灌装、压塞操作环境的要求达到三十万级洁净度。
实施例1
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞220g、山药140g加入多功能提取罐，用浓度0％无水乙醇作为提取溶剂，在温度80℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶190g、菊花50g、蒺藜160g加入多功能提取罐，用体积浓度40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量2％的ZTC1+1天然澄清剂，静置2-5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，按常规制药方法即得口服液。
实施例2
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞240g、山药160g加入多功能提取罐，用浓度10％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:14，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶220g、菊花80g、蒺藜180g加入多功能提取罐，用体积浓度50％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:14，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量3％的ZTC1+1天然澄清剂，静置3h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，按常规制药方法即得口服液。
实施例3
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞260g、山药180g加入多功能提取罐，用浓度30％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度100℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶250g、菊花110g、蒺藜210g加入多功能提取罐，用体积浓度60％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量4％的ZTC1+1天然澄清剂，静置5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，按常规制药方法即得口服液。
实施例4
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞250g、山药150g加入多功能提取罐，用浓度40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度85℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶200g、菊花90g、蒺藜200g加入多功能提取罐，用体积浓度60％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清药液浓缩后，加入原液质量5％的ZTC1+1天然澄清剂，静置2h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，加入蜂蜜100g、白砂糖100g、香精2mL及山梨酸钾1g混合均匀，按常规制药方法即得口服液。
实施例5
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞220g、山药170g加入多功能提取罐，用浓度0％无水乙醇作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:13，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶220g、菊花100g、蒺藜200g加入多功能提取罐，用体积浓度45％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度75℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:13，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量4％的ZTC1+1天然澄清剂，静置4h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，加入蜂蜜140g、白砂糖140g、香精5mL及山梨酸钾3g混合均匀，按常规制药方法即得口服液。
实施例6
制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞260g、山药140g加入多功能提取罐，用浓度20％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度100℃下热回流提取3次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶250g、菊花110g、蒺藜210g加入多功能提取罐，用体积浓度50％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量5％的ZTC1+1天然澄清剂，静置5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，加入蜂蜜160g、白砂糖160g、香精10mL及山梨酸钾5g混合均匀，按常规制药方法即得口服液。
实施例7
制备1000g片剂，具体操作按下列步骤进行：
a、称取枸杞220g、山药180g采用多功能提取罐进行热回流提取，用浓度0％无水乙醇作为提取溶剂，在温度80℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
b、称取桑叶190g、菊花110g、蒺藜210g用体积浓度40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70℃下热回流提取2次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:12，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量2％的ZTC1+1天然澄清剂，静置2h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
d、将步骤c得到的滤液浓缩至干膏，粉碎，过80目筛备用；
e、将步骤d得到的干膏粉末加入辅料糊精30g、淀粉30g、蔗糖30g、甜菊糖15g、乳糖30g、微粉硅胶5g、微晶纤维素30g、羧甲基纤维素钠5g、阿斯巴甜15g、硬脂酸镁5g、交联聚维酮10g、香精2mL，再加浓度为70％乙醇制软材，过筛制粒，再将制得湿粒于温度40℃烘箱中干燥，过筛整粒，加润滑剂1％混合均匀，按常规方法压片即得。
实施例8
制备1000g片剂，具体操作按下列步骤进行：
a、称取枸杞240g、山药160g加入多功能提取罐，用浓度20％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:14，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
b、称取桑叶180g、菊花80g、蒺藜180g用体积浓度50％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80℃下热回流提取3次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:14，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上清液浓缩后，加入原液质量5％的ZTC1+1天然澄清剂，静置5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
d、将步骤c得到的滤液浓缩至干膏，粉碎，过80目筛备用；
e、将步骤d得到的干膏粉末加入辅料糊精200g、淀粉200g、蔗糖200g、甜菊糖30g、乳糖200g、微粉硅胶20g、微晶纤维素200g、羧甲基纤维素钠20g、阿斯巴甜30g、硬脂酸镁15g、交联聚维酮50g、香精6mL，再加浓度为90％乙醇制软材，过筛制粒，再将制得湿粒于温度50℃烘箱中干燥，过筛整粒，加润滑剂3％混合均匀，按常规方法压片即得。
实施例9
制备1000g片剂，具体操作按下列步骤进行：
a、称取枸杞260g、山药140g加入多功能提取罐，用浓度40％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度100℃下热回流提取3次，每次1h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
b、称取桑叶250g、菊花50g、蒺藜160g用体积浓度60％乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度90℃下热回流提取2次，每次2h，原料与提取液的质量比为1:16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上层药液浓缩后，加入原液质量4％的ZTC1+1天然澄清剂，静置4h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
d、将步骤c得到的滤液浓缩至干膏，粉碎，过80目筛备用；
e、将步骤d得到的干膏粉末加入辅料糊精600g、淀粉600g、蔗糖600g、甜菊糖60g、乳糖600g、微粉硅胶30g、微晶纤维素600g、羧甲基纤维素钠30g、阿斯巴甜60g、硬脂酸镁30g、交联聚维酮90g、香精5mL，再加浓度为80％乙醇制软材，过筛制粒，再将制得湿粒于温度40-50℃烘箱中干燥，过筛整粒，加润滑剂5％混合均匀，按常规方法压片即得。
实施例10
将实施例1-9所制得的任意一种缓解视力疲劳的中药复方制剂进行效果实验：
急性毒性试验：
KM小鼠，新疆实验动物研究中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2016-0001，使用许可证号：SYXK(新)2014-0002；
最大耐受量试验(MTD)：选取健康小鼠20只，雌雄各半，体重22.4±1.1g，禁食24小时，将复方制剂口服液浓缩至可以灌胃的最大浓度，以最大浓度按0.2ml/10g灌胃，早、晚各灌胃一次，连续观察14天，结果受试小鼠精神与活动状态无异常，亦无死亡；实验结束时小鼠平均体重为32.1±2.1g，经过解剖，小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见异常；故复方制剂口服液的最大耐受量为36.7g/kg；小鼠ig给药的MTD为36.7g/kg，相当于成人(体重按70kg计)每天用量的16.2倍，提示本制剂无明显毒性，用药安全；
药效试验：
1.体内药效试验：
1.1实验方法：
1.1.1动物分组及给药：
选取90只ICR小鼠按体重随机分为正常组，阴性对照组，诺迪康组，复方制剂口服液水提取/乙醇提取物低、中、高剂量组，每组均为10只；正常组不做处理，阴性对照组以0.2ml/10g的蒸馏水灌胃，诺迪康组以0.28g/kg的诺迪康灌胃，复方制剂口服液水提取物低、中、高剂量组分别以0.1082、0.541和1.082g/kg的组合物灌胃，复方制剂口服液乙醇提取物低、中、高剂量组分别以0.0861、0.4305和0.861g/kg的组合物灌胃，1次/天，连续灌胃14天；所有药物均以蒸馏水混悬，给药期间每隔2d称取小鼠体重；
1.1.2疲劳转棒检测：
在阴性对照组、诺迪康组和复方制剂口服液给药组等各组ICR小鼠灌胃第13天开始疲劳转棒检测，给药30min后，除正常组外，将其余各组小鼠置于疲劳转棒仪上以20rpm训练3min，然后仍以20rpm的转速检测小鼠掉落时间，即为疲劳潜伏期(s)；
1.1.3负重游泳检测：
小鼠末次灌胃30min后，除正常组外，其余小鼠均在距尾根部1cm处负荷5％体重的铅皮，然后将小鼠置于体积为37×37×50cm，水深40cm，水温为25±1℃的游泳箱中游泳；放于水中后立即计时，至小鼠头部没入水面10s不能浮出，即为小鼠力竭时间(min)；
1.1.4复方制剂对小鼠心脏、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏质量的影响：
负重游泳检测完成并摘眼球取血后，小鼠脱劲处死，常规解剖取小鼠心脏、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏，计算脏体比值；
1.1.5复方制剂对小鼠相关生化指标的影响：
负重游泳检测完成后，小鼠休息30min后摘眼球取血，置于肝素钠抗凝管和非抗凝管。肝素钠抗凝血用于测定血红蛋白，然后其余血样以3500rpm离心10min，分离血清或血浆，测定LD、LDH、ROS、SOD、MDA、睾酮、皮质酮、BUN。取完血后的小鼠，取肝脏和腓肠肌经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏、肌肉，测定肝脏中的肝糖原及肌肉组织中的肌糖原、CK、LDH、MDH、SDH；
1.1.6复方制剂对小鼠肌肉组织细胞凋亡的影响：
称取肌肉组织0.1g，加入400μl细胞裂解液，充分混匀后再加蛋白酶K 100μl，置温度65℃水浴消化2小时或过夜，再依次加入75μl 8mol/L的醋酸钾，温度4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中，然后加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置温度-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；加1ml70％乙醇，混匀，10000r/min离心5min，去上清；根据DNA沉淀的大小，加入一定量的蒸馏水或TE，温度37℃溶解，测定DNA浓度后以2％琼脂糖凝胶电泳80V 2小时，于凝胶成像系统下拍照；
1.1.7复方制剂对小鼠肌肉相关基因转录水平的影响：
称取肌肉组织0.1g，利用Trizol法提取肌肉组织中RNA，电泳验证RNA的完整性；通过TAKARA公司的AMV反转录试剂盒进行反转录反应；使用QIAquickPCR Purification Kit进行cDNA纯化；将纯化cDNA按1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍和1/32倍浓度做梯度稀释，使用Green qPCR SuperMix-UDG试剂(invitrogen)进行Realtime PCR(Bio-Rad CFX96)生成MDH、LDH、SDH、AMPK、PGC-1α、PFK-1、Nrf2、Keap1、CYP11A1、CYP17A1、CYP11B1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、P53等基因的标准曲线；定量表达结果依据CT数值，根据2'-ΔΔCt法，计算其相对表达量；2-ΔΔC T＝[(CT gene of interest–CT internalcontrol)]sampleA-[(CT gene of interest–CT internal control)]sampleB；
1.2结果与分析：
1.2.1对小鼠体重的影响：
由表1可知，与正常组和阴性对照组比较，诺迪康和复方制口服液剂灌胃给药后0d、3d、6d、9d、12d和14d，小鼠体重无显著性差异(p＞0.05)；
表1小鼠体重变化(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
1.2.2对小鼠心脏、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏质量的影响：
由表2可知，与正常组和阴性对照组比较，诺迪康和复方制剂口服液连续灌胃给药14d后，小鼠心脏指数、肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数和胸腺指数均无显著性差异(p＞0.05)；
表2小鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胸腺指数(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
1.2.3对小鼠疲劳转棒和负重游泳力竭时间的影响：
由表3可知，与阴性对照组比较，复方制剂口服液水提物、醇提物和诺迪康给药组均可显著性延长小鼠负重游泳时间及疲劳转棒时间；
表3小鼠负重游泳和疲劳转棒时间(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
1.2.4对小鼠血清(浆)中Hb、LD、LDH、ROS、SOD、MDA、T/C、BUN、CK等的影响：
由表4可知，与正常组比较，阴性对照组小鼠经负重游泳后，其血红蛋白(Hb)、超氧化物歧化酶(SOD)、睾酮/皮质酮(T/C)比例、肌酸激酶(CK)等含量(活性)明显降低，而乳酸(LD)、活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和血浆尿素氮(BUN)含量显著升高。与阴性对照组比较，复方制剂口服液水提物和醇提物给药组小鼠Hb、SOD、T/C、CK等显著升高，LD、ROS、LDH、MDA和BUN明显降低；
表4复方制剂口服液对小鼠血清(浆)生化指标的影响(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
1.2.5对小鼠组织中CK、肝糖原、肌糖原、LD、LDH、MDH和SDH等的影响：
由表5可知，与正常组比较，阴性对照组小鼠经负重游泳后，其肌肉组织中CK、肌糖原、SDH、MDH和肝糖原等降低，而LD含量升高，但LDH活性无明显变化；与阴性对照组比较，复方制剂口服液和诺迪康给药组均能使小鼠肌肉组织中CK、肌糖原、SDH、MDH和肝糖原升高，LD明显降低。
表5复方制剂口服液对小鼠血清(浆)生化指标的影响(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。
1.2.6复方制剂口服液水提物对小鼠肌肉细胞凋亡的影响：
提取的腓肠肌基因组DNA经2％琼脂糖凝胶电泳后，正常组细胞基因组DNA较为完整，而阴性对照组泳道出现大小不一的阶梯状DNA，分子量在200bp-200n bp；经不同浓度的缓解视力疲劳的中药复方制剂口服液作用后，其阶梯状DNA逐渐减少，尤以水提物中剂量作用最为明显；这表明，缓解视力疲劳的中药复方制剂口服液水提物对运动损伤的肌细胞凋亡具有抑制作用(图1)；
1.2.7复方制剂口服液水提物对小鼠肌肉组织相关基因mRNA转录水平的影响：
由表6中数据分析可知，与阴性对照组比较，小鼠诺迪康和缓解视力疲劳的中药复方制剂口服液水提取物灌胃给药后，其肌肉组织Bax、cleaved caspase-3、P53、CYP11B和LDH等基因转录水平显著下调；而Bcl-2、Keap1、Bach、Nrf2、PGC-1α、PFK-1、CYP17A1、CYP11A1、MDH和SDH等基因水平明显升高；
表6复方制剂口服液对小鼠肌肉组织相关基因转录的影响(n＝10)
注：与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
2.体外药效试验：
2.1实验方法：
2.1.1A-673细胞的培养：
将A-673细胞以5×105个/ml接种于含10％胎牛血清、1.5g/L的NaHCO3、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基中，置于37℃，体积分数5％的CO2培养箱中培养，每隔3天换一次液；
2.1.2细胞氧化损伤模型建立及细胞给药：
当培养瓶中A-673细胞融合率达到80％左右时，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMIDMEM培养基吹打下来，调节细胞密度至5×104个/ml，以100μl/孔铺至96孔培养板，培养48h后分组给药，分别设定：正常对照组，模型组，阳性药组，复方制剂低、中、高剂量组；模型组用400μM/L的H2O2诱导；阳性药为4.3mg/L(10μM/L)的Vitmin E溶液；复方制剂给药浓度为：10、100、1000mg/L；各给药组作用24h后，加入MTT，继续培养4h，吸弃培养液，加入DMSO震荡溶解后，于Multiskan Go 1510酶标仪测定490nm处吸光度值；
2.1.3对细胞LDH、ROS、MDA、SOD的影响：
细胞给药处理后，收集细胞培养上清液，参照试剂盒说明书测定培养液中LDH酶活性、ROS含量、MDA含量和SOD活性；
2.1.4数据处理：数据均以表示，利用SPSS17.0统计软件处理，用one-wayANOVA进行组间比较；
2.2结果与分析：
2.2.1对细胞LDH、ROS、MDA、SOD的影响：
由表7可知，A-673细胞经400μM/L的H2O2诱导24h后，细胞LDH、ROS和MDA明显升高，SOD活性降低；而复方制剂和vit E作用后细胞LDH、ROS和MDA显著降低，SOD活性明显升高；
表7 A-673细胞上清液中LDH、SOD活性和ROS、MDA含量
注：与正常组比较，△P﹤0.05，△△P﹤0.01；与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；
2.2.2对细胞凋亡的影响：
由表8和图2可知，A-673细胞经400μM/L的H2O2诱导24h后，早期细胞凋亡比率较正常组升高，而组合物和vit E作用后细胞早期细胞凋亡比率较阴性对照组显著降低；
A.正常 B.阴性 C.vit E D.10mg/L组合物 E.100mg/L组合物 F.1000mg/L组合物；
表8 A673细胞凋亡变化
注：与正常组比较，△P﹤0.05，△△P﹤0.01；与阴性对照组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

Claims (4)

1.一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，其特征在于该制剂是由原料枸杞220-260g、桑叶190-250g、蒺藜160-210g、菊花50-110g、山药140-180g，辅料蜂蜜100-160g、白砂糖100-160g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、山梨酸钾1-5g、香精2-10mL、糊精30-600g、淀粉30-600g、微粉硅胶5-30g、微晶纤维素30-600g、羧甲基纤维素钠5-30g、阿斯巴甜15-60g、硬脂酸镁5-30g和交联聚维酮10-90g制成口服液或片剂。
2.根据权利要求1所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂，其特征在于该制剂是由原料枸杞230-250g、 桑叶200-230g、蒺藜170-200g、菊花70-100g、山药150-170g，辅料蜂蜜120-150g、白砂糖120-150g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、山梨酸钾2-4g、香精6-8mL糊精100-500g、淀粉100-500g、微粉硅胶10-20g、微晶纤维素100-500g、羧甲基纤维素钠10-20g、阿斯巴甜20-50g、硬脂酸镁10-20g和交联聚维酮20-80g制成口服液或片剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂的制备方法，其特征在于制备1000ml口服液，具体操作按下列步骤进行：
a、将所需药材拣除杂质，清洗晾干后备用；
b、称取枸杞220-260g、山药140-180g加入多功能提取罐，用浓度0-40%乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80-100℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16， 用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、称取桑叶190-250g、菊花50-110g、蒺藜160-210g加入多功能提取罐，用体积浓度40-60%乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70-90℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
d、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上层药液浓缩后，加入原液质量2-5%的ZTC1+1天然澄清剂，静置2-5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
e、将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，按常规制药方法即得口服液；
或将步骤d得到的滤液浓缩至干膏，粉碎后用纯化水溶解至含生药量8.8g/10mL，加入蜂蜜100-160g、白砂糖100-160g、香精2-10mL及山梨酸钾1-5g混合均匀，按常规制药方法即得口服液。
4.根据权利要求1或2所述的一种缓解视力疲劳的中药复方制剂的制备方法，其特征在于制备1000g片剂，具体操作按下列步骤进行：
a、称取枸杞220-260g、山药140-180g加入多功能提取罐，用浓度0-40%乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度80-100℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16， 用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
b、称取桑叶190-250g、菊花50-110g、蒺藜160-210g加入多功能提取罐，用体积浓度40-60%乙醇水溶液作为提取溶剂，在温度70-90℃下热回流提取2-3次，每次1-2h，原料与提取液的质量比为1:12-16，用180目尼龙布过滤，得到提取液，备用；
c、将步骤b和步骤c的滤液合并，静置24h，用板框压滤机过滤后留取上清液，将上层药液浓缩后，加入原液质量2-5%的ZTC1+1天然澄清剂，静置2-5h待分层后，用板框压滤机再次过滤；
d、将步骤c得到的滤液浓缩至干膏，粉碎，过80目筛备用；
e、将步骤d得到的干膏粉末加入辅料糊精30-600g、淀粉30-600g、蔗糖30-600g、甜菊糖15-60g、乳糖30-600g、微粉硅胶5-30g、微晶纤维素30-600g、羧甲基纤维素钠5-30g、阿斯巴甜15-60g、硬脂酸镁5-30g、交联聚维酮10-90g、香精2-6mL，再加浓度为70-90%乙醇制软材，过筛制粒，再将制得湿粒于温度40-50℃烘箱中干燥，过筛整粒，加润滑剂1-5%混合均匀，按常规方法压片即得。
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姜凤春: "湿热眼病证治体会", 《江西中医药》 *

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