CN110241027A - 一种球等鞭金藻的保存方法 - Google Patents

一种球等鞭金藻的保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种球等鞭金藻的保存方法，属于微藻培养技术领域，所述方法包括以下步骤：1)用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期获得球等鞭金藻培养液；2)向步骤1)中所述的球等鞭金藻培养液中加入氯化铁进行絮凝，获得絮凝的球等鞭金藻细胞；3)收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存；步骤1)中所述混合抗冻剂包括二甲亚砜和甲醇。利用本发明所述方法保存球等鞭金藻，在常温保存一年后，所述球等鞭金藻细胞的存活率能够达92％，远远大于常规的保藏方法的细胞存活率。

Description

一种球等鞭金藻的保存方法
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，尤其涉及一种球等鞭金藻的保存方法。
背景技术
球等鞭金藻属于金藻门，金藻纲，等鞭金藻目，等鞭金藻科，等鞭金藻属的单细胞海洋浮游藻类生物，为海洋动物幼虫很好的开口饵料，被广泛用作水产经济软体动物幼虫基础饵料。球等鞭金藻含有较多胡萝卜素、叶黄素，因而呈褐黄色，是单细胞生活的个体，没有由纤维素和果胶组成的细胞壁，大多数呈楠圆形，幼细胞有一略呈扁平的背腹面，故侧面观为长椭圆形或长方形，因细胞前端生出两条等长的尾鞭形鞭毛，得名球等鞭金藻。
微藻的浓缩是采用高速离心机、超滤膜等物理方法或采用化学试剂进行絮凝的化学方法将新鲜培养的低浓度藻液浓缩成高浓度的藻泥或藻膏。微藻在水产养殖中的重要性日益突显，研究开发微藻的保存技术也越来越受到重视。微藻浓缩冻干是将藻液置于低温条件下制成冻干粉，并在过程中加入各种抗冻剂等的多种处理方法，最终冻干粉在常温保存一定时间后，使藻细胞尽可能的拥有较高的存活率并保持原有的营养物质含量不变，更加有利于各种研究的进行和微藻的商业性开发利用。
但是目前的对于球等鞭金藻的保存方法，保存时间短，长时间保存后的细胞存活率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种球等鞭金藻的保存方法，所述保存方法能够对球等鞭金藻进行长期保存，且长期保存后的球等鞭金藻细胞的存活率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种球等鞭金藻的保存方法，包括以下步骤：
1)用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期获得球等鞭金藻培养液；
2)向步骤1)中所述的球等鞭金藻培养液中加入氯化铁进行絮凝，获得絮凝的球等鞭金藻细胞；
3)收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存；
步骤1)中所述混合抗冻剂包括二甲亚砜和甲醇。
优选的，所述二甲亚砜在所述f/2培养基中的质量百分含量为8％～12％。
优选的，所述甲醇在所述f/2培养基中的质量百分含量为8％～12％。
优选的，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为60～200mg/L。
优选的，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为80～180mg/L。
优选的，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为160mg/L。
优选的，步骤2)中所述絮凝的时间为25～35min。
优选的，步骤1)中所述培养的温度为24～27℃，光照强度为3000～4000Lux，所述光照的光暗周期为12h:12h。
优选的，步骤1)中所述培养的盐度为28～32。
优选的，步骤2)中所述密封保存的容器为安瓿管。
本发明的有益效果：本发明提供的球等鞭金藻的保存方法，用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期后，向其中加入氯化铁进行絮凝，收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存。本发明通过在培养基中添加特定的混合抗冻剂二甲基亚砜和甲醇，能够提高球等鞭金藻细胞在后续冻干过程中的抗冻性能；在所述球等鞭金藻的对数期利用氯化铁进行絮凝，絮凝效率高达93％以上，絮凝时间短；根据本发明实施例的记载，利用本发明所述方法保存球等鞭金藻，在常温保存一年后，所述球等鞭金藻细胞的存活率能够达92％，远远大于常规的保藏方法的细胞存活率。
具体实施方式
本发明提供了一种球等鞭金藻的保存方法，包括以下步骤：1)用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期获得球等鞭金藻培养液；2)向步骤1)中所述的球等鞭金藻培养液中加入氯化铁进行絮凝，获得絮凝的球等鞭金藻细胞；3)收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存；步骤1)中所述混合抗冻剂包括二甲亚砜和甲醇。
本发明用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期获得球等鞭金藻培养液。在本发明中，所述混合抗冻剂包括二甲亚砜和甲醇；所述二甲亚砜在所述f/2培养基中的质量百分含量优选为8％～12％，更优选为10％；所述甲醇在所述f/2培养基中的质量百分含量优选为8％～12％，更优选为10％。在本发明的一个具体实施过程中，所述f/2培养基中包括10wt％的二甲基亚砜和10wt％的甲醇。在本发明中，所述f/2培养基以1L计，优选的包括以下组分：NaNO375mg，NaSiO3·9H2O 40mg，NaH2PO42H2O 4.4mg、微量元素溶液1mL、维生素溶液1mL和余量的灭菌海水。其中，所述的微量元素溶液以1L计，优选的包括以下组分：CuSO4·5H2O 10mg、ZnSO4·7H2O23mg、CoCl·6H2O 12mg、MnCl·4H2O 178mg、NaMoO4·2H2O 7.3mg、NaEDTA4.35mg、FeCl3·6H2O 3.9mg和余量的纯水；所述维生素溶液以1L计，优选的包括以下组分：B10.5mg、B120.5mg和余量的纯水。在本发明中，所述灭菌海水优选的通过将海水沙滤、沉淀、脱脂棉筛绪过滤后高压消毒获得，所述海水的盐度优选为28‰～32‰，所述海水的pH值优选为7.8～8.1。在本发明中，所述球等鞭金藻优选的来源于中国科学院淡水藻种库，所述球等鞭金藻的编号为FACHB-861。在本发明中，所述球等鞭金藻的接种量优选为5％～15％，更优选为10％。在本发明所述的培养过程中，所述培养的温度优选为24～27℃，更优选为25～26℃，所述培养的光照强度优选为3000～4000Lux，更优选为3500Lux，所述光照的光暗周期优选为12h:12h；在本发明所述培养过程中，优选的使用气石进行通气培养，所述气石与增气泵连接，所述增气泵优选为50W小型增气泵。本发明所述培养指对数期后获得的球等鞭金藻培养液中球等鞭金藻的细胞浓度优选为1×108～1×1010个/mL，最优为1×1010个/mL。
本发明在获得所述球等鞭金藻培养液后，向所述的球等鞭金藻培养液中加入氯化铁进行絮凝，获得絮凝的球等鞭金藻细胞。在本发明中，加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度优选为60～200mg/L，更优选为80～180mg/L，最优选为160mg/L。在加入本发明上述浓度的氯化铁后，所述球等鞭金藻细胞能够快速高效絮凝；在所述絮凝后，上清液的OD值优选的在0.05以下。
本发明在获得所述球等鞭金藻细胞后，收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存。在本发明中，收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞优选的采用过滤的方法。本发明将收集到的球等鞭金藻细胞进行冷冻干燥，本发明对所述冷冻干燥的步骤和参数没有特殊要求，采用本领域常规的冷冻干燥步骤和参数即可。在本发明中，所述密封保存优选的通过安瓿管实现；本发明优选的在收集到所述球等鞭金藻后，置于安瓿管中进行冷冻干燥，所述冷冻干燥后直接将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。本发明中，所述保存的温度优选为10～40℃；所述保存的时间优选的大于等一年。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
f/2培养基：NaNO375mg，NaSiO3·9H2O 40mg，NaH2PO4·2H2O 4.4mg、微量元素溶液1mL、维生素溶液1mL和余量灭菌海水，总体积1L。
微量元素溶液配方：CuSO4·5H2O 10mg、ZnSO4·7H2O 23mg、CoCl·6H2O12mg、MnCl·4H2O 178mg、NaMoO4·2H2O 7.3mg、NaEDTA 4.35mg、FeCl3·6H2O 3.9mg和余量纯水，总体积1L；
维生素溶液配方：B10.5mg、B120.5mg和余量纯水，总体积1L。
海水经过沙滤、沉淀、脱脂棉筛绪过滤后高压消毒后备用。灭菌海水的盐度为28‰～33‰，灭菌海水的pH值为7.8～8.1。
f/2培养基中添加10wt％二甲基亚砜和10wt％的甲醇。
氯化铁(FeCl3·6H2O)母液的配置：用电子天平准确称取0.5g的氯化铁，用灭菌海水溶解于10mL的容量瓶中，定容置10mL，作为母液待用。
步骤：
(1)将球等鞭金藻(中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-861)使用包括混合抗冻剂的f/2培养基培养，以10％的比例接种，用3000mL三角锥形瓶培养于光照培养架上，培养条件为：温度24～27℃，光强为3500Lux，盐度为28～32，光暗周期为12h:12h，锥形瓶中用气石通气培养。
(2)取培养处于对数生长期的球等鞭藻液，分别分装于300mL三角锥形瓶中，并加入160mg/L终浓度的氯化铁絮凝剂，30min即可使藻液的OD值接近于0.05，且絮凝效率高达93％以上。
(3)收集絮凝的球等鞭金藻细胞后，分装于安瓿管进行-80℃预冻1～2h，将预冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，冷冻干燥3h。最后将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封，在25℃下保存一年。
用灭菌后的海水将保存一年后的球等鞭金藻稀释到与鲜藻的浓度相近；进行接种培养，以培养至对数末期的新鲜藻液为对照组，采用FDA染色方法进行存活率的测定。处理组设置4组平行，处理组的荧光值如下：0.41、0.40、0.42、0.43；对照组的平均荧光值：0.45。细胞相对存活率(％)＝(处理组的荧光值的平均值/对照组的荧光值的平均值)×100％
最终结果显示，球等鞭金藻在常温保存一年后，其藻细胞存活率达92％。
实施例2
f/2培养基：NaNO375mg，NaSiO3·9H2O 40mg，NaH2PO4·2H2O 4.4mg、微量元素溶液1mL、维生素溶液1mL和余量灭菌海水，总体积1L。
微量元素溶液配方：CuSO4·5H2O 10mg、ZnSO4·7H2O 23mg、CoCl·6H2O12mg、MnCl·4H2O 178mg、NaMoO4·2H2O 7.3mg、NaEDTA 4.35mg、FeCl3·6H2O 3.9mg和余量纯水，总体积1L；
维生素溶液配方：B10.5mg、B120.5mg和余量纯水，总体积1L。
海水经过沙滤、沉淀、脱脂棉筛绪过滤后高压消毒后备用。灭菌海水的盐度为28‰～33‰，灭菌海水的pH值为7.8～8.1。
f/2培养基中添加10wt％二甲基亚砜和10wt％的甲醇。
氯化铁(FeCl3·6H2O)母液的配置：用电子天平准确称取0.5g的氯化铁，用灭菌海水溶解于10mL的容量瓶中，定容置10mL，作为母液待用。
步骤：
(1)将球等鞭金藻(中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-861)使用包括混合抗冻剂的f/2培养基培养，以10％的比例接种，用3000mL三角锥形瓶培养于光照培养架上，培养条件为：温度24～27℃，光强为3500Lux，盐度为28～32，光暗周期为12h:12h，锥形瓶中用气石通气培养。
(2)取培养处于对数生长期的球等鞭藻液，分别分装于300mL三角锥形瓶中，并加入80mg/L终浓度的氯化铁絮凝剂，35min即可使藻液的OD值接近于0.06，且絮凝效率高达91％以上。
(3)收集絮凝的球等鞭金藻细胞后，分装于安瓿管进行-80℃预冻1～2h，将预冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，冷冻干燥3h。最后将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封，在25℃下保存一年。
用灭菌后的海水将保存一年后的球等鞭金藻稀释到与鲜藻的浓度相近；进行接种培养，以培养至对数末期的新鲜藻液为对照组，采用FDA染色方法进行存活率的测定。处理组设置4组平行，处理组的荧光值如下：0.40、0.39、0.38、0.41；对照组的平均荧光值：0.44。细胞相对存活率(％)＝(处理组的荧光值的平均值/对照组的荧光值的平均值)×100％
最终结果显示，球等鞭金藻在常温保存一年后，其藻细胞存活率达90％。
实施例3
f/2培养基：NaNO375mg，NaSiO3·9H2O 40mg，NaH2PO4·2H2O 4.4mg、微量元素溶液1mL、维生素溶液1mL和余量灭菌海水，总体积1L。
微量元素溶液配方：CuSO4·5H2O 10mg、ZnSO4·7H2O 23mg、CoCl·6H2O12mg、MnCl·4H2O 178mg、NaMoO4·2H2O 7.3mg、NaEDTA 4.35mg、FeCl3·6H2O 3.9mg和余量纯水，总体积1L；
维生素溶液配方：B10.5mg、B120.5mg和余量纯水，总体积1L。
海水经过沙滤、沉淀、脱脂棉筛绪过滤后高压消毒后备用。灭菌海水的盐度为28‰～33‰，灭菌海水的pH值为7.8～8.1。
f/2培养基中添加10wt％二甲基亚砜和10wt％的甲醇。
氯化铁(FeCl3·6H2O)母液的配置：用电子天平准确称取0.5g的氯化铁，用灭菌海水溶解于10mL的容量瓶中，定容置10mL，作为母液待用。
步骤：
(1)将球等鞭金藻(中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-861)使用包括混合抗冻剂的f/2培养基培养，以10％的比例接种，用3000mL三角锥形瓶培养于光照培养架上，培养条件为：温度24～27℃，光强为3500Lux，盐度为28～32，光暗周期为12h:12h，锥形瓶中用气石通气培养。
(2)取培养处于对数生长期的球等鞭藻液，分别分装于300mL三角锥形瓶中，并加入60mg/L终浓度的氯化铁絮凝剂，40min即可使藻液的OD值接近于0.07，且絮凝效率高达89％以上。
(3)收集絮凝的球等鞭金藻细胞后，分装于安瓿管进行-80℃预冻1～2h，将预冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，冷冻干燥3h。最后将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封，在25℃下保存一年。
用灭菌后的海水将保存一年后的球等鞭金藻稀释到与鲜藻的浓度相近；进行接种培养，以培养至对数末期的新鲜藻液为对照组，采用FDA染色方法进行存活率的测定。处理组设置4组平行，处理组的荧光值如下：0.44、0.43、0.39、0.34；对照组的平均荧光值：0.46。细胞相对存活率(％)＝(处理组的荧光值的平均值/对照组的荧光值的平均值)×100％
最终结果显示，球等鞭金藻在常温保存一年后，其藻细胞存活率达87％。
对比例1
f/2培养基：NaNO375mg，NaSiO3·9H2O 40mg，NaH2PO4·2H2O 4.4mg、微量元素溶液1mL、维生素溶液1mL和余量灭菌海水，总体积1L。
微量元素溶液配方：CuSO4·5H2O 10mg、ZnSO4·7H2O 23mg、CoCl·6H2O12mg、MnCl·4H2O 178mg、NaMoO4·2H2O 7.3mg、NaEDTA 4.35mg、FeCl3·6H2O 3.9mg和余量纯水，总体积1L；
维生素溶液配方：B10.5mg、B120.5mg和余量纯水，总体积1L。
海水经过沙滤、沉淀、脱脂棉筛绪过滤后高压消毒后备用。灭菌海水的盐度为28‰～33‰，灭菌海水的pH值为7.8～8.1。
步骤：
(1)将球等鞭金藻(中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-861)使用f/2培养基培养，以10％的比例接种，用3000mL三角锥形瓶培养于光照培养架上，培养条件为：温度24～27℃，光强为3500Lux，盐度为28～32，光暗周期为12h:12h，锥形瓶中用气石通气培养。
(2)取培养处于对数生长期的球等鞭藻液，分装于安瓿管，加入抗冻剂脱脂牛奶；进行-80℃预冻1～2h，将预冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，冷冻干燥3h。最后将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封，在-20℃下保存一年。
用灭菌后的海水将保存一年后的球等鞭金藻稀释到与鲜藻的浓度相近；进行接种培养，以培养至对数末期的新鲜藻液为对照组，采用FDA染色方法进行存活率的测定。处理组设置4组平行，处理组的荧光值如下：0.18、0.19、0.17、0.16；对照组的平均荧光值：0.41。细胞相对存活率(％)＝(处理组的荧光值的平均值/对照组的荧光值的平均值)×100％
最终结果显示，球等鞭金藻在-20℃保存一年后，其藻细胞存活率为43％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种球等鞭金藻的保存方法，包括以下步骤：
1)用含混合抗冻剂的f/2培养基培养球等鞭金藻至对数生长期获得球等鞭金藻培养液；
2)向步骤1)中所述的球等鞭金藻培养液中加入氯化铁进行絮凝，获得絮凝的球等鞭金藻细胞；
3)收集所述絮凝的球等鞭金藻细胞，冷冻干燥后，密封保存；
步骤1)中所述混合抗冻剂包括二甲亚砜和甲醇。
2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述二甲亚砜在所述f/2培养基中的质量百分含量为8％～12％。
3.根据权利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，所述甲醇在所述f/2培养基中的质量百分含量为8％～12％。
4.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为60～200mg/L。
5.根据权利要求4所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为80～180mg/L。
6.根据权利要求4或5所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中加入的氯化铁在所述球等鞭金藻培养液中的终浓度为160mg/L。
7.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中所述絮凝的时间为25～35min。
8.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的温度为24～27℃，光照强度为3000～4000Lux，所述光照的光暗周期为12h:12h。
9.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的盐度为28～32。
10.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中所述密封保存的容器为安瓿管。
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