CN110240624B

CN110240624B - 一种雄甾烷衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110240624B
Application number: CN201910706129.7A
Authority: CN
Inventors: 魏增泉; 李宝齐; 郭嘉林; 刘登科; 孔凯; 董凯; 姚小青
Original assignee: Tianjin Chase Sun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tianjin Chase Sun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2039-08-01
Also published as: CN110240624A

Abstract

本发明提供了一种雄甾烷衍生物及其制备方法与应用，属于医药技术领域。本发明提供的雄甾烷衍生物对Hedgehog信号通路具有非常好的抑制作用，从而为慢性髓性白血病患者提供一种有效的治疗药物。实施例的结果表明，使用小鼠[s12]和人[MZ24]Gli报告细胞系测得的本发明的雄甾烷衍生物的抑制Hedgehog途径信号传导的平均IC50值为0.020uM，而现有经FDA批准的Hedgehog通路抑制剂的平均IC50值为0.022uM，说明本发明提供的雄甾烷衍生物不但具有Hedgehog途径信号抑制作用，而且达到了与Vismodegib相当的效果。

Description

一种雄甾烷衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种雄甾烷衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

分子靶向抗肿瘤药物的研究是当前抗肿瘤药物研究领域的主要潮流和趋势。近年来，靶向Hedgehog(Hh)信号通路的抗肿瘤药物成为这一领域新的研究热点。Hedgehog(Hh)信号通路在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，与人类约1/3的肿瘤有着密切的联系。异常激活Hh信号传导，将导致髓母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生。Hedgehog是在研究果蝇的发育过程中发现的一种分节性基因，Hh信号主要是通过跨膜蛋白Ptch和Smo介导向胞内传递。无Hh信号时，Ptch与Smo结合，抑制Smo的作用，导致其下游转录因子Gli转录活性的抑制。当有Hh信号时，Hh与Ptch结合，解除Ptch对Smo的抑制作用，恢复活性的Smo通过级次信号转递，激活Gli转录活性，启动Hh靶基因的转录和表达。

目前在靶向Hh信号通路的抗肿瘤药物研究中，已有多个药物上市或进入临床研究，如美国Genentech公司的Vismodegid(GDC-0449)于2012年已被FDA批准上市，用于皮肤癌的治疗。另外，Erismodegid(LDE225，瑞士Norvatis公司)、LEQ-506(瑞士Norvatis公司)和LY-2940680(美国Lilly公司)等正在进行临床II期及III期，临床研究显示对皮肤癌、脑癌、髓母细胞瘤和其他实体瘤疗效显著。

有研究显示，Hedgehog信号通路抑制剂在治疗对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼产生耐药的慢性髓性白血病(CML)患者过程中，不仅能减少CML细胞的数量，还能减少耐伊马替尼CML细胞的生长。针对目前已有抗肿瘤药物耐药性的问题是肿瘤临床治疗面临的重要难题，因此提供更多的靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤药物，将对改善我国肿瘤患者的经济负担，提高肿瘤临床治疗效果，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的化合物，该化合物对于Hedgehog信号通路具有非常好的抑制作用，在制备慢性髓性白血病药物中具有良好的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种雄甾烷衍生物，具有式I所示结构：

本发明提供了上述方案所述雄甾烷衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将具有式II所示结构的化合物进行斯文氧化反应，得到具有式III所示结构的化合物；

(2)将所述具有式III所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

(3)将所述具有式IV所示结构的化合物与溴丙烯进行季铵化反应，得到具有式I所示结构的雄甾烷衍生物。

优选的，所述步骤(1)中斯文氧化反应在有机溶剂、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺存在条件下进行。

优选的，所述具有式II所示结构的化合物、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺的摩尔比为32:(150～300)：(300～500)：(800～900)。

优选的，所述步骤(1)中斯文氧化反应包括以下步骤：在-70～-60℃及搅拌条件下，向草酰氯与有机溶剂的混合液中加入含二甲基亚砜的有机溶剂溶液，搅拌10～20min后，加入含有式II所示结构的化合物的有机溶剂溶液，搅拌15～30min，将反应液冷却至-80℃～-78℃，随后加入三乙胺，继续搅拌30min～90min。

优选的，所述步骤(2)中水解反应在有机溶剂以及碱存在条件下进行。

优选的，所述步骤(2)中水解反应的温度为40～60℃，时间为1～5h。

优选的，所述步骤(3)中季铵化反应在有机溶剂存在条件下进行。

优选的，所述步骤(3)中季铵化反应的温度为0～10℃，时间为2～5h。

本发明提供了上述方案所述的雄甾烷衍生物在制备治疗慢性髓性白血病药物中的应用。

本发明提供了一种雄甾烷衍生物，具有式I所示结构：

本发明提供的雄甾烷衍生物对Hedgehog信号通路具有非常好的抑制作用，从而为慢性髓性白血病患者提供一种有效的治疗药物。实施例的结果表明，使用小鼠[s12]和人[MZ24]Gli报告细胞系测得的本发明的雄甾烷衍生物的抑制Hedgehog途径信号传导的平均IC50值为0.020uM，而现有经FDA批准的Hedgehog通路抑制剂的平均IC50值为0.022uM，说明本发明提供的雄甾烷衍生物不但具有Hedgehog途径信号抑制作用，而且达到了与Vismodegib相当的效果。

具体实施方式

本发明提供了一种雄甾烷衍生物，具有式I所示结构，根据IUPAC命名法，其化学名为：1-[17β-羟基-2β-(吗啉-4-基)-3-氧代-5α-雄甾烷-16β-基]-1-(丙-2-烯基)吡咯烷溴化物；

(2)将具有式III所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

本发明将具有式II所示结构的化合物进行斯文氧化反应，得到具有式III所示结构的化合物；

本发明对所述具有式II所示结构的化合物的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可；所述具有式II所示结构的化合物的中文名称为：(2β,3α,5α,16β,17β)-2-(4-吗啉基)-16-(1-吡咯烷基)-3,17-二羟基-雄甾烷，CAS号为：119302-24-8。

在本发明中，所述斯文氧化反应优选在有机溶剂、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺存在条件下进行。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺的摩尔比优选为32:(150～300)：(300～500)：(800～900)，更优选为32:220：440：860。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求，能够将各组分分散均匀即可。

在本发明中，所述斯文氧化反应优选包括以下步骤：在-70～-60℃及搅拌条件下，向草酰氯与有机溶剂的混合液中加入含二甲基亚砜的有机溶剂溶液，搅拌10～20min后，加入含有式II所示结构的化合物的有机溶剂溶液，搅拌15～30min，将反应液冷却至-80℃～-78℃，随后加入三乙胺，继续搅拌30min～90min。在本发明中，所述草酰氯与有机溶剂的混合液中草酰氯的浓度优选为0.3～0.6mmol/mL，更优选为0.4～0.5mmol/mL；所述含二甲基亚砜的有机溶剂溶液的浓度优选为3～6mmol/mL，更优选为4～5mmol/mL；所述含有式II所示结构的化合物的有机溶剂溶液的浓度优选为0.03～0.10mmol/mL，更优选为0.04～0.08mmol/mL。本发明对所述搅拌的速率没有特殊要求，能够保证斯文氧化反应顺利进行即可。

斯文氧化反应后，本发明优选还包括：将反应产物体系升至室温，然后经饱和NaCl溶液洗涤、二氯甲烷萃取后，合并有机层并以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析纯化得淡黄色油状物，即具有式III所示结构的化合物。

得到具有式III所示结构的化合物后，本发明将所述具有式III所示结构的化合物进行水解反应，得到具有式IV所示结构的化合物；

在本发明中，所述水解反应优选在有机溶剂以及碱存在条件下进行。在本发明中，所述有机溶剂优选为甲醇或乙醇，更优选为甲醇；所述碱优选为氢氧化钾或氢氧化钠；所述碱、具有式III所示结构的化合物与有机溶剂的用量比优选为(2～3)g：4.9g：(100～200)mL，更优选为2g:4.9g：100mL。

本发明优选将有机溶剂、具有式III所示结构的化合物与碱混合，得到水解反应料液。在本发明中，所述将有机溶剂、具有式III所示结构的化合物与碱混合优选为：将具有式III所示结构的化合物与碱混合，得到第一混合液；向第一混合液中加入碱，得到水解反应料液。

得到水解反应料液后，本发明将所述水解反应料液进行水解反应，得到具有式IV所示结构的化合物。在本发明中，所述水解反应的温度优选为40～60℃，进一步优选为50℃，水解反应的时间优选为1～5h，更优选为2h。在本发明中，所述水解反应优选在搅拌条件下进行。本发明对所述搅拌的速率没有特殊要求，采用本领域熟知的搅拌速率即可。

水解反应后，本发明优选还包括对水解反应所得产物体系以1～10wt.％HCl调pH至7.5～9后加入乙酸乙酯萃取，合并有机层以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得淡黄色固体，即具有式IV所示结构的化合物。

得到具有式IV所示结构的化合物后，本发明将所述具有式IV所示结构的化合物与溴丙烯进行季铵化反应，得到具有式I所示结构的化合物。

在本发明中，所述季铵化反应优选在有机溶剂存在条件下进行。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求，能够将反应物溶解即可。

本发明优选将所述具有式IV所示结构的化合物、溴丙烯与有机溶剂混合，得到反应料液。本发明对所述混合的方式没有特殊要求，采用本领域熟知的混合方式即可。

得到反应料液后，本发明将所述反应料液进行季铵化反应，得到具有式I所示结构的雄甾烷衍生物。在本发明中，所述季铵化反应的温度优选为0～10℃，更优选为10℃；时间优选为2～5h，更优选为3h。在本发明中，所述季铵化反应优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的速率没有特殊要求，能够保证季铵化反应顺利进行即可。

季铵化反应后，本发明优选还包括将季铵化反应产物体系在搅拌条件下滴加至0～10℃的无水乙醚中进行析晶，滴毕后同温搅拌10～30min，过滤，滤饼常温减压干燥后得具有式I所示结构的白色固体。

在本发明中，所述雄甾烷衍生物的制备流程如下：

本发明选择利用DMSO做氧化剂，和三乙胺在低温下与草酰氯协同作用将式II化合物结构中的羟基氧化成酮。该反应条件温和，对于底物的官能团耐受性好，副反应少且收率高。水解反应中以强碱氢氧化钾做碱，在甲醇中对式II化合物结构中乙酰基进行酯的水解反应得到式IV化合物，该方法反应条件温和且反应时间短，所得产品纯度高。在季铵化反应中，首先以二氯甲烷作为反应溶剂，在低温条件下3-溴丙烯与式IV化合物发生季铵化反应。随后利用式I化合物在无水乙醚中几乎不溶的特点，将反应液加至无水乙醚中析出产品，同时达到纯化的目的，该反应简单易操作且收率高。本发明中所用合成路线具有步骤简短、操作简单、总反应收率高、所得产品纯度较高且利于工业化生产等诸多优势。

本发明提供了上述技术方案所述雄甾烷衍生物在制备治疗慢性髓性白血病药物中的应用。

在本发明中，所述慢性髓性白血病药物优选包括活性组分与载体；所述活性组分优选为具有式I所示结构的化合物；所述载体优选为药物可接受的载体，包括但不限于甘露醇，山梨醇，焦亚硫酸钠，亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，盐酸半胱氨酸，巯基乙酸，蛋氨酸，维生素C，EDTA二钠，EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液，盐酸，醋酸，硫酸，磷酸，氨基酸，氯化钠，氯化钾，乳酸钠，木糖醇，麦芽糖，葡萄糖，果糖，右旋糖苷，甘氨酸，淀粉，蔗糖，乳糖，甘露糖醇，硅衍生物，纤维素及其衍生物，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，甘油，土温80，琼脂，碳酸钙，碳酸氢钙，表面活性剂，聚乙二醇，环糊精，β-环糊精，磷脂类材料，高岭土，滑石粉，硬脂酸钙和硬脂酸镁等中的一种或多种。在本发明中，所述药物中活性组分的用量优选为0.1～99.9wt.％。

本发明对所制备的药物剂型没有特殊要求，具体可以为：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、酊剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂；优选的是片剂、散剂、颗粒剂、酊剂、丸剂、胶囊剂、口服液、雾化吸入剂或注射剂。本发明可根据要制备的药物剂型添加其他辅料。本发明对所述辅料的种类没有特殊要求，采用本领域熟知的辅料即可。

当所述药物的剂型为口服给药的制剂时，所述药物优选还包括赋形剂，本发明对所述赋形剂的种类没有特殊要求，采用本领域熟知的赋形剂即可；具体可以为粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂或湿润剂等。在本发明中，所述填充剂优选包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂中的一种或多种，本发明对所述其他类似的填充剂的具体种类没有特殊要求，本领域熟知的具有类似功能的填充剂均可；所述崩解剂优选包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物中的一种或多种，本发明对所述淀粉衍生物的具体种类没有特殊要求，本领域熟知的淀粉衍生物均可，例如羟基乙酸淀粉钠；所述润滑剂优选包括硬脂酸镁；所述湿润剂优选包括十二烷基硫酸钠。

本发明对所述药物的制备方法没有特殊要求，采用本领域熟知的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的化合物及其制备方法与应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按以下反应流程制备具有式I所示结构的雄甾烷衍生物：

(1)搅拌条件下，向3000mL三口反应瓶中依次加入二氯甲烷(500mL)和草酰氯(220mmol)，降温至-60℃后，向上述溶液中加入二氯甲烷-DMSO混合溶液(440mmol DMSO溶于100mL二氯甲烷中)。同温搅拌10min后滴加具有式II所示结构的化合物(15.6g，32mmol)的二氯甲烷溶液(500mL)，-60℃搅拌15min后，将反应液冷却至-78℃，随后加入三乙胺(860mmol)。同温继续搅拌30min后反应结束。反应液缓慢升至室温后以饱和NaCl溶液洗涤、二氯甲烷萃取后，合并有机层并以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析纯化得淡黄色油状物9.3g，收率60％，纯度95.6％。

对所述淡黄色油状物进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：487[M+H]⁺

¹H NMR(D₂O,600M)¹H(ppm)4.55(d,1H)，4.31～4.29(m,1H)，4.11～3.66(m,4H)，3.35～3.29(m,1H)，3.17～3.14(m,4H)，2.83～2.69(m,4H)，2.41～2.29(m,2H)，2.19～2.08(m,4H)，2.21(s,3H)，1.71～1.58(m,2H)，1.69～1.57(m,6H)，1.56～1.41(d,1H)，1.39～1.13(m,4H)，1.04(s,3H)，1.11～1.08(m,2H)，0.98(s,3H)，0.77～0.92(m,1H)；

由上述表征数据可知，得到的淡黄色油状物为具有式III所示结构的化合物；

(2)搅拌条件下，向100mL甲醇中依次加入具有式III所示结构的化合物(4.9g，10mmol)和KOH(35mmol，2g)，加热至50℃搅拌反应约2h后反应结束，以5％HCl调pH＝8后加入乙酸乙酯(200mL)萃取，合并有机层以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得淡黄色固体3.65g，收率80％，纯度85.1％。

对所述淡黄色固体进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：468[M+Na]⁺

¹HNMR(D₂O,600M)¹H(ppm)6.02(s,1H)5.04(d,1H)，4.42～4.28(m,1H)，4.11～3.82(m,4H)，3.42～3.36(m,1H)，3.19～3.08(m,4H)，2.88～2.69(m,4H)，2.29～2.25(m,2H)，2.19～2.09(m,4H)，1.81～1.72(m,2H)，1.72～1.63(m，6H)，1.56～1.37(d,1H)，1.35～1.19(m，4H)，0.98(s，3H)，1.11～1.00(m，2H)，0.89(s,3H)，0.78～0.92(m,1H)。

根据上述表征数据可知，所得淡黄色固体即为具有式IV所示结构的化合物；

(3)10℃冷却搅拌下，向15mL二氯甲烷中依次加入具有式IV所示结构的化合物(3g)和溴丙烯(3g)，同温搅拌反应3h后，搅拌条件下将反应液滴加至5℃无水乙醚中(120g)，滴毕后同温搅拌10min，过滤，滤饼常温减压干燥后得白色固体2.3g，收率60％，纯度84.2％以上；

对所示白色固体进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：486.4[M+H]⁺

¹HNMR(D₂O,600M)¹H(ppm)4.77(s,1H)，6.13(m,1H)，5.61(dd,2H)，5.07(d,1H)，4.21(m,1H)，4.02(m,2H)，3.88(d,4H)，3.61(m,4H)，3.41(m,1H)，3.34(m,1H)，3.27(m,2H)，3.19(m,1H)，2.05(m,1H)，2.02(m,4H)，1.84(m,1H)，1.81(m,2H)，1.70(d,1H)，1.64(d,1H)，1.54(m,2H)，1.51(m,1H)，1.46(m,1H)，1.37(d,2H)，1.27(m,2H)，1.08(m,1H)，1.02(m,1H)，0.89(m,1H)，0.83(s,3H)，0.80(m,1H)，0.76(s,3H)；

由上述表征结果可知，得到的白色固体即为具有式I所示结构的雄甾烷衍生物。

实施例2

(1)搅拌条件下，向3000mL三口反应瓶中依次加入二氯甲烷(500mL)和草酰氯(160mmol)，降温至-70℃后，向上述溶液中加入二氯甲烷-DMSO混合溶液(320mmol DMSO溶于100mL二氯甲烷中)。同温搅拌20min后滴加具有式II所示结构的化合物(15.6g，32mmol)的二氯甲烷溶液(500mL)，-70℃搅拌15min后，将反应液冷却至-78℃，随后加入三乙胺(800mmol)。同温继续搅拌60min后反应结束。反应液缓慢升至室温后以饱和NaCl溶液洗涤、二氯甲烷萃取后，合并有机层并以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析纯化得淡黄色油状物8.6g，收率55％，纯度94.3％。

对所述淡黄色油状物进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：487[M+H]⁺

¹H NMR(D₂O,600M)¹H(ppm)4.43(d,1H)，4.27～4.31(m,1H)，4.12～3.61(m,4H)，3.28～3.21(m,1H)，3.15～2.95(m,4H)，2.79～2.62(m,4H)，2.39～2.23(m,2H)，2.17～2.05(m,4H)，2.01(s,3H)，1.67～1.52(m,2H)，1.65～1.52(m,6H)，1.50～1.41(d,1H)，1.37～1.11(m,4H)，0.97(s,3H)，1.00～0.99(m,2H)，0.95(s,3H)，0.91～0.71(m,1H)；

(3)搅拌条件下，向100mL水中依次加入具有式III所示结构的化合物(4.9g，10mmol)和NaOH(35mmol，1.4g)，加热至40℃搅拌反应约3h后反应结束，以5％HCl调pH＝8后加入乙酸乙酯(200mL)萃取，合并有机层以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得淡黄色固体2.05g，收率45％，纯度82.5％。

对所述淡黄色固体进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：468[M+Na]⁺

¹HNMR(D₂O,600M)¹H(ppm)6.15(s,1H),5.04(d,1H)，4.67～4.35(m,1H)，4.20～4.01(m,4H)，3.52～3.46(m,1H)，3.31～3.23(m,4H)，3.08～2.75(m,4H)，2.43～2.21(m,2H)，2.19～2.05(m,4H)，1.76～1.67(m,2H)，1.72～1.65(m，6H)，1.49～1.32(d,1H)，1.30～1.14(m，4H)，0.95(s，3H)，1.02～0.95(m，2H)，0.84(s,3H)，0.79～0.85(m,1H)。

(3)5℃冷却搅拌下，向15mL二氯甲烷中依次加入具有式IV所示结构的化合物(3g)和溴丙烯(3g)，同温搅拌反应4h后，搅拌条件下将反应液滴加至5℃无水乙醚中(120g)，滴毕后同温搅拌10min，过滤，滤饼常温减压干燥后得白色固体2.2g，收率58％，纯度86.4％以上；

对所示白色固体进行表征，表征数据具体如下：

MS：m/z：486.4[M+H]⁺

¹HNMR(D₂O,600M)¹H(ppm)4.91(s,1H)，6.23(m,1H)，5.71(dd,2H)，5.14(d,1H)，4.01(m,1H)，3.92(m,2H)，3.81(d,4H)，3.71(m,4H)，3.36(m,1H)，3.30(m,1H)，3.24(m,2H)，3.16(m,1H)，2.11(m,1H)，2.01(m,4H)，1.91(m,1H)，1.76(m,2H)，1.63(d,1H)，1.60(d,1H)，1.57(m,2H)，1.51(m,1H)，1.42(m,1H)，1.34(d,2H)，1.23(m,2H)，1.11(m,1H)，0.96(m,1H)，0.88(m,1H)，0.81(s,3H)，0.79(m,1H)，0.68(s,3H)；

实施例3

具有式I所示结构的雄甾烷衍生物对Hedgehog信号通路的抑制作用

小鼠报告细胞系-10T1/2-GliLuc[s12]细胞(源自细胞系C3H10T1/2ATCC#CCL-226)；小鼠胚胎成纤维细胞；生长培养基：用10％胎牛血清(FBS)、10单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和10mM HEPES的Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)。

人报告细胞系-HEPM-GliLuc[MZ24]-细胞(源自HEPM，人胚胎腭突间充质ATCC#CRL-1486)；生长培养基：用10-20％胎牛血清(FBS)、10单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和10mM HEPES pH7.2的极限必需培养基(MEM；包含Earle's盐)。

微量滴定板(MTP)：将细胞铺在96孔MTP(白色，平底，视野透明)中用于荧光素酶测定。

荧光素酶测定培养基：用0.5％FBS、10单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和10mM HEPES pH7.2的DMEM。

PBS/Ca/Mg混合物：含有0.5mM CaCl₂和1mM MgCl₂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

测定程序：

在37℃和CO₂体积浓度为5％的培养箱中，将S12和MZ24细胞系分别在各自的组织培养皿的生长培养基中进行培养，所述S12和MZ24细胞系分别含有被Hedgehog反应性Gli启动子驱动的荧光素酶报告基因。每3天使细胞培养物以亚融合状态(sub-confluency)进行传代。(s12与细胞培养物的质量比为1∶20至1∶40；MZ24与细胞培养物的质量比为1∶3至1∶10)。收获细胞，用生长培养基稀释，从而可以以10,000-20,000个细胞(s12)/100μL/孔、或20,000-30,000个细胞(MZ24)/100μL/孔，将它们铺在微量滴定板中。在37℃和5％CO₂的培养箱的培养基中将细胞进一步温育约48小时。

在48小时的温育后，针对S12细胞系，用包含S12和具有式I所示结构的化合物的荧光测定培养基、包含S12和Vismodegib(一种经FDA批准的Hedgehog通路抑制剂)的荧光测定培养基、以及只包含S12的荧光测定培养基(100μL/孔)分别代替微量滴定板中的生长培养基，各培养基中S12细胞系变化浓度为0.1～0.3μg/mL。针对MZ24细胞系，用包含MZ24和具有式I所示结构的化合物的荧光测定培养基、包含MZ24和Vismodegib(一种经FDA批准的Hedgehog通路抑制剂)的荧光测定培养基、以及只包含MZ24的荧光测定培养基(100μL/孔)分别代替微量滴定板中的生长培养基，各培养基中MZ24细胞系变化浓度为0.5～1.0μg/mL。将细胞进一步温育24小时。

然后用荧光素酶报告基因测定试剂盒(LucLite^TM)对微量滴定板进行测定，测试不同浓度下一系列化合物对特定靶点的活性，然后拟合成曲线，按照本领域公知的IC50的计算方法得出IC50值。测定过程对厂商的方法进行了改良，其中去除培养基并用1：1的PBS/Ca/Mg：裂解缓冲液而不是直接裂解缓冲液重溶底物。

简言之，按体积比1：1将PBS/Ca/Mg与裂解缓冲液混合，向(1000份测定试剂盒)每个底物瓶中添加10mL。然后弃去来自微量滴定板的测定培养基，向每个孔中添加100μL该底物混合物。将板在室温下温育30分钟，然后用Topcount读出器(Packard)或Analyst读出器(Molecular Devices)测定代表荧光素酶报告基因相对表达水平的相对光单位(RLUS)。并计算对应化合物的IC50值。

表1为根据上述程序使用小鼠[s12]和人[MZ24]Gli报告细胞系测得的具体化合物的抑制Hedgehog途径信号传导的IC50值。

表1试验结果

化合物	IC50(S12)	IC50(MZ24)	IC50均值(uM)
				具有式I所示结构的化合物	0.018	0.022	0.020
Vismodegib	0.020	0.024	0.022

由表1数据可知，本发明提供的具有式I所示结构的化合物同样具有Hedgehog途径信号抑制作用，并且其IC50达到了与Vismodegib相当的水平。

由以上实施例可知，本发明提供的雄甾烷衍生物对Hedgehog途径信号具有明显的抑制作用，说起其对慢性髓性白血病具有明显的治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种雄甾烷衍生物，其特征在于，具有式I所示结构：

2.权利要求1所述雄甾烷衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中斯文氧化反应在有机溶剂、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺存在条件下进行。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述具有式II所示结构的化合物、草酰氯、二甲基亚砜和三乙胺的摩尔比为32:150～300：300～500：800～900。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中斯文氧化反应包括以下步骤：在-70～-60℃及搅拌条件下，向草酰氯与有机溶剂的混合液中加入含二甲基亚砜的有机溶剂溶液，搅拌10～20min后，加入含有式II所示结构的化合物的有机溶剂溶液，搅拌15～30min，将反应液冷却至-80℃～-78℃，随后加入三乙胺，继续搅拌30min～90min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中水解反应在有机溶剂以及碱存在条件下进行。

7.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中水解反应的温度为40～60℃，时间为1～5h。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中季铵化反应在有机溶剂存在条件下进行。

9.根据权利要求2或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中季铵化反应的温度为0～10℃，时间为2～5h。

10.权利要求1所述的雄甾烷衍生物在制备治疗慢性髓性白血病药物中的应用。