CN110229169A - 一种新藤黄酸分离及其制备n-芳基新藤黄酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新藤黄酸分离及其制备N‑芳基新藤黄酰胺的方法，利用洗脱剂，以硅胶H作固定相，经两次干柱逆流层析即能低成本、简便、较大规模地分离出纯度96％的新藤黄酸(GNA)样品。室温、常压磁力搅拌下,1‑乙基‑3‑(3‑N,N‑二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(或二环己基碳二亚胺)和4‑N,N‑二甲氨基吡啶催化新藤黄酸与取代芳胺的酰胺化反应。粗产物经硅胶H作固定相的干柱逆流层析即能低成本、简便、较大规模地制备出高纯度、未见文献报道的N‑芳基新藤黄酰胺样品。

Description

一种新藤黄酸分离及其制备N-芳基新藤黄酰胺的方法
技术领域
本发明涉及一种新藤黄酸分离及其制备N-芳基新藤黄酰胺的方法。
背景技术
新藤黄酸(GNA)体内外均能有效抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的生长，有望开发成为抗肿瘤的一类新药。但它在药材藤黄中含量较低、且与多个相似结构的成分共存。现有的新藤黄酸分离方法不能简便、低成本、高效率地分离出高纯度的新藤黄酸。
另外GNA的血管刺激性强、水溶性差、体内半衰期短、低活性、不良稳定性等缺点，也是限制该类药物研发的瓶颈。通过酰胺键分子中引入亲水性基团和药效团，可望增强该类实体的生物活性、提高水溶性、减小血管刺激性、改善大鼠体内的药物代谢动力学过程等。
GNA提取分离困难、生物利用度低等，均是限制该类药物研发的瓶颈。目前，新藤黄酸的分离大都采用多次硅胶柱层析、大孔树脂法分离的方法，但该两种方法均存在严重的死吸附、耗时长、有机试剂使用较多且步骤繁琐并增加分离成本等问题。制备液相色谱方法新藤黄酸分离时上样量小、成本高，并限制了新藤黄酸样品的制备规模。售价50-60万人民币的高速逆流色谱仪，也不是一般实验室都能负担起的。另外，至今还没有N-芳基新藤黄酰胺制备方面的文献报道。因此，迫切需求可以简便、较大规模地分离新藤黄酸及其新法制得的N-芳基酰胺的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从藤黄提取物滤出藤黄酸吡啶盐的母液中分离出高纯度新藤黄酸的方法。该方法采用逆流硅胶干柱层析法，简单、方便，适合规模化生产。
本发明的另一目的在于利用分离得到的新藤黄酸，制备出高纯度的N-芳基新藤黄酰胺的方法。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明采用逆流干柱层析，通过干柱层析技术中待分离样品装在层析用硅胶的下端，洗脱剂从样品的下端引入并按由下至上的流动方向逐步将被分离的化合物按极性大小的顺序在硅胶中排列开来的分离方法。
一种从藤黄提取物滤出藤黄酸吡啶盐的母液中分离出高纯度新藤黄酸的方法，包括以下步骤：
1)在带透砂板的层析柱中依次填充粗硅胶、硅胶拌样、硅胶H后，水泵抽实；
2)打开装有洗脱剂的分液漏斗活塞，洗脱剂逆流干柱柱层析直至洗脱剂前沿跑过硅胶H最上端，样品在硅胶H上分出数条色带；
3)取下色谱柱在底端连接打气筒并将硅胶吹出到干净托盘中，将与薄层层析中新藤黄酸对应的谱带均匀分成3-5段，且每段取样薄层层析法检测其中GNA的纯度；
4)分别合并以上含藤黄酸纯品、较纯品的硅胶H，95％乙醇洗净各段硅胶中的新藤黄酸、溶液浓缩即得。
进一步的，所述的粗硅胶和硅胶H的高度与层析柱内径比大于8:1，所述的硅胶和硅胶H与待分离样品重量比为80-120:1。
进一步的，所述的洗脱剂逆流按1-5cm/min高度的速度进行。
进一步的，所述的洗脱剂体系包括二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺体系和二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯体系，其中，二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺中各组分的体积比为4:0.7:0.3:3.6，二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯中各组分的体积比为3:0.2:3。
本发明逆流硅胶H干柱层析主要借助硅胶颗粒间孔隙产生的毛细作用、分液漏斗中洗脱剂液面与硅胶H干柱中洗脱剂液面高度差值产生的压力，而使待测样品中各成分顺展开剂的移动方向展开。与粒度200-300目的普通柱层析硅胶相比，直径小于38μm的硅胶H柱层析展层过程中因洗脱剂和样品分子较难进入颗粒深孔，使得新藤黄酸吸附与解吸附过程主要发生在颗粒的外表面上。这样就克服了新藤黄酸等分子由于进出硅胶颗粒深孔，造成的扩散及传质缓慢。跟硅胶顶端加待分离样品、洗脱剂从上往下的顺流柱层析相比，逆流硅胶H干柱层析样品的分离情况与通常薄层层析的操作更为相似。
在本发明的另一方面，提供了上述新藤黄酸制备N-芳基新藤黄酰胺的方法，包括以下步骤：
1)新藤黄酸、二环己基碳二亚胺和4-(N,N-二甲氨基)吡啶和二氯甲烷室温搅拌15min后，加入芳胺的二氯甲烷溶液，室温继续搅拌6-10h，至TLC检测反应液中新藤黄酸斑点完全消失；
2)加水淬灭反应后分出有机层，水洗后分出有机相无水硫酸镁干燥，滤除干燥剂滤液减压浓缩后，粗产物经硅胶H作固定相的柱层析即得高纯度的N-芳基新藤黄酰胺样品。
进一步的，所述的二环己基碳二亚胺替换为1-乙基-3-(3-N,N-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。
本发明的有益效果为：
本分离方法先后采用低毒性的二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺、二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯作洗脱剂柱层析减少了三废，有利于环境保护；上样量远大于一般制备色谱的极限，为后续工业化生产提供了有力支持；上样方法易行、省时，样品在柱内分离后截取所需色段、洗脱液浓缩即可。保证了色谱柱高效分离的稳定性，是一种简便的、创新性较高的新藤黄酸分离的技术方法。
与1-乙基-3-(N,N-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl)和4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)的联合催化相比，二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(N,N-二甲氨基)吡啶的联合催化成本更低、催化剂DCC更稳定，同时也降低了反应中循环使用的DMAP的使用量，更符合绿色、环保的现代药物合成理念。
附图说明
图1是本发明实施例1中新藤黄酸分离的装置示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，本发明通过图示的简易分离装置(层析柱装有硅胶H)依次选择二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺体系和二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯体系为洗脱剂两次硅胶H柱层析，从藤黄提取物滤出藤黄酸吡啶盐的母液中分离出高纯度的新藤黄酸。
具体工艺步骤如下：
(1)在底端不带活塞、上端非磨口的带透砂板的层析柱中依次填充拌样粗硅胶、硅胶H[硅胶高度：内径>8:1，和待分离样品重量比(80-120)：1]后，关闭洗脱剂装置部分并水泵抽实；
(2)关闭抽气部分、适度打开装洗脱剂分液漏斗的底部活塞，按1-5cm/min高度的速度开始逆流干柱柱层析直至洗脱剂前沿跑过硅胶H最上端、样品在硅胶H上分出数条色带；
(3)取下色谱柱并底端连接打气筒小心把硅胶吹出到干净托盘中，把与薄层层析中新藤黄酸对应的谱带均匀分成3-5段，且每段取样薄层层析法检测其中GNA的纯度；
(4)分别合并以上含藤黄酸纯品、较纯品的硅胶H，95％乙醇洗净各段硅胶中新藤黄酸、溶液浓缩、称重后HPLC法检测纯度。
本技术中分离层带窄而整齐、分离度大、可获得较高柱效，比传统湿法硅胶柱色谱分离具有操作简便、耗时短、溶剂消耗量小、分离效率高等优点。
逆流柱层析前用硅胶薄层层析法找出GNA斑点与其它斑点Rf差值较大、成点性好的展开剂，并直接用作逆流硅胶柱层析中的洗脱剂。再依次装硅胶H色谱柱、逆流柱层析法分离、洗脱含新藤黄酸纯品的硅胶H段、浓缩溶液再高效液相色谱法(与GNA标准品对照)测新藤黄酸的纯度并计算回收率。
经检测，本发明采用实验室中廉价的逆流硅胶干柱层析装置，分别以二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺(v/v 4:0.7:0.3:3.6)体系和二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯(v/v 3：0.2：3)体系为洗脱剂、以硅胶H作固定相，经两次柱层析即能低成本、简便、较大规模地分离出纯度96％的新藤黄酸(GNA)样品，回收率76％。
实施例2
新藤黄酸的N-芳基酰胺化反应式如下所示：
1)新藤黄酸、二环己基碳二亚胺(DCC,1.1equiv.)和4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP,0.1equiv.)、二氯甲烷(DCM)室温搅拌15min后，加入芳胺(1.1equiv.)的二氯甲烷溶液。室温继续搅拌6-10h,至TLC检测反应液中新藤黄酸斑点完全消失；
2)加水淬灭反应后分出有机层，水洗(4mL×2)后分出有机相无水硫酸镁干燥。滤除干燥剂滤液减压浓缩后，粗产物经硅胶H作固定相的柱层析即能低成本、简便地制备出高纯度的N-芳基新藤黄酰胺样品。
室温、常压磁力搅拌下，1-乙基-3-(3-N,N-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl)[或二环己基碳二亚胺(DCC)]和4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)催化新藤黄酸与取代苯胺(或2-取代吡啶胺等)的酰胺化反应。粗产物经硅胶H作固定相的柱层析即能低成本、简便、较大规模地制备出高纯度、未见文献报道的N-芳基新藤黄酰胺样品，收率78％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种新藤黄酸分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在带透砂板的层析柱中依次填充粗硅胶、硅胶拌样、硅胶H后，水泵抽实；
2)打开装有洗脱剂的分液漏斗活塞，洗脱剂逆流干柱柱层析直至洗脱剂前沿跑过硅胶H最上端，样品在硅胶H上分出数条色带；
3)取下色谱柱在底端连接打气筒并将硅胶吹出到干净托盘中，将与薄层层析中新藤黄酸对应的谱带均匀分成3-5段，且每段取样薄层层析法检测其中GNA的纯度；
4)分别合并以上含藤黄酸纯品、较纯品的硅胶H，95％乙醇洗净各段硅胶中的新藤黄酸、溶液浓缩即得。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的粗硅胶和硅胶H的高度与层析柱内径比大于8:1，所述的硅胶和硅胶H与待分离样品重量比为80-120:1。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的洗脱剂逆流按1-5cm/min高度的速度进行。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的洗脱剂体系包括二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺体系和二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯体系，其中，二氯甲烷-乙醇-丙酮-三乙胺中各组分的体积比为4:0.7:0.3:3.6，二氯甲烷-丙酮-乙酸乙酯中各组分的体积比为3:0.2:3。
5.权利要求1分离得到的新藤黄酸制备N-芳基新藤黄酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)新藤黄酸、二环己基碳二亚胺和4-(N,N-二甲氨基)吡啶和二氯甲烷室温搅拌15min后，加入芳胺的二氯甲烷溶液，室温继续搅拌6-10h，至TLC检测反应液中新藤黄酸斑点完全消失；
2)加水淬灭反应后分出有机层，水洗后分出有机相无水硫酸镁干燥，滤除干燥剂滤液减压浓缩后，粗产物经硅胶H作固定相的干柱逆流层析即得高纯度的N-芳基新藤黄酰胺样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的二环己基碳二亚胺替换为1-乙基-3-(3-N,N-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。
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