CN110227103A - 一种抗口腔病原菌的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗口腔病原菌的组合物及其制备方法和应用。本发明将蜂胶提取物和中药水煎提取物按照质量比为1～4:1～4的比例混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。通过本发明的试验研究表明，蜂胶提取物和中药水煎提取物复配对口腔病原菌变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的生长有高效的抑制作用，二者复配有协同增效作用，蜂胶提取物和中药水煎提取物按质量比1:1复配有更好的抑菌效果。本发明的抗口腔病原菌的组合物的原材料天然环保，效果显著，有益于人体健康，可应用于牙周炎、龋齿的预防和治疗。

Description

一种抗口腔病原菌的组合物及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于医药、动植物和微生物领域，具体涉及一种抗口腔病原菌的组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
人体口腔的湿热条件适合细菌孳生，医学科研人员在口腔病人中检出几百种细菌，细菌通过共聚、黏附，形成稳定的生物膜，膜内的细菌产酸、耐酸，使牙体脱矿。其中变异链球菌是口腔天然菌群中占比例最大的链球菌属中的一种，也是牙斑的主要成分之一，牙龈卟啉单胞菌普遍存在于人体口腔的临床龈下菌斑中。
变异链球菌是龋齿最主要的病原菌。变异链球菌易产酸且耐酸性强，在pH 4.5时仍能继续生活并继续产酸，易溶出钙，造成牙齿局部硬组织脱落，龋病。变异链球菌以蔗糖为底物合成不溶于水且黏附性强的多糖，牢固地黏着在牙面上，加快菌斑形成并致龋。牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者的检出率显著高于牙周健康者，且随着牙周探诊深度的加深，检出率呈现逐渐升高的趋势。牙龈卟啉单胞菌引起牙龈发炎，还对常见的抗生素产生抗性，并挤兑取代对牙齿有益的细菌，牙龈卟啉单胞菌一旦失控，最终会导致牙齿松动并脱落。所以，控制变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌是减少龋病和预防牙周疾病的关键。
蜂胶是蜜蜂采集植物的幼芽以及树干伤处的树脂，混入自身的分泌物，与一些花粉、蜂蜡等混合形成的具有黏性和芬芳气息的胶状不透明物，结合了动物和植物的精华，有“紫色黄金”之称，内含大量的黄酮类物质、酚类、醛类、醇类、芳香酸、脂肪酸、萜类、矿物质、维生素等多种营养成分和抑菌活性物，是一种天然的抗菌剂。蜂胶是一种药理作用非常宽泛的天然药物，有大量研究发现蜂胶有极强的抗菌防龋活性，并也常用于治疗口腔疾病的药材或保健品，如治疗牙周炎的蜂胶牙痛酊、用于治疗口腔口腔溃疡的蜂胶片、清洁牙齿的蜂胶牙膏等等。蛤蟆草有解毒止痒、利湿消肿等功效，对咽喉炎疗效尤其显著，还可治疗感冒、肺炎、肝炎或者湿疹等病症。野菊花是中国传统的常用中药材之一，据古籍记载，菊花有散风清热、清肝明目和解毒消炎等作用。桂花是一种天然药材，能治痰多咳嗽、牙痛口臭、咽干等病，常制作上等茶饮。花椒入药，有止痛、杀虫等功效，还作天然的表皮麻醉剂。薄荷可治流感、头疼、目赤、身热、咽喉、牙床肿痛等症，外用可治神经痛、皮肤瘙痒、皮疹和湿疹等。厚朴是我国传统中药材，始载于《神农本草经》，主要化学成分为厚朴酚和一些挥发油、生物碱和少量的皂普、靴质。早在上世纪年代即有日本学者提出厚朴有抑制主要致龋菌变异链球菌的作用，其抑菌效果显著。这几种入药的植物都具解毒、消肿、消炎、抗菌功效，是治疗慢性炎症的常用中药材，单方或配伍使用有增强人体免疫力、抗肿瘤和抑菌抗菌的生物活性，相关的研究报道也常见。
目前市面上治疗牙周病的一些药如甲硝唑、克林霉素、激素等，甲硝唑属于硝基咪唑类合成抗菌药，克林霉素属于洁霉素类抗生素，不适合长期使用，激素更不能长期使用。具抗口腔病菌活性的植物源药剂更易被牙病患者接受。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种抗口腔病原菌的组合物及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种抗口腔病原菌的组合物的制备方法，包括以下步骤：将蜂胶用乙醇水溶液浸泡，离心取上清液，经浓缩干燥后得到蜂胶提取物；将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴烘干后粉碎，然后将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴混合后加水煎煮，过滤得到水煎液，将水煎液浓缩、灭菌后得到中药水煎提取物；将蜂胶提取物和中药水煎提取物按照质量比为1～4:1～4的比例混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。
具体步骤如下：将蜂胶用体积分数95％的乙醇水溶液浸泡，离心取上清液，经减压浓缩、冷冻干燥得到蜂胶提取物；将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴烘干后粉碎，然后将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴按照质量比为1:1:1:1:1:1的比例混合后加水煎煮两次，过滤，合并两次水煎液，将水煎液浓缩至每1mL相当于原药材1g，灭菌，得到中药水煎提取物；将蜂胶提取物和中药水煎提取物按照质量比为1:1的比例混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。
本发明的第二个目的是提供一种按照所述的制备方法制备得到的抗口腔病原菌的组合物。
所述的口腔病原菌为变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400或牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277。
本发明的第三个目的是提供所述的抗口腔病原菌的组合物在制备治疗牙周炎或龋齿的药物中的应用。
本发明通过蜂胶提取物与中药水煎提取物复配得到抗口腔病原菌的组合物，该组合物具有抑制口腔病原菌变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的效果，二者复配抑菌效果加强，具有协同增效作用。
通过本发明的试验研究表明，将蜂胶提取物与中药水煎提取物按质量比1:1配比，对口腔病原菌的生长的抑制作用最好。
本发明的抗口腔病原菌的组合物的原材料天然环保，效果显著，有益于人体健康，可应用于牙周炎、龋齿的预防和治疗，应用范围和前景广阔。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中的测试菌株为变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400时，测试方法为：用该实施例中脑心浸液琼脂(BHIA)斜面培养基将测试菌株于37℃培养4d。然后用PBS把菌洗下，稀释到OD600＝1.0配制成菌悬液工作液。取1mL菌悬液至已灭菌的直径为90mm平板，然后倾注20mL BHIA培养基，轻轻摇动培养皿，使培养基与菌悬液混匀，静置冷却凝固。用已灭菌的打孔器在上述试验平板上打孔，孔的直径为5.0mm，向孔中放入20mg的待测样品，在37℃培养4d，用直尺测定抑菌环的直径并计算清晰抑菌区宽度。
以下实施例中的测试菌株为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC33277时，测试方法为：用该实施例中TSA+5％脱纤维羊血斜面培养基将测试菌株于37℃厌氧培养4d。然后用PBS把菌洗下，稀释到OD600＝1.0配制成菌悬液工作液。取1mL菌悬液至已灭菌的直径为90mm平板，然后倾注20mL TSA+5％脱纤维羊血培养基，轻轻摇动培养皿，使培养基与菌悬液混匀，静置冷却凝固。用已灭菌的打孔器在上述试验平板上打孔，孔的直径为5.0mm，向孔中放入20mg的待测样品，在37℃厌氧培养4d，用直尺测定抑菌环的直径并计算清晰抑菌区宽度。
清晰抑菌区宽度计算公式：W＝(T-D)/2；其中W＝清晰抑菌区宽度，T＝孔与抑菌区总宽度，D＝孔的宽度。
每个处理做3个平行，用直尺测定清晰抑菌环直径，结果取三个平行数据的平均值。以无菌水代替药剂做空白对照，同时测试蜂胶提取物与中药水煎提取物的抑菌环。
在本说明书中使用以下缩写：CMCC是中国医学细菌菌种保藏管理中心的缩写，ATCC是美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)的简写，rpm表示离心机的离心速度，PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，温度的单位是摄氏度(℃)，min＝分钟，d＝天，mL＝毫升，mm＝毫米，mg＝毫克，g＝克，OD600指的是溶液在600nm波长处的吸光值。
实施例1：
称取蜂胶(来源于山东泰安宁阳县葛石镇祥海蜜蜂养殖场，货号：20181008)100g，用500mL体积分数95％的乙醇水溶液浸泡，每天搅拌2次，浸泡5天后，经10000rpm离心20min，取上清液，经减压浓缩、冷冻干燥得到10g蜂胶提取物(蜂胶膏)；虾蟆草采摘于重庆山区，从采芝灵药店购入野菊花、桂花、花椒、薄荷、厚朴，将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷、厚朴这6味中药材干品烘干粉碎，将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴以质量比为1:1:1:1:1:1的比例混合后取100g于1000mL蒸馏水中，室温浸泡30min后煮沸30min，稍冷却后过滤得到水煎液，剩渣中加入500mL蒸馏水煮沸30min，过滤得到水煎液，合并两次水煎液，浓缩至100mL，经121℃灭菌20min后，得到中药水煎提取物，于4℃冰箱内保存备用。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为4:1。制备方法：称取16mg蜂胶提取物与4mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：11.0mm，清晰抑菌区宽度为3.0mm。
空白样品(无菌水)对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：10.0mm，清晰抑菌区宽度为2.5mm。
中药水煎提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：8.0mm，清晰抑菌区宽度为1.5mm。
实施例2：
按照实施例1的方法制备蜂胶提取物和中药水煎提取物。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为1:1。制备方法：称取10mg蜂胶提取物与10mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：13.6mm，清晰抑菌区宽度为4.3mm。
空白样品(无菌水)对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：10.0mm，清晰抑菌区宽度为2.5mm。
中药水煎提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：8.0mm，清晰抑菌区宽度为1.5mm。
实施例3：
按照实施例1的方法制备蜂胶提取物和中药水煎提取物。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为1:4。制备方法：称取4mg蜂胶提取物与16mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：8.6mm，清晰抑菌区宽度为1.8mm。
空白样品(无菌水)对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：10.0mm，清晰抑菌区宽度为2.5mm。
中药水煎提取物对变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400的抑菌环大小为：8.0mm，清晰抑菌区宽度为1.5mm。
实施例4：
按照实施例1的方法制备蜂胶提取物和中药水煎提取物。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为4:1。制备方法：称取16mg蜂胶提取物与4mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)ATCC 33277作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：10.0mm，清晰抑菌区宽度为2.5mm。
空白样品(无菌水)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：9.2mm，清晰抑菌区宽度为2.1mm。
中药水煎提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：8.6mm，清晰抑菌区宽度为1.8mm。
实施例5：
按照实施例1的方法制备蜂胶提取物和中药水煎提取物。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为1:1。制备方法：称取10mg蜂胶提取物与10mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)ATCC 33277作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：12.6mm，清晰抑菌区宽度为3.8mm。
空白样品(无菌水)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：9.2mm，清晰抑菌区宽度为2.1mm。
中药水煎提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：8.6mm，清晰抑菌区宽度为1.8mm。
实施例6：
按照实施例1的方法制备蜂胶提取物和中药水煎提取物。
一种抗口腔病原菌的组合物，包括蜂胶提取物和中药水煎提取物，蜂胶提取物和中药水煎提取物的质量比为1:4。制备方法：称取4mg蜂胶提取物与16mg中药水煎提取物置于烧杯中，混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)ATCC 33277作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的测试方法进行测试，抑菌环大小为：8.8mm，清晰抑菌区宽度为1.9mm。
空白样品(无菌水)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的清晰抑菌区宽度为0。
蜂胶提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：9.2mm，清晰抑菌区宽度为2.1mm。
中药水煎提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277的抑菌环大小为：8.6mm，清晰抑菌区宽度为1.8mm。

Claims (5)

1.一种抗口腔病原菌的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将蜂胶用乙醇水溶液浸泡，离心取上清液，经浓缩干燥后得到蜂胶提取物；将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴烘干后粉碎，然后将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴混合后加水煎煮，过滤得到水煎液，将水煎液浓缩、灭菌后得到中药水煎提取物；将蜂胶提取物和中药水煎提取物按照质量比为1～4:1～4的比例混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将蜂胶用体积分数95％的乙醇水溶液浸泡，离心取上清液，经减压浓缩、冷冻干燥得到蜂胶提取物；将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴烘干后粉碎，然后将虾蟆草、野菊花、桂花、花椒、薄荷和厚朴按照质量比为1:1:1:1:1:1的比例混合后加水煎煮两次，过滤，合并两次水煎液，将水煎液浓缩至每1mL相当于原药材1g，灭菌，得到中药水煎提取物；将蜂胶提取物和中药水煎提取物按照质量比为1:1的比例混合均匀，得到抗口腔病原菌的组合物。
3.一种按照权利要求1或2所述的制备方法制备得到的抗口腔病原菌的组合物。
4.根据权利要求3所述的抗口腔病原菌的组合物，其特征在于，所述的口腔病原菌为变异链球菌(Streptococcus mutans)CMCC32400或牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)ATCC 33277。
5.权利要求3所述的抗口腔病原菌的组合物在制备治疗牙周炎或龋齿的药物中的应用。
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