CN110227072A

CN110227072A - 氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用

Info

Publication number: CN110227072A
Application number: CN201910630137.8A
Authority: CN
Inventors: 朱永霞; 王悦; 叶庭洪
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明涉及氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用。本发明所解决的是黑色素瘤现有靶向药物易耐药、患者依从性差的问题，技术方案是提供了氯硝柳胺在制备防治黑色素瘤肺转移的药物中的用途。本发明的体外实验发现，氯硝柳胺能够明显抑制人源黑色素瘤细胞株A375和鼠源黑色素瘤细胞株B16‑F10的细胞迁移和侵袭；氯硝柳胺可以抑制黑色素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。体内实验结果显示，氯硝柳胺能显著抑制黑色素瘤肺部转移结节的形成和数量；氯硝柳胺明显降低肺转移模型小鼠的肺重和肺系数；氯硝柳胺明显减少小鼠肺部浸润的髓源抑制细胞(MDSCs)的比例。本发明的研究提示，氯硝柳胺具有预防黑色素瘤肺部转移的潜力，具有较大的临床和社会意义。

Description

氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是涉及氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用。

背景技术

黑色素瘤(Malignant melanoma)是一种源于皮肤、粘膜、眼等色素沉着区域的黑色素细胞的恶性肿瘤，是皮肤癌中致死性较高的一种癌症。黑色素瘤通常是由生黑素细胞衍变生产，通常开始于天然痣或者是长期暴露在UVA和UAB辐射，遗传因素也会造成患黑色素瘤的风险。转移是黑色素瘤的重要特征，其侵袭可以发生在任何黑色素细胞组织。黑色素瘤可发生血行及淋巴转移，尤其是早期血行转移将导致肿瘤细胞向肺、肝脏、脑等重要脏器扩散，其中肺转移是黑色素瘤最常见的血行转移部位。黑色素瘤转移造成了患者痛苦，也预示着肿瘤的不良预后，明显增加患者的死亡率，而且黑色素瘤的复发性转移更是使肿瘤的治疗事倍功半。在黑色素瘤IV的病人中，癌症细胞会扩散到身体的其他部位，例如肺、肝脏、脑、骨、淋巴组织或者其他皮肤组织，这些导致病人只有8～9个月的生存期，仅有15％的病人能够存活超过3年。

近年来，我国黑色素瘤患者的发病率和死亡率也逐年上升。肿瘤靶向治疗在黑色素瘤的治疗中发挥着重要作用。美国FDA分别于2011，2013年批准维罗非尼(Vemurafenib)和达拉非尼(Dabrafenib)上市，用于靶向治疗BRAF^V600E突变蛋白阳性的患者。虽然黑色素瘤的治疗取得了很大的突破，但是黑色素瘤的转移和靶向药物的耐药仍然是限制黑色素瘤治疗的重要因素。因此，开发抗黑色素瘤转移药物具有重大医学价值。

发明内容

本发明的目的，是针对黑色素瘤肺转移在临床上治疗效果不理想的现状，提供氯硝柳胺抗黑色素瘤肺转移的新用途。

本发明的目的是这样实现的：

氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤细胞迁移的能力。

进一步的，所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤细胞侵袭的能力。

进一步的，所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤肺部浸润的髓源抑制细胞的比例增加。

进一步的，所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤侵袭、迁移相关蛋白的表达。

所述的氯硝柳胺用于预防黑色素瘤肺转移，其制剂为氯硝柳胺在药学上可接受盐，氯硝柳胺的有效使用剂量为20mg/kg以上。

进一步的，所述的氯硝柳胺用于预防黑色素瘤肺转移，其制剂为注射剂，口服剂的一种或多种。

本发明的有益效果在于：提供了氯硝柳胺的一种新用途。公开了氯硝柳胺的抗肿瘤转移的作用；氯硝柳胺可有效抑制黑色素瘤细胞的活性、迁移及侵袭；氯硝柳胺具有抑制黑色素瘤细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的作用；氯硝柳胺可抑制C57BL/6J荷瘤小鼠肺转移，明显减少肺转移结节，明显降低肺重和肺系数；氯硝柳胺明显减少小鼠肺部浸润的髓源抑制细胞(MDSCs)的比例；氯硝柳胺具有抗黑色素瘤肺转移活性，为黑色素瘤肺转移的预防提供了一种新的方案。

附图说明

图1是划痕实验结果显示氯硝柳胺抑制A375黑色素瘤细胞的迁移及数据统计图。

图2是划痕实验结果显示氯硝柳胺抑制B16-F10黑色素瘤细胞的迁移及数据统计图。

图3是Transwell实验结果显示氯硝柳胺抑制A375黑色素瘤细胞的迁移。

图4是Transwell实验结果显示氯硝柳胺抑制A375黑色素瘤细胞的侵袭。

图5是氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。

图6是C57BL/6J荷瘤小鼠B16-F10肺转移结果照片及小鼠肺重和肺系数。

图7是B16-F10肺转移模型中肺部组织的H&E染色照片。

图8是氯硝柳胺抑制B16-F10肺转移模型中肺部浸润的髓源抑制细胞(MDSCs)的比例。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

实施例1

氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞A375迁移实验。

采用划痕实验，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定氯硝柳胺对黑色素瘤细胞迁移的抑制作用。取对数生长期的黑色素瘤细胞A375，经胰蛋白酶消化离心后制备成均匀的细胞悬液并接种于6孔板中，37℃培养箱孵育24h后达到80％融合。使用200μL无菌的枪尖在细胞的中心区域快速并清晰的划一道痕，用对应的新鲜培养基清洗三次，除去划下来的死细胞。在以划痕的孔中分别加入2mL含有不同浓度氯硝柳胺的培养基。24h后，在倒置显微镜下观察并拍照，并对迁移的细胞进行定量分析。把使用含有0.1％的DMSO处理的阴性对照中细胞迁移数定义为100％。

按照下述公式计算抑制率：

细胞迁移抑制率(％)＝(迁移细胞数_Control-迁移细胞数_处理组)/迁移细胞数_Control*100％。

结果：如图1显示，氯硝柳胺明显抑制黑色素瘤细胞A375迁移的作用，且具有浓度依赖性。数据统计值显示，2.5、5、10μM氯硝柳胺处理后，细胞迁移的抑制率分别为40％、20％、5％。

实施例2

氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞B16-F10迁移实验

采用划痕实验，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定氯硝柳胺对黑色素瘤细胞迁移的抑制作用。取对数生长期的黑色素瘤细胞B16-F10，经胰蛋白酶消化离心后制备成均匀的细胞悬液并接种于6孔板中，37℃培养箱孵育24h后达到80％融合。使用200μL无菌的枪尖在细胞的中心区域快速并清晰的划一道痕，用对应的新鲜培养基清洗三次，除去划下来的死细胞。在以划痕的孔中分别加入2mL含有不同浓度氯硝柳胺的培养基。24h后，在倒置显微镜下观察并拍照，并对迁移的细胞进行定量分析。把使用含有0.1％的DMSO处理的阴性对照中细胞迁移数定义为100％。

按照下述公式计算抑制率：

结果：如图2显示，氯硝柳胺明显抑制B16-F10黑色素瘤细胞迁移的作用，且具有浓度依赖性。数据统计值显示，2.5、5、10μM氯硝柳胺处理后，细胞迁移的抑制率分别为60％、20％、10％。

实施例3

氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞A375Transwell迁移实验

＝＝采用Transwell迁移实验法。主要材料是Transwell小室(Transwellchamber)，其外形类似一个可以放置在孔板里的小杯子，底层是一张有通透性的膜，一般为聚碳酸酯膜(Poly carbonate membrane)

本实验采用8μm孔径的Transwell小室。Transwell小室置于24孔板上，在小室的上层加入100μL无血清的培养基，其中含有5×10⁴个黑色素瘤细胞B16-F10和不同浓度的氯硝柳胺，阴性对照为0.1％的DMSO。小室的下层加入600μL的含有10％FBS的完全培养基和不同浓度的氯硝柳胺。孵箱中培养20h后，使用75％乙醇固定迁移到微孔膜背面的细胞10min，再用0.5％结晶紫·乙醇溶液染色10min。染色后的微孔膜再用去离子水清洗，晾干后使用中性树胶封于载玻片上，并在显微镜下拍照和定量，计算细胞的迁移率。

结果：图3为氯硝柳胺抑制A375Transwell小室迁移照片，迁移后的A375细胞进入聚碳酸酯膜的底层，结晶紫染色后细胞显紫色。如图3所示，随着氯硝柳胺浓度的升高，迁移到聚碳酸酯膜底层的细胞逐渐减少。统计结果显示，与对照组相比，氯硝柳胺浓度为2.5μM时，细胞迁移的抑制率为60％；氯硝柳胺浓度为5μM时，细胞迁移的抑制率为30％；氯硝柳胺浓度为10μM时，细胞迁移的抑制率为10％。

实施例4

氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞A375侵袭实验

本实验采用8μm孔径的Transwell小室。首先，将基质胶用无血清DMEM培养基按照1:3的比例稀释。将8μmTranswell小室置于24孔板上，在小室的微孔膜上覆盖60μL稀释后的基质胶，于37℃孵箱中静置凝固30min左右。当基质胶凝固后，小室上层加入100μL完全培养基，其中包含1×10⁵个黑色素瘤细胞A375或B16-F10和不同浓度的硝呋齐特，阴性对照为0.1％的DMSO，小室的下层加入600μL完全培养基。孵箱中培养20h后，使用棉签刮下没有侵袭到微孔膜背面的细胞，侵袭到微孔膜背面的细胞先用75％乙醇固定15min，再用0.5％结晶紫·乙醇溶液染色10min。染色后的微孔膜再用去离子水清洗，晾干后使用中性树胶封于载玻片上，并在显微镜下拍照和定量，计算细胞的侵袭率。

结果：图4为氯硝柳胺抑制A375Transwell小室侵袭的照片，A375细胞通过分泌金属蛋白酶溶解基质胶后，细胞进入聚碳酸酯膜的底层，结晶紫染色后细胞显紫色。如图4所示，随着氯硝柳胺浓度的升高，侵袭到聚碳酸酯膜底层的细胞逐渐减少。统计结果显示，与对照组相比，氯硝柳胺浓度为2.5μM时，细胞侵袭的抑制率为50％；氯硝柳胺浓度为5μM时，细胞侵袭的抑制率为20％；氯硝柳胺浓度为10μM时，细胞侵袭的抑制率为10％。

实施例5

氯硝柳胺抑制黑色素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达

细胞培养及给药处理：取对数生长期的黑色素瘤细胞A375，制成细胞悬液后接种于直径为10mm的细胞培养皿中。过夜孵育后加入不同浓度的氯硝柳胺24h，其浓度设置分别为2.5、5、10μM，0.1％的DMSO做为阴性对照。

蛋白提取：取培养皿置于冰上，弃去培养基，预冷PBS清洗细胞2次。加入200～500μL RIPA细胞裂解液(使用量需依据细胞的数量而定，量不足会使细胞裂解不完全，量太大则会导致蛋白浓度太低)，冰上裂解30min，每隔10min晃动培养皿使细胞裂解液尽量接触细胞，使用细胞刮轻轻刮下裂解后的细胞并转移至预冷后的EP管中。使用超声破碎仪破碎细胞(6s/次，每次间隔10s，共3次)，在13,000rpm、4℃下离心30min后取上清。

蛋白定量：将BSA溶液(2mg/mL)于96孔板上中PBS稀释至1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0mg/mL不同浓度。提取所得的蛋白溶液用RIPA稀释10倍。分别取10μL不同浓度的BSA溶液和稀释后的蛋白样品，迅速加入190μL考马斯亮蓝染液，混匀后在室温下避光放置10min。用酶标仪于595nm波长下检测每孔的吸光度值。用所得BSA数据做标准曲线并计算制备样品的蛋白溶液浓度，标准曲线的相关系数应大于0.99。根据所得样品浓度，将所有蛋白样本定容至统一浓度，并加入适量5×Loading buffer(含5％的β-巯基乙醇)，水浴煮沸5min使蛋白变性。每次蛋白上样量为30μg，将样品分装后放入-20℃冰箱内保存。

SDS-PAGE凝胶电泳：配置SDS-PAGE凝胶，上层浓缩胶浓度为5％，下层分离胶浓度根据待测蛋白分子量分别为10％或12％。分别把待检测样品和预染Marker依次加入上样孔，先用80V电压约30min使样品进入分离胶，调整电压至120V电泳分离蛋白样品。

转膜：将分离蛋白的凝胶放入转膜缓冲液中平衡约5min。将PVDF膜在甲醇中浸泡10s激活后放入转膜缓冲液中，取6张大小适宜的滤纸放入转膜缓冲液中待用。将滤纸、凝胶和PVDF膜按照板(黑色)——纤维棉——3层滤纸——凝胶——PVDF膜——3层滤纸——纤维膜——板(红色)的顺序放置制成转膜“三明治”，小心赶走各层间的气泡。将转膜“三明治”放入装有转膜缓冲液的电泳槽，可通过电泳槽中放入小冰袋且将电泳槽置于冰浴中缓解转膜散出的热量。调至合适电压(80～100V)转膜，其转膜时间根据目的蛋白分子量大小设置。

抗体孵育和显影：转膜完毕后，将PVDF膜置于TBS缓冲液中清洗10min后转入封闭缓冲液，于摇床上封闭1～2h。封闭结束后转入TBS/T缓冲液中洗3次，15min/次。加入合适稀释度的一抗(MMP-2、MMP-9、p-STAT3^Tyr705和STAT3)，放入4℃冰箱内缓慢摇动孵育过夜。次日，使用TBS/T缓冲液清洗PVDF膜3次，15min/次。随后，加入合适稀释度的二抗，37℃恒温孵育1h。使用TBS/T缓冲液清洗PVDF膜3次，15min/次。最后，将PVDF膜加入含有HRP显影液中孵育并置于曝光暗盒中暗室曝光。将所得胶片扫描为图片分析并使用Image J定量，β-actin做为内参。

结果：Western blot的实验结果显示如图5所示，黑色素瘤细胞A375采用硝呋齐特处理后，迁移侵袭相关蛋白p-STAT3^Tyr705，MMP-2和MMP-9的表达水平明显被抑制，说明氯硝柳胺可以通过影响相关蛋白的表达而明显抑制黑色素瘤的迁移和侵袭。

实施例6

动物模型的建立：小鼠黑色素瘤B16-F10肺部转移肿瘤模型，选用C57Bl/6小鼠(购买于北京华富康实验动物技术有限公司，体重18-22g，周龄6-8周)，通过尾静脉注射构建了C57Bl/6小鼠黑色素瘤肺部转移肿瘤模型。收集处于对数生长期的B16-F10细胞，用不含血清，不含抗生素的RPMI-1640双无培养基清洗细胞2次，再用RPMI-1640双无培养基重悬成浓度为2×10⁵个/100μL的细胞悬液。按照每只小鼠100μL细胞悬液的量尾静脉注射于C57Bl/6小鼠(雌性，8～10周龄，18～20g)。

细胞接种6天后，开始进行随机分组(6只/组)并给药。分组情况为：A组：对照Vehicle组，12.5％的CrEL+12.5％乙醇+75％生理盐水；B组：20mg/kg硝呋齐特治疗组；C组：正常对照小鼠组(未构建肺部转移模型小鼠)。每天腹腔给药一次，共给药21天，每天观察小鼠状态，包括小鼠皮毛色泽变化、进食情况、活动规律以及体重变化等情况。

样品收集：麻醉小鼠后，将其四肢固定于手术台，小鼠呈仰卧状。仔细解剖小鼠，并取出肺部组织，分别对小鼠体重和小鼠肺部组织称重并统计，最后，对各组小鼠肺组织拍照。

结果：B16-F10细胞通过尾静脉注射后，如图6所示，小鼠肺部表面明显出现黑色素瘤细胞转移结节。与对照Vehicle相比，氯硝柳胺处理后可以明显抑制黑色素瘤的肺部转移结节的数量。同时，经氯硝柳胺治疗后，小鼠肺部重量也发生明显降低，肺系数(肺组织重量/小鼠体重)降低了约2倍。

实施例7

黑色素瘤肺部转移模型结束后，所得肺组织进行后续H&E检测。将肺组织浸泡在4％多聚甲醛溶液中；24～48h后，将肺组织放入标记的包埋盒中，使用自来水冲洗5h；按照以下步骤进行固定脱水：75％乙醇中浸泡过夜；85％乙醇1h，2次；95％乙醇30min，2次；100％乙醇30min，3次；二甲苯30min，2次。然后将脱水的肺组织放至65℃旧石蜡中，30min/次，2次，再放入二蜡和新蜡中20min。使用石蜡包埋机将肺组织包埋，最后在冷冻机上冷却30min。对包裹每组肺组织的石蜡进行切片并于60℃烤片1h，切片厚度约为3-5μm。烘烤后的切片按照以下步骤进行脱蜡及水化：二甲苯10min，2次；100％乙醇2min；95％乙醇，2min；85％乙醇，2min；75％乙醇，2min；蒸馏水5min，2次。染色：加入苏木素染液染色大约1min，用自来水冲洗5-10min，伊红复染1min，自来水漂洗0.5-1min，再经过85％乙醇1次，2min/次，95％乙醇1次，2min/次，100％乙醇1次，2min/次，二甲苯2次，5min/次脱水处理，使用中性树胶封片。最后，在显微镜下观察全部视野，在每张切片上取5-6个不同区域进行拍照。结果：如图7所示，对B16-F10肺转移模型中肺组织的H&E染色结果可以清晰的显示，相对于空白对照组，氯硝柳胺处理后，小鼠肺部结节转移数量明显减少，而且肺部转移结节的大小也明显减小。总之，这些实验结果均显示氯硝柳胺可以明显阻止体内黑色素瘤的肺部转移。

实施例8

肿瘤微环境是一个由多种类型的细胞组成的复杂体系，许多细胞在肿瘤的生长和免疫的逃逸方面有很大的作用，尤其是肿瘤相关的MDSCs在肿瘤生长和应答方面发挥重大作用。另外，MDSCs可以抑制宿主体内的免疫效应，在肿瘤发生、发展和转移过程中起到重要的作用，而且有研究显示：循环的MDSCs的增加的水平与广泛的转移性黑色素瘤患者具有密切关系。黑色素瘤肺部转移模型结束后，所得肺组织中的MDSCs进行后续检测。随机取少量小鼠肺部组织，剪碎后用配置的I型胶原酶消化2h，1500rpm，离心3min。PBS清洗2次后，用PBS重悬成单细胞悬液。通过使用PE-Gr1和FITC-CD11b荧光染料标记MDSCs细胞。在所得的单细胞重悬液中，分别加入1μL PE-Gr1和1μL FITC-CD11b荧光染料，冰上避光孵育30min，1500rpm，离心3min。PBS清洗2次后，用PBS重悬。流式细胞仪检测并用FlowJo软件进行数据分析。

结果：通过流式细胞术检测肺部浸润的MDSCs(CD11b⁺/Gr-1⁺)的数量。在使用硝呋齐特治疗14天后，MDSCs的数量发生明显的减少，从图8可以看出，治疗组的MDSCs数量减少了约3倍，几乎接近正常小鼠肺部表达，因此，这些实验结果表明氯硝柳胺可通过抑制MDSCs在肺部的积累/聚集，降低黑色素瘤肺转移。

Claims

1.氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤细胞迁移的能力。

2.根据权利要求1所述的氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤细胞侵袭的能力。

3.根据权利要求1所述的氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤肺部浸润的髓源抑制细胞的比例增加。

4.根据权利要求1所述的氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述预防黑色素瘤肺转移是指抑制黑色素瘤侵袭、迁移相关蛋白的表达。

5.根据权利要求1所述的氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述的氯硝柳胺用于预防黑色素瘤肺转移，其制剂为氯硝柳胺在药学上可接受盐，氯硝柳胺的有效使用剂量为20mg/kg以上。

6.根据权利要求1或5所述的氯硝柳胺在预防黑色素瘤肺转移中的应用，其特征是：所述的氯硝柳胺用于预防黑色素瘤肺转移，其制剂为注射剂，口服剂的一种或多种。