CN110208441A - 淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及隐性孔雀石绿的检测方法，具体涉及，淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，首先，快提淡水鱼中孔雀石绿和隐性孔雀石绿，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿，色谱‑光谱联用采集其多波长色谱数据，经处理得到不含隐性孔雀石绿的本底光谱数据库N，第二，建立隐性孔雀石绿的标准光谱数据库V，第三，快速提取市售淡水鱼样本，加入硼氢化钾粉末后采集样品紫外‑可见光谱c，第四，采用向量‑子空间夹角判据算法快速计算待测样品中隐性孔雀石绿总量。本发明解决了现有孔雀石绿和隐性孔雀石绿提取方法繁琐，操作复杂，提取率低的问题，实现了淡水鱼中隐性孔雀石绿快速检测。

Description

淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法
技术领域
本发明涉及隐性孔雀石绿的检测方法，具体涉及淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取 和检测方法。
背景技术
孔雀石绿(malachite green，简写MG)属于三苯基甲烷型的染料，是有毒的三苯基甲烷类化学物质，常被用在预防和治疗鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等以及鱼类保 鲜。
MG进入人或动物体内后，可通过生物转化产生隐色孔雀绿(LeucomalachiteGreen， 简写LMG)，LMG对光敏感，在260nm处具有最强的吸收峰，具有致癌性，致畸性 和致突变性等副作用。
我国《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》已将MG列入禁用药物。MG在鱼 体内会转化为LMG且停留的时间很长，由于其含量极其少，以至于难检测到其存在。 现阶段，我国用于检测含有MG和LMG水产品的国家标准及相关文献方法主要有以下 几种：高效液相色谱法、荧光法、拉曼光谱法、酶联免疫法、液-质联用法等。
高效液相色谱法：现有国家标准及文献对水产品中的MG及LMG的提取方法，均 同时或部分添加二甘醇、盐酸羟胺、对-甲苯磺酸及乙酸铵缓冲溶液进行提取，加入KBH4溶液还原测定LMG或加入过氧化铅氧化测定MG，采用二氯甲烷进行液液萃取，并使 用中性氧化铝、PRS等固相萃取柱洗脱净化。国标回收率为70-110％，检出限为0.5μg/kg； 相关文献改进国标方法后回收率在82％以上，准确度高。
荧光法：MG对水溶性Cd Te/Zn S量子点会发生荧光猝灭现象，依据这一性质建立检测水产的方法，在pH＝8，0.065mol/L的Tris-HCl缓冲溶液和1.60×10-4mol/L的Cd Te/Zn S量子点优化体系，MG质量在0.0193-1.28mg/L和Cd Te/Zn S量子点的荧光猝灭 强度呈线性关系。检出限为0.00543mg/L，回收率为90.4-100.3％，RSD值为0.37-1.01％， 准确度较高。
拉曼光谱法：利用MG位于432-437cm-1、1166-1170cm-1和1613-1617cm-1的拉曼 光谱的特征峰和强度，测定水产养殖水中的MG，检出限为5mg/L，精密度RSD值为 0.51％，方法重现性好、耗时少。
酶联免疫法：应用其中一种酶联免疫试剂盒对市场中不同的水产品进行抽检其残留 的MG和LMG的含量，检出率为6.98％，可以用来快速筛查大量水产品。
液相-质谱联用法：氘代LMG被用作内标。加入盐酸羟胺、对甲苯磺酸、乙酸铵， 混合均匀后，用乙腈提取样品，通过离心和中性氧化铝纯化，再加入二氯甲烷进行萃取， 然后用氮气吹至接近干燥，初始流动相恒定后，将其在C18柱上分离和MRM模式检测， 回收率为86.5—91.8％，检出限为0.1μg/L，RSD小于7％，结果具有一定的准确性。
色谱方法灵敏度高，但其时间和溶剂消耗高，分光光度法在国内运用比较广泛，但其存在灵敏度不够高的缺点，对低浓度检测有一定的影响。酶联免疫分析需要消除蛋白 质干扰，预处理过程复杂。在现行国家、地方标准以及大部分文献中，主要以MG的分 析检测为研究对象，对LMG的检测报道较少。对MG和LMG快速检测技术有拉曼光 谱法和酶联免疫法，但是拉曼光谱法的灵敏度较差，酶联免疫法检测成本较高，存在假 阴性和假阳性的情况。
发明内容
本发明的目的是克服上述缺陷，提供淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法， 以隐性孔雀石绿总量计。近年来，快速分析技术是食品安全检测的发展趋势，本发明基于向量-子空间夹角判据法建立了淡水鱼中LMG的快速提取和检测方法。
本发明的技术方案：淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，包括：
步骤1，将淡水鱼放在含有孔雀石绿的水中培养24h，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，鱼肉中加入乙腈，快速提取，得到含有隐性孔雀石绿和孔雀石绿的样品，加入硼 氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿；
将液相色谱-光谱仪联用，采集完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分隐性孔雀石绿的色谱数据，得到数据量大的本底数据库B，对B进行主成分分析和奇异 值分解降低维度，得到数据量小的本底数据库N；
步骤2，建立隐性孔雀石绿标准品数据库V，用分析天平称取隐性孔雀石绿标准品，采用乙腈溶解标准品固体，配成标准储备液，再将标准储备液分别稀释成不同浓度的标 准品，采集全波长下的紫外-可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准隐性孔 雀石绿紫外-可见光谱数据库V；
步骤3，取市售鱼肉的可食部分，加入乙腈快速提取得到样品，在样品提取液中加入硼氢化钾粉末，将孔雀石绿完全转化成隐性孔雀石绿，采集待测鱼肉样品全波长下的 紫外-可见光谱数据，得到待测鱼肉样品光谱数据库c；
步骤4，采用向量-子空间夹角判据方法计算样品的隐性孔雀石绿总含量。
进一步的，所述本底数据库N的样品为不同品种的多个鱼肉样品，对应的本底数据库N为不同品种的多个鱼肉样品的光谱数据库的集合。
进一步的，所述向量-子空间夹角判据方法包括：
(1)根据定量精度设定扣减步数Δ；
(2)在算式yi＝aix+bi中带入较大的x1值，得到v1，yi表示i波长下隐性孔雀石绿的吸光度值，ai、bi指代常数，x表示隐性孔雀石绿的浓度，v1即为浓度为x1下隐性孔雀 石绿的多波长吸光度y1，v1是所有yi的值所组成的矩阵；
(3)从待测鱼肉样品光谱数据库c中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为dc；将本底数 据库N和变量dc合并，记为对照空间R，计算对照空间R与v1的夹角；
(4)从待测鱼肉样品光谱数据库c中一步一步扣除v1，重复步骤(3)，计算R与 v1夹角值；
(5)重复步骤(4)，当待测鱼肉样品光谱数据库c中隐性孔雀石绿完全被扣除后，对照空间R和v1的空间夹角会出现最大值θmax，记录θmax出现时所对应的扣减步数λmax， 通过隐性孔雀石绿的浓度x1和扣减步数λmax，计算待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量 y1；计算方法为y1＝x1×λmax/Δ，得到的y1值即为待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量； 若空间夹角所对应的扣减步数为1，或者空间夹角值随扣减步数单调递增或递减，则样 品中不含待测组分隐性孔雀石绿。
进一步的，所述液相色谱-光谱仪联用中的高效液相色谱的流动相为乙腈:乙酸-乙酸 铵缓冲溶液，乙腈:乙酸-乙酸铵体积比为70-80:20-30，pH为4.6。
进一步的，所述检测方法的隐性孔雀石绿检出限为100μg/kg，0.01μg/mL。
进一步的，所述快速提取，具体是样品加乙腈后在10000r/min匀浆机中匀浆，加酸性氧化铝(200-300目)净化，然后用快速混匀器振荡，在4000r/min高速离心机离心 5min，上清液过0.45um微孔滤膜。
进一步的，步骤1和步骤3中，1mL 10.0μg/mL的孔雀石绿可以完全转化成6.5μg/mL隐性孔雀石绿，孔雀石绿的转化当量为0.65，加入过量的硼氢化钾不影响隐性孔雀石绿 的含量。
进一步的，步骤1和步骤3中，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿后，样品应进行高速离心，取上清液进行检测。
本发明优点：
1、本发明首次提出了基于向量-子空间夹角判据对鱼肉中LMG的快速检测，用硼氢化钾粉末将MG完全转化为LMG后测定LMG总含量，转化率优于过氧化铅将LMG 转化为MG。解决了大量使用溶剂、耗时长的高效液相色谱的问题，对快速检测和现场 检测有很大的帮助。
2、本发明样品处理过程简单，耗时短，处理好样品后只要采集每一种样品的本底，并将所有本底合并成为一个大的本底数据库，就可以测定不同的鱼，该方法可以准确的 计算鱼肉中LMG的含量，将此方法推广到其他领域的前景非常乐观。
3、本发明的检测方法成本低，便于推广利用。
4、本发明用乙腈进行快速提取，提取效率高，杂质影响小，提取率优于国家标准的提取方法。
附图说明
图1为操作流程图；
图2为待测样本的向量-子空间夹角图示例；
图3为淡水鱼(MG水养)高效液相色谱图(260nm)；
图4为淡水鱼(MG水养)高效液相色谱图(610nm)；
图5为隐性孔雀石绿标准光谱；
图6为隐性孔雀石绿标准工作曲线；
图7为四种鱼(在含有MG的水中饲养)的样品紫外-可见光谱图；
图8为不同pH值流动相对样品中隐性孔雀石绿的影响(λ＝260nm)；
图9为不同pH值流动相对样品中孔雀石绿的影响(λ＝610nm)；
图10为草鱼加标(LMG)的液相-光谱联用多波长色谱图；
图11为草鱼本底二阶差分序列图(4组分)；
图12为禾花鱼本底的二阶差分序列图(4组分)；
图13为罗非鱼本底的二阶差分序列图(5组分)；
图14为黄蜂鱼本底的二阶差分序列图(5组分)；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。
一算法代码及本发明计算过程说明
MATLAB软件计算代码，对本发明计算过程做如下演示：
A＝sumabsorb(‘草鱼’)；(将“草鱼”样品光谱信号转化为不同时刻下的吸光度值赋值到 A)
B＝A(:,[1:3000 3400:6000])；(将A中的多波长光谱数据经B命令扣除待测组分LMG， 得到数据量庞大的本底数据库，将其赋值到B)
AG＝mynumi(B)；(对B进行主成分分析和降维，得到数据量小的本底光谱数据库)
[U,S,V]＝svd(B)；(对B本底进行奇异值分解)
K＝U(:,1:4)；(K：取B本底的1-4列作为计算LMG含量的本底数据库)
a＝K(:,1:4)；(a为本底，K即为本底库，1:4表示选取所对应草鱼本底库K的1-4列)
a＝a(40:350,:)；(LMG的波长选择为40:350行，和该范围下所有的列)
b＝biaozhun(40:350,:)；(b为标准品，biaozhun为LMG标准品光谱数据对应的文件 名)
c＝U(40:350,:)；(c指代待测样本，U为待测样品数据库对应的文件名)
v＝regmain(b,d)；(进行最小二乘拟合，d为LMG标准品所对应的浓度)
V＝v(:,1)+v(:,2)；(对标准紫外可见光谱仪数据和标准LMG的浓度用最小二乘法拟 合)
cn＝findc(a,V,c(:,n))；(计算向量-子空间夹角，n为待测样品所在的列数)
[x,y]＝max(cn)
高效液相色谱条件：
色谱柱为AgilentC18柱(5μm，250mm×4.6mm)；柱温为30℃，流速1mL/min，进 样量：20μL；乙腈∶0.02mol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH4.6)＝75∶25(V/V)；光 纤紫外可见光谱仪扫描波长为220～1100nm。
二实验方法
1研究流程：见附图1所示。
2样品前处理方法
将体内不含MG和LMG的空白鱼肉去掉鱼鳞、鱼皮和鱼骨头，取2.5g可食部分鱼 肉，加入10mL乙腈和1mL标准LMG，快提，即在10000r/min匀浆机中匀浆30s，加 2.5g酸性氧化铝(200-300目)净化，用快速混匀器振荡15s，在4000r/min高速离心机 离心5min后，上清液过0.45um微孔滤膜。得到稀释11倍标准品的样品。采集其 220-1100nm紫外可见光谱仪数据和高效液相色谱数据，并进行结果对比。
3向量-子空间夹角判据快速分析方法
3.1高效液相-紫外可见光纤光谱仪联用建立本底数据库N
将市场上买来的草鱼、黄蜂鱼、禾花鱼、罗非鱼活鱼，放在浓度为2.5ug/mL孔雀 石绿MG的水中养24h后，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，取2.5g鱼肉加10mL乙 腈，快提，即在10000r/min匀浆机中匀浆30s，加2.5g酸性氧化铝(200-300目)净化， 用快速混匀器振荡15s，在4000r/min高速离心机离心5min后上，上清液过0.45um微 孔滤膜。得到含有LMG和MG的样品提取液，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿MG转化 成隐性孔雀石绿LMG后，得到草鱼样品b1、黄蜂鱼样品b2、禾花鱼样品b3、罗非鱼 样品b4。
在最佳色谱条件下，将高效液相-紫外可见光纤光谱仪联用，采集样本b1、b2、 b3和b4完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分LMG的色谱数据， 得到数据量大的本底数据库B1-B4，分别对B1-B4进行主成分分析和奇异值分 解降低维度，合并得到数据量较少的本底数据库N。
3.2LMG标准品数据库V的建立
用分析天平准确称取0.0100gLMG的标准品，采用乙腈溶解标准品固体，转移至100mL容量瓶，定容，得到100μg/mL标准储备液，进而配成10μg/mL标准储备液，再 将10μg/mL的标准储备液分别稀释成0.2-8μg/mL的标准溶液，分别采集在220-1100nm 处的全波长紫外—可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准LMG紫外光谱数 据库V。
3.3鱼肉样品数据的采集
分别取2.5g四种鱼(四种活鱼放入含有MG的水中饲养)以及2.5g市售的四种鱼 鱼肉可食部分加10mL乙腈，快提，即在10000r/min匀浆机中匀浆30s，加2.5g酸性氧 化铝净化，用快速混匀器振荡15s，在4000r/min高速离心机离心5min后，上清液过 0.45um微孔滤膜，即得样品，采用向量—子空间夹角判据方法计算样品LMG含量，与 高效液相测定结果进行对比。
3.4数据处理方法
1)采用高效液相-紫外可见光谱仪联用的方法采集其全波长下的多波长光谱数据阵 列，扣除待测组分，建立不含待测组分LMG的空白本底库N；
2)采集标准LMG紫外可见光谱数据，建立标准紫外光谱数据库V；
3)采集待测鱼肉样品光紫外可见光谱仪谱数据，建立样品库c；
4)待测鱼肉样品中LMG的测定：
(1)根据定量精度设定扣减步数Δ(本实例设为1000)；
(2)在算式yi＝aix+bi中带入较大的x1值，得到v1；
yi表示i波长下隐性孔雀石绿的吸光度值，ai、bi指代常数，x表示隐性孔雀石绿 的浓度，v1即为浓度为x1下隐性孔雀石绿的多波长吸光度y1，v1是所有yi的值所组成的 矩阵；
(3)从待测鱼肉样品光谱数据库c中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为dc；将空白本 底数据库N和变量dc合并，记为对照空间R，计算对照空间R与v1的夹角；
(4)从待测鱼肉样品光谱数据库c中一步一步扣除v1，重复步骤(3)，计算R与 v1夹角值；
(5)重复步骤(4)，当待测鱼肉样品光谱数据c中隐性孔雀石绿完全被扣除后， 对照空间R和v1的空间夹角会出现最大值θmax，记录θmax出现时所对应的扣减步数λmax， 通过隐性孔雀石绿的浓度x1和扣减步数λmax，计算待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量 y1；计算方法为y1＝x1×λmax/Δ，得到的y1值即为待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量； 若空间夹角所对应的扣减步数为1，或者空间夹角值随扣减步数单调递增(递减)，则 样品中不含待测组分隐性孔雀石绿。计算得到的向量-子空间夹角示例图见图2所示。
5)MG的转化率实验
由于MG在人或动物体内会转化成LMG，为了更准确地测定鱼体内真实MG的含 量，本实验将MG转化成LMG测定。
在2.5g空白荷花鱼样品(不含孔雀石绿和隐性孔雀石绿)快提液中添加一定量的孔雀石绿和隐性孔雀石绿标准溶液，加入一定量的硼氢化钾粉末，考察硼氢化钾的用量 及孔雀石绿与隐性孔雀石的转化当量。
另外，在2.5g空白鱼肉的1mL提取液中加入已知浓度的孔雀石绿和隐性孔雀石绿标准溶液，加入0.8mg硼氢化钾粉末转化后，测定孔雀石绿和隐性孔雀石绿含量，按照 孔雀石绿的转化当量计算隐性孔雀石绿总含量。
7)样本中LMG测定的加标回收率实验
取2.5g不含MG和LMG的空白鱼肉和含已知LMG浓度的鱼肉可食部分切碎，加 10mL乙腈混匀，按照快提方法提取，得到空白样品和含有已知LMG浓度的样品。在 样品中添加一定量的标准LMG溶液，采集其220-1100nm下的紫外光谱数据，采用向 量-子空间夹角判据的方法，测定样品加标含量，计算加标回收率。
8)样本中LMG测定的稳定性实验
配制6μg/mL标准LMG，在220-1100nm波长下采集其紫外-可见光谱数据，置于可 见光处，放置的不同天数再分别采集其紫外-可见光谱数据，选择260nm下的吸光度值， 代入相应的标准工作曲线计算LMG标准溶液的浓度，考察LMG的稳定性。
9)样本中LMG测定的检出限实验
取3份体内不含MG以及LMG的空白禾花鱼可食部分2.5g，分别加10mL乙腈和 1mL0.25、2、4μg/mL标准LMG，快提。得到稀释11倍标准品的样品，采集其220-1100nm 紫外-可见光谱仪数据，用向量-子空间夹角判据方法计算LMG的含量，单位为μg/kg。
取0.5μg/mL的隐性孔雀石绿标准溶液，依次稀释，直至最大夹角值对应的扣减步数大于20，此时的浓度即为检出限，单位为μg/mL。
10)高效液相色谱流动相选择实验
样品制备：提取空白鱼肉。取空白草鱼鱼肉快速提取液，加入0.1μg/mL孔雀石绿标准液，用量1:1，轻轻摇匀，作为孔雀石绿样品。同样，另取空白鱼肉快速提取液， 加入0.2μg/mL隐性孔雀石绿标准液，用量1:1，轻轻摇匀，作为隐性孔雀石绿样品。
(1)流动相pH的选择
分别以乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH4.6)、水(pH7.0)、冰醋酸(0.02mol/L，pH3.2) 为考察对象，在高效液相色谱仪上分别检测隐性孔雀石绿标准液(0.2μg/mL)和孔雀石 绿标准液(0.1μg/mL)，分别考察两者的保留时间时长、峰面积大小和理论塔板数大小。
(2)流动相比例的选择
确定了最优流动相pH值后，在此条件下选取体积比分别为85:15、80:20、75:25、65:35、60:40和50:50依次改变流动相比例，分别检测孔雀石绿样品和隐性孔雀石绿样 品，分别考察两者保留时间、峰面积和理论塔板数。
四实验结果
1.样品前处理结果
分别取2.5g不含有LMG的市售草鱼、罗非鱼鱼肉可食部分切碎，加1mL浓度为 10μg/mL或4μg/mL标准LMG和10mL乙腈快提。得到理论上稀释11倍标准品的样品。 分别采集其220-1100nm紫外-可见光谱仪数据并和高效液相数据结果对比，采用向量- 子空间夹角判据计算，结果如表3所示，本发明提出的快提法对样品的前处理效果好， 提取率为91％-105％之间，对于罗非鱼(市售)样本该方法RSD小于5％，重复性好， 可靠性强，可用于快速提取鱼肉中LMG的含量。
表3样本中LMG的提取率实验
2.向量-子空间数据模型的建立及计算结果
2.1高效液相-紫外可见光谱仪联用建立本底数据库N
将草鱼、禾花鱼、黄蜂鱼、罗非鱼活鱼，放在浓度为2.5μg/mL MG的水中养24h 后，可食部分去鳞，去皮，取2.5g鱼肉加10mL乙腈快提，然后加入2.5g酸性氧化铝 净化，涡旋混合后，在提取液中加入0.8mg硼氢化钾粉末，4000r/min离心5min,取上层 清液，经0.45μm有机滤膜过滤备用。将液相—光谱联用，得到数据量巨大的多波长色 谱数据阵列b1-b4，从中查看260nm对应的色谱图如图3所示，610nm对应的色谱图如 图4所示。将各种鱼的多波长色谱数据阵列中扣除与待测组分LMG具有相同保留时间 的数据阵列，得到不含有LMG的本底数据库B1-B4。
由液相—光谱联用获得数据量巨大的本底数据库B1-B4，直接采用该本底计算会导 致运算时间长，影响该方法的时效性，为使数据降维后不失真，降维前，本实验采用系统独立变量数的方法确定主成分数，对系统添加40分贝的白噪声除去数据中的噪声和 冗余的维数，得到的主成分数目和二阶差分值变化如图11-14所示，分别含有4、4、5 和5种主成分，共18种主成分数，冲柱子的主成分数重复以上操作方法，得到17种主 成分数，将四种鱼和冲柱子所得的主成分数合并，一共得到34种主成分数B。将数据 库B进行奇异值分解，取降解后的1-34列作为计算LMG的本底，即为降解后的本底数 据库N。
2.2LMG标准品数据库V的建立
将100μg/mL LMG用乙腈分别稀释成0.2μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、 8μg/mL的标准LMG溶液，分别采集其在220nm～1100nm波长下的紫外—可见光谱仪 数据，建立标准品光谱数据库并命名为：biaozhun。标准工作曲线的线性方程、相关系 数和线性范围分别为：y＝0.0946x-0.00754；R2＝0.9994；0.2—8μg/mL，光谱图和标准曲 线见附图5-6。草鱼加标(LMG)的液相-光谱联用多波长色谱图见附图10。
2.3鱼肉样品光谱数据c的采集及计算结果
取2.5g上述样品(四种活鱼放入含有MG的水中饲养)以及2.5g市售的四种鱼鱼 肉可食部分加10mL乙腈，快提，单独采集放MG水养的样品光谱如图7所示，采用向 量—子空间夹角判据方法计算样品LMG含量，与高效液相测定结果进行对比如下表4 所示。按相同方法，其余市售样品快提后直接采集220-1100nm光谱数据即可进行定量 分析。
表4两种方法对样品LMG含量计算结果的对比
结果如表4所示，两种计算方法的|SD％|<9.52％，由此说明基于向量—子空间夹角 判据，直接采集样品光谱即可快速计算样品含量，计算准确，与色谱分析相比，极大缩短了时间。
3.MG的转化率实验
在空白荷花鱼样品(不含孔雀石绿和隐性孔雀石绿)提取液中添加一定量的孔雀石 绿和隐性孔雀石绿标准溶液，加入一定量的硼氢化钾粉末，考察硼氢化钾的用量及孔雀石绿(MW:463.5)与隐性孔雀石(MW:330.5)的转化当量如表5所示。结果显示加入 微量硼氢化钾粉末0.8mg，孔雀石绿即可完全转化为隐性孔雀石绿，转化当量为0.65， 加入过量的硼氢化钾不影响隐性孔雀石绿的含量。
表5孔雀石绿与隐性孔雀石绿的转化当量
在空白鱼肉提取液中加入已知浓度的孔雀石绿和隐性孔雀石绿标准溶液，加入0.8mg硼氢化钾粉末转化后，测定孔雀石绿和隐性孔雀石绿含量，按照0.65的转化当量 计算隐性孔雀石绿总含量，回收率大于90％如表6所示，计算结果准确，进一步验证了 孔雀石绿完全转化为隐性孔雀石绿的转化当量为0.65。
表6鱼肉中孔雀石绿的转化结果
4.LMG的精密度实验
取已知LMG浓度的表4的草鱼2#(市售)和黄蜂鱼2#(市售)样品和浓度为4μg/mL 的标准LMG溶液平行采集5次紫外可见光谱数据，用向量-子空间夹角判据计算LMG 的含量，结果如表7所示，RSD≤3.11％，说明该方法可信，精密度良好。
表7 LMG精密度实验
5.LMG的加标回收率实验
分别取表4的草鱼1#(市售)、黄蜂鱼1#(市售)、禾花鱼2#(市售)、黄蜂鱼 2#(市售)、草鱼2#(市售)和罗非鱼2#(市售)样品各1mL于2mL容量瓶中，在 样品中添加一定量的LMG标准溶液，用乙腈定容到2mL，采集其220-1100nm下的光 谱数据，运用向量—子空间夹角判据方法，计算样品加标回收率，计算结果如表8所示 LMG加标回收率在90.00—104.00％之间，说明该方法计算结果回收率高，准确度高， 可靠性强。
表8 LMG加标回收率实验
6.LMG的稳定性实验
配制6μg/mL标准LMG，在220-1100nm波长下采集其紫外光谱数据，置于可见光 处，放置不同天数再分别采集其紫外-可见光谱数据，选择260nm下的吸光度值，代入 标准工作曲线计算LMG标准溶液的浓度，计算结果如表9所示，RSD值为3.48％，表 明LMG在一定时间内稳定性良好。
表9 6ug/mL标准LMG不同时间测得的浓度
7.检出限实验
取3份体内不含MG和LMG的空白禾花鱼可食部分2.5g，分别加10mL乙腈和1mL0.25、2、4μg/mL标准LMG溶液，快提。得到稀释11倍标准品的样品，采集其220-1100nm 紫外-可见光谱仪数据，运用向量-子空间夹角判据计算LMG的含量，计算结果如表10 所示，结果表明鱼肉样品加0.25μg/mL标准LMG时，用向量的方法依旧能检测出来， 检出限为100μg/kg。
取0.5μg/mL的隐性孔雀石绿标准溶液，依次稀释，直至最大夹角值对应的扣减步数大于20，此时的检出限浓度为0.01μg/mL。
表10 LMG的检出限实验
8高效液相色谱流动相条件选择
8.1流动相的最佳pH值
8.1.1流动相的最佳pH值对隐性孔雀石绿检测的影响
分别以0.02mol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH4.6)、水(pH7.0)、冰醋酸(0.02mol/L，pH3.2)为流动相，考察对检测隐性孔雀石绿标准液(0.2μg/mL)的影响。
由表11的数据和图8分析可知，在以乙腈-水(pH7.0)为流动相时，保留时间最 长，理论塔板数最小，基线上下波动较大，存在倒峰且峰形杂乱无章，影响实验结果； 在以乙腈-冰醋酸(0.02mol/L，pH3.2)为流动相时，保留时间有所提前，理论塔板数最 大但峰面积略小；在以乙腈-乙酸铵缓冲溶液(pH4.6)为流动相时，保留时间居中，峰 面积最大，理论塔板数较大，乙腈-乙酸铵缓冲溶液在三者中与基线最为贴合，隐性孔 雀石绿与其它杂质峰可完全分离，峰形尖锐对称。
综合来看，流动相采用pH4.6的乙腈-乙酸铵缓冲溶液，对隐性孔雀石绿的检测效果最佳。
表11不同pH值对隐性孔雀石绿检测的影响
8.1.2流动相不同pH值对孔雀石绿检测的影响
分别以乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH4.6)、水(pH7.0)、冰醋酸(0.02mol/L，pH3.2) 为流动相，考察对检测孔雀石绿标准液(0.1μg/mL)的影响。
由表12的数据和图9分析可知，在以乙腈-水(pH7.0)为流动相时，保留时间最 短，理论塔板数最小，峰型拖尾，由于保留时间的提前，样品中其他杂质组分与孔雀石 绿不能完全分离，分离效果不好，影响实验结果的分析；在以乙腈-冰醋酸(0.02mol/L， pH3.2)为流动相时，保留时间有所延迟，但样品中其他杂质组分与孔雀石绿仍然不能 完全分离，理论塔板数小；在以乙腈-乙酸铵(pH4.6)为流动相时，峰面积和理论塔板 数最大，峰形尖锐对称，保留时间延迟但分离效果最好，孔雀石绿色谱峰能与杂峰完全 分离。
综合来看，流动相采用pH4.6的乙腈-乙酸铵缓冲溶液，对孔雀石绿的检测结果最理想。
表12不同pH值对孔雀石绿检测的影响
8.2流动相的最佳比例
选取体积比分别为85：15、80：20、75：25、65：35、60：40和50：50依次改变 流动相比例，考察流动相比例对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的影响。
从表13和表14中可以看出，随着乙腈用量的增加，保留时间缩短，峰面积增大， 但是理论塔板数减小。保留时间过早，会使得样品中其他杂质组分与被测组分不能完全 分离，分离效果不好，影响实验结果；理论塔板数过小也都会对实验结果造成不良影响。 综合考虑，流动相最佳比例为乙腈：乙酸铵＝75：25(V/V)。
表13隐性孔雀石绿检测的流动相比例考察
表14孔雀石绿检测的流动相比例考察
五结论和讨论
本发明通过优化鱼肉的提取制作样品，采用高效液相-紫外可见光谱仪联用的方法， 经高效液相色谱仪分离出鱼肉中的待测组分以及背景组分，再从液相色谱数据扣除鱼肉 中的LMG的色谱峰数据，即可得到不含待测组分LMG的本底数据库。对数据库主成 分分析和奇异值分解降维后得到数据量较小，便于运算的数据库。运用向量-子空间夹 角判据算法计算鱼肉中LMG的含量，该方法结果和高效液相色谱法计算所得结果相接 近，加标回收率在90.00-104.00％之间；精密度RSD≤3.11％。
乙腈对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的提取率分别为：47％-52％和91％～105％；最佳 色谱条件为乙腈：乙酸-乙酸铵缓冲溶液(V/V)(pH4.6)＝75:25(pH4.6)。
隐性孔雀石绿检测方法中，孔雀石绿可以完全转化为隐性孔雀石绿后进行同时测定， 同时检测波长为260nm；硼氢化钾的转化效率高，仅需微量0.8mg即可将1mL10μg/mL 的孔雀石绿完全转化为6.5μg/mL隐性孔雀石绿，转化当量为0.65，已满足市场淡水鱼 中孔雀石绿转化的检测要求，过量硼氢化钾不会影响隐性孔雀石绿含量的检测，转化率 实验的加标回收率是90％以上，方法准确可信，这为二者的同时测定提供了依据，提高 了分析效率。硼氢化钾粉末不溶于乙腈，样品过滤后减少了金属阳离子及离子强度对色 谱柱的损害。
该方法样品前处理过程简单，耗时短，处理好样品后只要采集每一种样品的本底，并将所有本底合并成为一个大的本底数据库，就可以测定不同的鱼，该方法可以准确的 计算鱼肉中LMG的含量，避免了高效液相色谱法的耗时大，耗溶剂多的麻烦，用于现 场快速检测方面有很大的帮助，将此方法推广到其他领域的前景是非常乐观的。
本发明实验应该注意的有以下2点：
1.由于MG在人体或动物体内会转化成LMG，为了避免所测得LMG的值偏小导 致不能准确判断LMG的含量是否超标，本实验采用把MG转化为LMG的方法，计算 LMG的含量，即能更加准确的计算鱼肉中真实的LMG的含量。
2.在样品稀释、加标回收率实验的过程中，由于乙腈含量增大，鱼肉样品中水溶性杂质的溶解度降低，会出现浑浊现象，致使采集紫外-可见光谱仪数据时基线不归零 的问题，导致计算错误。本实验采用的方法是在4000r/min高速离心机离心5min，取上 清液采集紫外-可见光谱数据。加入硼氢化钾粉末转化后也需要进行高速离心使基线归 零。

Claims (8)

1.淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，其特征在于，包括：
步骤1，将淡水鱼放在含有孔雀石绿的水中培养24h，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，鱼肉中加入乙腈，快速提取，得到含有隐性孔雀石绿和孔雀石绿的样品，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿；
将液相色谱-光谱仪联用，采集完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分隐性孔雀石绿的色谱数据，得到数据量大的本底数据库B，对B进行主成分分析和奇异值分解降低维度，得到数据量小的本底数据库N；
步骤2，建立隐性孔雀石绿标准品数据库V，用分析天平称取隐性孔雀石绿标准品，乙腈溶解，配成标准储备液，再将标准储备液分别稀释成不同浓度的标准品，采集全波长下的紫外-可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准隐性孔雀石绿紫外-可见光谱数据库V；
步骤3，取市售鱼肉的可食部分，加入乙腈快速提取得到样品，在样品提取液中加入硼氢化钾粉末，将孔雀石绿完全转化成隐性孔雀石绿，采集待测鱼肉样品全波长下的紫外-可见光谱数据，得到待测鱼肉样品光谱数据库c；
步骤4，采用向量-子空间夹角判据方法计算样品的隐性孔雀石绿总含量。
2.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：所述本底数据库N的样品为不同品种的多个鱼肉样品，对应的本底数据库N为不同品种的多个鱼肉样品的光谱数据库的集合。
3.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于，所述向量-子空间夹角判据方法包括：
(1)根据定量精度设定扣减步数Δ；
(2)在算式yi＝aix+bi中带入较大的x1值，得到v1，yi表示i波长下隐性孔雀石绿的吸光度值，ai、bi指代常数，x表示隐性孔雀石绿的浓度，v1即为浓度为x1下隐性孔雀石绿的多波长吸光度y1，v1是所有yi的值所组成的矩阵；
(3)从待测鱼肉样品光谱数据库c中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为dc；将本底数据库N和变量dc合并，记为对照空间R，计算对照空间R与v1的夹角；
(4)从待测鱼肉样品光谱数据库c中一步一步扣除v1，重复步骤(3)，计算R与v1夹角值；
(5)重复步骤(4)，当待测鱼肉样品光谱数据库c中隐性孔雀石绿完全被扣除后，对照空间R和v1的空间夹角会出现最大值θmax，记录θmax出现时所对应的扣减步数λmax，通过隐性孔雀石绿的浓度x1和扣减步数λmax，计算待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量y1；计算方法为y1＝x1×λmax/Δ，得到的y1值即为待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量，若空间夹角所对应的扣减步数为1，或者空间夹角值随扣减步数单调递增或递减，则样品中不含待测组分隐性孔雀石绿。
4.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：所述液相色谱-光谱仪联用中的高效液相色谱的流动相为乙腈:乙酸-乙酸铵缓冲溶液，乙腈:乙酸-乙酸铵体积比为70-80:20-30，pH为4.6。
5.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：所述检测方法的隐性孔雀石绿检出限为100μg/kg，0.01μg/mL。
6.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：所述快速提取，具体是样品加乙腈后在10000r/min匀浆机中匀浆，加酸性氧化铝(200-300目)净化，然后用快速混匀器振荡，在4000r/min高速离心机离心5min，上清液过0.45um微孔滤膜。
7.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：步骤1和步骤3中，1mL 10μg/mL的孔雀石绿可以完全转化成6.5μg/mL隐性孔雀石绿，孔雀石绿的转化当量为0.65，加入过量的硼氢化钾不影响隐性孔雀石绿的含量。
8.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：步骤1和步骤3中，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿后，样品应进行高速离心，取上清液进行检测。
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