CN103675147A - 一种饮料中咖啡因的快速测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据；扣除饮料样本色谱数据中与咖啡因标准溶液中具有相同出峰保留时间的数据；合并多个饮料样本并扣除待测组分的色谱数据，得到不含咖啡因组分的本底光谱数据库，计算主成分数目；用奇异值分解结合主成分数目对本底数据库降维，即可得到数据量较小的本底数据库；运用空间夹角判据计算饮料样本中待测组分的含量，从而实现饮料样本中咖啡因的定量。本发明分析效率高、操作强度小，分析成本低，可降低机时和试剂损耗，稳健性好，方法简单，非常适合于同类大批量样本的快速分析测定。

Description

一种饮料中咖啡因的快速测定的方法

技术领域

本发明属于咖啡因含量测定技术领域，尤其涉及一种饮料中咖啡因的快速测定的方法。

背景技术

咖啡因又称咖啡碱，化学名为1，3，7-三甲基黄嘌呤，溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶剂，具有促进血液流通、消除疲劳、兴奋中枢神经等功能，但是过量添加也可引起局部缺血性心脏病，造成心律不齐。咖啡因广泛添加于功能性红牛饮料和可乐型饮料如可口可乐及百事可乐中，因此咖啡因含量也是衡量饮料品质的重要指标。食品中咖啡因的测定方法很多，有离心萃取-紫外光谱法、紫外二阶导数光谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法等。紫外分光光度法需用氯仿萃取，而薄层色谱法样品预处理也比较麻烦，高效液相色谱法具有样品处理简单，测定结果准确的优点，但是每测定一个样品需要十几分钟的时间，大批量样本的分析效率低，操作强度大，流动相等试剂损耗大，分析成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，旨在解决现有饮料中咖啡因检测方法分析效率低、操作强度大以及分析成本高的问题。

本发明是这样实现的，一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，包括以下具体步骤：

采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据；

将所述饮料样本的色谱数据中与咖啡因标准溶液具有相同出峰时间的色谱数据扣除，将剩余色谱数据存为本底光谱数据库并将多个本底光谱数据库合并为本底光谱数据库W；计算主成分数目q；用奇异值分解结合主成分数目q对本底光谱数据库W降维，得到数据量较小的本底光谱数据库N；

获取咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v；

获取饮料样本的光谱数据a；

将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中咖啡因的实际含量。

优选地，所述采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据包括以下具体步骤：

将饮料样本经高效液相色谱分析，采集多个饮料样本的多波长光谱数据，该光谱数据为波长、时间和光强度构成的数据阵列；

将咖啡因标准溶液经高效液相色谱分析，采集待测组分的多波长光谱数据，该光谱数据为波长、时间和光强度构成的数据阵列；

分别将采集所得的饮料样本和咖啡因标准溶液的多波长光谱数据由光强数据格式转化成不同时间下多波长下的吸光度值。

优选地，所述计算主成分数目q包括以下具体步骤：

在饮料样本光谱中添加白噪声蔽不均匀噪声和非线性因素的干扰，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q。

优选地，所述用奇异值分解结合主成分数目q对本底光谱数据库W降维，得到数据量较小的本底光谱数据库N包括以下具体步骤：

应用函数[U，S，V]=svd（W）对本底光谱数据库W进行奇异值分解降维，分解后得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V以及奇异值矩阵S，取U的前q列，为降维后的本底数据库N。

优选地，所述获取咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v包括以下具体步骤：

分别配制一系列不同浓度咖啡因标准溶液，分别记录各溶液的浓度和190nm～380nm波长范围光谱，将不同浓度的咖啡因标准溶液的多波长光谱数据记入标准光谱数据库，选择190nm～380nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v。

优选地，所述获取饮料样本的光谱数据a包括以下具体步骤：

将所述饮料样本定量定容后，依照吸光度的线性范围，采用多波长紫外-可见光纤光谱仪进行光谱测量，得到饮料样本的光谱数据a。

优选地，将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中待测组分的实际含量包括以下具体步骤：

（1）依据定量精度设定扣减步长Δ；

（2）在函数y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；其中，所述的y_i表示在i波长下咖啡因的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示咖啡因标准溶液中咖啡因的浓度，v₁表示在浓度为x₁时咖啡因的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

（3）从所述饮料样本的光谱数据a中扣除v₁/Δ，扣除后的变量为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

（4）从待测饮料样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤（3）；

（5）当所述饮料样本中的咖啡因组分完全被扣除后，比对空间M和待测组分的光谱向量v₁空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过咖啡因标准溶液浓度x1和扣减步数λ，计算饮料样本中咖啡因的含量Y₁，用函数关系定义为：Y₁=x₁×λ/Δ；

（6）比较Y₁值与x₁值的差值，该差值大于误差允许范围，则带入一个与Y₁值相接近的x₂进入步骤（2）中重新计算。

本发明克服现有技术的不足，提供一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，通过采用高效液相色谱仪和光纤光谱仪联用，采集待测组分咖啡因的多波长色谱数据和含有咖啡因的功能性红牛饮料以及可口可乐、百事可乐饮料的多波长色谱数据；分别从几个饮料样本的色谱数据中扣除与待测组分咖啡因具有相同保留时间的数据后，合并得到不含待测组分咖啡因的本底数据库；采用奇异值分解结合主成分数目对该数据库降维，得到数据量较小的本底数据库；采用光纤光谱仪获取系列浓度的咖啡因的光谱数据，建立标准光谱数据；最后运用空间夹角判据计算功能性红牛饮料中待测组分咖啡因的含量以及可乐型饮料中咖啡因的含量。本发明分析效率高、操作强度小，分析成本低，无需积累不含被测组分的本底数据库，可降低机时和试剂损耗，稳健性好，方法简单，非常适合于同类大批量样本的快速分析测定。

附图说明

图1是本发明实施例中饮料中咖啡因的快速测定的方法的流程示意图；

图2是本发明实施例中经过数据转化后的红牛样本稀释10倍的三维谱图；

图3是本发明实施例中经过数据转化后的可乐样本三维谱图；

图4是本发明实施例中咖啡因对照品在270nm处的高效液相色谱图；

图5是本发明实施例中红牛样本在270nm处的高效液相色谱图；

图6是本发明实施例中可乐样本在270nm处的高效液相色谱图；

图7是本发明实施例中空间夹角值与扣减步数之间的曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，如图1所示，包括以下具体步骤：

S1、采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据

在步骤S1中，更具体包括以下操作步骤：

S1-A、饮料样本的处理

将市售可口可乐和百事可乐超声脱气20分钟后，稀释10～20倍；功能性红牛饮料无须脱气，稀释10～20倍。

S1-B、本底光谱数据库的建立

S1-B1、获取饮料样本的光谱数据：

将步骤S1-A制得的饮料滤液经高效液相色谱-多波长光纤光谱仪联用，采集多个饮料样本的多波长光谱数据；

S1-B2、获取待测组分咖啡因的标准光谱数据：

配制2μg/mL～20μg/mL咖啡因标准溶液，过滤后经高效液相色谱-多波长光纤光谱仪联用，获取被测组分咖啡因的多波长光谱数据。

步骤S1-B1、S1-B2中高效液相色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；

梯度洗脱，流动相：

0.01～13.00min，乙腈：0.02mol/LH₃PO₄-NaH₂PO₄（pH2.6）溶液=15:85（V/V）；

13.01～25.00min，乙腈：0.04mol/L乙酸铵水溶液（pH6.5）=15:85（V/V）；

25.01～45.00min，乙腈：0.02mol/LH₃PO₄-NaH₂PO₄（pH2.6）溶液=35:65（V/V）；

45.01～70.00min，乙腈：0.04mol/L乙酸铵水溶液（pH6.5）=40:60（V/V）

流速1mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃；紫外检测波长：190～380nm。

S1-B3、转化数据格式：

将步骤S1-B1和S1-B2中采集所得的饮料样本的多波长光谱数据和待测组分咖啡因的多波长光谱数据由光强数据格式转化成不同时间下多波长下的吸光度值，转化后的数据的每一行代表一个波长下的色谱数据，每一列代表一个时刻下洗脱出来物质的光谱数据，如图2和3所示，其中，图2是经过数据转化后的红牛样本稀释10倍的三维谱图；图3是经过数据转化后的可乐样本三维谱图。

S2、将所述饮料样本的色谱数据中与咖啡因标准溶液具有相同出峰时间的色谱数据扣除，将剩余色谱数据存为本底光谱数据库并将多个本底光谱数据库合并为本底光谱数据库W；计算主成分数目q；用奇异值分解结合主成分数目q对本底光谱数据库W降维，得到数据量较小的本底光谱数据库N

在步骤S2中，具体的包括以下具体步骤：

S2-A、获取不含待测组分的背景的光谱数据：

确定被测组分、被测组分与本底组分完全分离的高液相色谱条件。在此条件下对样本进行分析，得到待测的饮料样本和咖啡因对照品的高效液相色谱图。图4为咖啡因对照品在270nm处的高效液相色谱图，咖啡因的出峰时间为9.150min。

图5为红牛样本在270nm处的高效液相色谱图。经分析对比，图5中A为咖啡因，其他的色谱峰为红牛样本中相对于咖啡因的本底物质。图6为可乐样本在270nm处的高效液相色谱图。经分析对比，图6中A为咖啡因，其他的色谱峰为可口可乐样本中相对于咖啡因的本底物质。从饮料样本的色谱图中扣除与咖啡因标准物质具有相同保留时间的光谱数据，其余数据存入光谱数据库中；合并多个饮料样本的本底光谱数据库构成光谱数据库W。

S2-B、本底光谱数据库的降维

W数据量大，会导致计算量很大，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q，应用[U，S，V]=svd（W）对W进行奇异值分解，根据体系主成分数目将光谱数据库W降到适当的维数，得到本底光谱数据库N。其中，体系主成分数目q确定的方法为：

在饮料样本光谱中添加一定强度的白噪声蔽不均匀噪声和非线性因素的干扰，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q。

S3、获取咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v

分别配制一系列浓度2μg/mL～20μg/mL的咖啡因标准溶液，分别记录各溶液的浓度和190nm～380nm波长范围光谱，记入标准光谱数据库。选择190nm～380nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到咖啡因的标准光谱数据库v。

S4、获取饮料样本的光谱数据a

取步骤S1-A处理后制得的饮料，经0.22μm滤膜过滤，滤液依照吸光度的线性范围，定量移取滤液，用水稀释定容至5～25mL容量瓶中，采用多波长紫外-可见光纤光谱仪进行光谱测量，得到待测饮料样本光谱数据a；

S5、将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及样本光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中咖啡因的实际含量

在步骤S5中，分别将上述步骤中得到的本底光谱数据库N、标准光谱数据库v、待测饮料样本光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法测定待测饮料样本中咖啡因的实际含量。

更具体的，步骤S5包括以下具体步骤：

（1）依据定量精度设定扣减步长Δ；

（2）在函数y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；其中，所述的y_i表示在i波长下咖啡因的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示咖啡因标准溶液中咖啡因的浓度，v₁表示在浓度为x₁时咖啡因的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

（3）从所述饮料样本的光谱数据a中扣除v₁/Δ，扣除后的变量为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

（4）从待测饮料样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤（3）；

（5）当所述饮料样本中的咖啡因组分完全被扣除后，比对空间M和待测组分的光谱向量v₁空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过咖啡因标准溶液的浓度x₁和扣减步数λ（如图7所示，图7为空间夹角值与扣减步数之间的曲线图，由图7可以看出，出现最大夹角是的扣减步数为968），计算饮料样本中咖啡因的含量Y₁，用函数关系定义为：Y₁=x₁×λ/Δ；

（6）比较Y₁值与x₁值的差值，该差值大于误差允许范围，则带入一个与Y₁值相接近的x₂进入步骤（2）中重新计算。

为了验证本发明测定结果的准确性，选择了市售的红牛饮料和可口可乐、百事可乐饮料，通过高效液相色谱-多波长光纤光谱仪联用建立本地数据库后，用本发明之饮料中咖啡因的快速测定方法测定饮料样本中咖啡因的含量，并和高效液相色谱法结果比较，实验结果如表1所示：

表1两种方法测定饮料中咖啡因的含量

由表1可以看出，本发明之饮料中咖啡因的测定结果与高效液相色谱法测定结果比较，相对误差为-2.20%～0.00%，说明本发明方法准确可靠。

本发明还进行了加标回收率实验，将红牛样品稀释20倍，将可乐样品稀释10倍后，分别加入一定量的标准品，结果如表2所示。

表2样品加标回收率实验

由表2可以看出，采用本发明进行样品加标回收实验，回收率为96.7%～106%，证明方法准确可靠。

相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

（1）分析效率高、操作强度小

由于本发明采用紫外可见多波长直接测定，直接定量咖啡因，不需要分离时间，而且样本测量及定量计算时间小于10秒，其分析效率较高，操作强度较小，非常适合于同类大批量样本的快速分析测定，易于推广应用。

（2）分析成本低

由于本发明是基于本底光谱集、待测光谱和样本光谱间矩阵向量角标准，通过逐量扣减方式实现定量，可以采用最常见的一阶光谱仪器的输出数据，没有对数据维数提出特别要求，因此，本发明无需特殊仪器设备。对于同类样品的测定，本发明在进行一次色谱分离后，无需再利用联用仪器累积本底，仅通过光谱测量即可实现定量，从而可降低机时和试剂损耗。

（3）不含被测组分的本底数据库建库工作量降低

由于红牛饮料和可乐饮料的原料复杂，收集各种原料配制本底会存在建库不全的缺点，影响分析精度和方法的适用性，因此本发明提出借助高效液相色谱-光谱联用方法，分离测取饮料样本各个色谱时刻的一维谱后，进行分类，获得不含被测组分的本底数据，结合向量-子空间夹角判据算法实现样本中被测组分的分析。因此，本发明无需积累不含被测组分的本底数据库，不仅减小了工作量，而且也提高了分析精度，扩大了方法的适用性。

（4）稳健性好

本发明与现有的单波长、双波长及若干个波长方法相比，抗干扰能力强，可辨识复杂光谱程度高，稳健性好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据；

将所述饮料样本的色谱数据中与咖啡因标准溶液具有相同出峰时间的色谱数据扣除，将剩余色谱数据存为本底光谱数据库并将多个本底光谱数据库合并为本底光谱数据库W；计算主成分数目q；用奇异值分解结合主成分数目q对本底光谱数据库W降维，得到数据量较小的本底光谱数据库N；

获取咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v；

获取饮料样本的光谱数据a；

将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中咖啡因的实际含量。

2.如权利要求1所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，所述采集饮料样本以及咖啡因标准溶液的多波长色谱数据包括以下具体步骤：

将饮料样本经高效液相色谱分析，采集多个饮料样本的多波长光谱数据，该光谱数据为波长、时间和光强度构成的数据阵列；

将咖啡因标准溶液经高效液相色谱分析，采集待测组分的多波长光谱数据，该光谱数据为波长、时间和光强度构成的数据阵列；

分别将采集所得的饮料样本和咖啡因标准溶液的多波长光谱数据由光强数据格式转化成不同时间下多波长下的吸光度值。

3.如权利要求2所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，所述计算主成分数目q包括以下具体步骤：

在饮料样本光谱中添加白噪声蔽不均匀噪声和非线性因素的干扰，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q。

4.如权利要求3所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，所述用奇异值分解结合主成分数目q对本底光谱数据库W降维，得到数据量较小的本底光谱数据库N包括以下具体步骤：

应用函数[U，S，V]=svd（W）对本底光谱数据库W进行奇异值分解降维，分解后得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V以及奇异值矩阵S，取U的前q列，为降维后的本底数据库N。

5.如权利要求4所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，所述获取咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v包括以下具体步骤：

分别配制一系列不同浓度咖啡因标准溶液，分别记录各溶液的浓度和190nm～380nm波长范围光谱，将不同浓度的咖啡因标准溶液的多波长光谱数据记入标准光谱数据库，选择190nm～380nm波长范围光谱，经多变量最小二乘回归后得到咖啡因标准溶液的标准光谱数据库v。

6.如权利要求5所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，所述获取饮料样本的光谱数据a包括以下具体步骤：

将所述饮料样本定量定容后，依照吸光度的线性范围，采用多波长紫外-可见光纤光谱仪进行光谱测量，得到饮料样本的光谱数据a。

7.如权利要求6所述的饮料中咖啡因的快速测定的方法，其特征在于，将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中待测组分的实际含量包括以下具体步骤：

（1）依据定量精度设定扣减步长Δ；

（2）在函数y_i＝a_ix+b_i中带入较大的x₁值，得到v₁；其中，所述的y_i表示在i波长下咖啡因的吸光度值，a_i、b_i是常数，x表示咖啡因标准溶液中咖啡因的浓度，v₁表示在浓度为x₁时咖啡因的多波长吸光度值y₁，v₁为所有的y_i值组成的矩阵；

（3）从所述饮料样本的光谱数据a中扣除v₁/Δ，扣除后的变量为da；把本底光谱数据库N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v₁夹角；

（4）从待测饮料样本光谱数据a中逐步扣除v₁后，重复步骤（3）；

（5）当所述饮料样本中的咖啡因组分完全被扣除后，比对空间M和咖啡因的光谱向量v₁空间夹角值会出现最大值θ_max，记录空间夹角最大值θ_max出现时对应的扣减步数λ，通过咖啡因标准溶液的浓度x₁和扣减步数λ，计算饮料样本中咖啡因的含量Y₁，用函数关系定义为：Y₁=x₁×λ/Δ；

（6）比较Y₁值与x₁值的差值，该差值大于误差允许范围，则带入一个与Y₁值相接近的x₂进入步骤（2）中重新计算。

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