CN110205263A - 光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用 - Google Patents

光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用,光合细菌类球红细菌菌株为光合细菌类球红细菌A13(Rhodobacter sphaeroidesA13),其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No:M 2018605。本发明的光合细菌类球红细菌菌株,光合细菌类球红细菌A13的培养工艺简单、培养时间短、成本低,且光合细菌类球红细菌菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到水稻细菌性条斑病防控的生防菌剂及生防发酵液。

Description

光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域,特别地,涉及一种光合细菌类球红细菌菌株。此外,本发明还涉及一种包括上述光合细菌类球红细菌菌株的菌剂药剂及其制备方法和应用。
背景技术
水稻细菌性条斑病又称细条病、条斑病,主要为害叶片。病斑初为暗绿色水浸状小斑,很快在叶脉间扩展为暗绿至黄褐色的细条斑,大小约1×10mm,病斑两端呈浸润型绿色。病斑上常溢出大量串珠状黄色菌脓,干后呈胶状小粒。发病严重时条斑融合成不规则黄褐至枯白大斑,与白叶枯类似,但对光看可见许多半透明条斑。病情严重时叶片卷曲,田间呈现一片黄白色。病原为:Xanthomonasoryzae pv.oryzicola(Fang,Ren,Chu,Faan,Wu)Swings 称稻生黄单胞菌条斑致病变种,属黄单胞杆菌属细菌。
水稻条斑病菌属于原核生物界(Procaryotes),薄壁细菌门(Gracilicutes),黄单胞菌科黄单胞菌属(Xanthomonas)的稻黄单胞菌。菌体单生,短杆状,大小1~2×0.3~0.5μm,极生鞭毛一根,革兰氏染色阴性,不形成芽孢荚膜,在肉汁胨琼脂培养基上菌落圆形,周边整齐,中部稍隆起,蜜黄色。生理生化反应与白叶枯菌相似,不同之处该菌能使明胶液化,使牛乳胨化,使阿拉伯糖产酸,对青霉素、葡萄糖反应钝感,水稻细菌性条斑病菌生长适温28℃~ 30℃。水稻细菌性条斑病菌与水稻白叶枯病菌的致病性和表现性状虽有很大不同,但其遗传性状及生理生化性状又有很大相似性,故该菌应作为水稻白叶枯病菌种内的一个变种。病田收获的种子、病残株都带病菌,可成为下季初侵染的主要来源。病粒播种后,病菌侵害幼苗的芽鞘和叶梢,插秧时又将病秧带入本田,病菌主要通过气孔侵染。在夜间潮湿条件下,病斑表面溢出菌脓。干燥后成小的黄色珠状物,可借风、雨、露水、泌水叶片接触和昆虫等蔓延传播,也可通过灌溉水和雨水传到其他田块。远距离传播通过种子调运。粳稻通常较抗病,而籼稻品种大多感病,受害严重。
目前,水稻细菌性条斑病的防治主要集中于施用化学农药及抗病品种选育等农业措施,大量化学农药的长期使用导致农药残留、病虫害抗性增加、环境污染等问题,严重影响农业可持续发展。而抗性育种难度大、周期长,相应的农业措施复杂、经济投入大。生物防治是利用有益生物或其他生物来消灭或抑制有害生物,受到广泛采用和具有良好生态效益、环境效益与社会效益的一种病虫害防治方法,因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点,符合农业的可持续发展,是当前和未来植物病害防治的发展趋势。
发明内容
本发明提供了一种光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用,以解决水稻生长过程中水稻细菌性条斑病害防治难度大、成本高的技术问题
本发明采用的技术方案如下:
一种光合细菌类球红细菌菌株,光合细菌类球红细菌菌株为光合细菌类球红细菌A13 (Rhodobacter sphaeroidesA13),其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No: M 2018605。
进一步地,光合细菌类球红细菌A13在双层固体平板培养基上培养4d~8d,形成深色的圆形菌落,菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm~0.60mm;光合细菌类球红细菌A13在液体培养基中培养7d呈深红色。
根据本发明的另一方面,还提供了一种光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂,由上述光合细菌类球红细菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备获得光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。
进一步地,光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的菌浓度为5×105cfu/mL~5×107cfu/mL。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的制备方法,包括以下步骤:S1、将光合细菌类球红细菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养,培养至红色单菌落出现;S2、种子培养:将步骤S1培养出的红色单菌落接入至血清瓶中,以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液;S3、生产培养:将步骤S2中菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积3%~6%的接种量接种,培养至对数生长期获得光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。
进一步地,步骤S2中种子培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌液体培养基的pH值为7.0~7.1;步骤S3中生产培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌菌株生产培养基的pH值为7.0~7.1。
根据本发明的另一方面,还提供了一种光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂,由上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂经离心分离收集上清液制得。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂的制备方法,包括以下步骤:将光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂进行发酵培养5d~7d,培养完成后进行离心分离,收集上清液,再经过细菌过滤器过滤,获得光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂。
进一步地,发酵培养的条件为:发酵培养的温度为30℃~35℃,光照条件为3000Lx~ 4000Lx;离心分离的条件为:在7000rpm~8000rpm条件下离心14min~16min,离心的温度为3℃~5℃。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂、光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂在促进水稻生长或防治水稻细菌性条斑病中的应用。
本发明具有以下有益效果:
本发明的光合细菌类球红细菌菌株,光合细菌类球红细菌A13的培养工艺简单、培养时间短、成本低,且光合细菌类球红细菌菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到水稻细菌性条斑病防控的生防菌剂及生防发酵液。
本发明的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂及生防药剂具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点,且不易使病虫害产生耐药性。
本发明的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂及生防药剂既可以防治水稻细菌性条斑病病害又能促进水稻生长。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外,本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图,对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明优选实施例的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂平板单菌落示意图;以及
图2是本发明优选实施例的光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂示意图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明优选实施例的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂平板单菌落示意图;图2 是本发明优选实施例的光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂示意图。
本实施例光合细菌类球红细菌菌株为光合细菌类球红细菌A13(Rhodobactersphaeroides A13),其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No:M 2018605。本发明的光合细菌类球红细菌菌株,光合细菌类球红细菌A13的培养工艺简单、培养时间短、成本低,且光合细菌类球红细菌菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到水稻细菌性条斑病防控的生防菌剂及生防发酵液。
上述光合细菌类球红细菌菌株为光合细菌类球红细菌A13菌株Rhodobactersphaeroides A13,从湖南省长沙县高桥镇土壤中分离得到,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC No:M 2018605。
上述光合细菌类球红细菌A13(Rhodobacter sphaeroidesA13),在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2018605,保藏时间为:2018年9月7日,保藏单位地址位于中国湖北省武汉市武昌武珞珈山路16号武汉大学。
其基因序列如下: 1000bp
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本实施例中,光合细菌类球红细菌A13在双层固体平板培养基上培养4d~8d,形成深色的圆形菌落,菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm~0.60mm;光合细菌类球红细菌A13在液体培养基中培养7d呈深红色。光合细菌类球红细菌A13菌株为革兰氏阴性菌,经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为Rhodobacter sphaeroidesA13(Rhodobacter sphaeroidesA13)。主要生物学特征有:双层固体平板培养基上培养4d~8d,形成深色的圆形菌落,菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm~0.60mm。液体培养基中培养7d呈深红色。在厌氧和微氧条件下生长良好。生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性,最适生长温度30℃~35℃,pH值为7。
已报道的用于水稻细菌性条斑病生物防治的拮抗微生物主要有真菌、细菌、粘菌、海洋微生物,其中生防细菌包括芽孢杆菌、假单孢菌等。光合细菌类球红细菌A13对水稻细菌性条斑病病菌产生抑制作用的机理主要是通过分泌如细菌素类、蛋白类、脂肽类、多肽类、酚类等抑菌物质来抑制致病菌生长,从而达预防植物病害的发生;另外通过光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂及生防药剂诱发植物自身的抗病潜能从而增强植物的抗病性。而且光合细菌类球红细菌A13的一些活性物质能钝化病原体的致病力、促进放线菌等有益微生物增殖,以及抑制病原体的生长,从而有效地抑制某些植物病害的发生与蔓延。因而,利用光合细菌类球红细菌A13菌株防治水稻细菌性条斑病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。
如图1所示,根据本发明的另一方面,还提供了一种光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂,由上述光合细菌类球红细菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备获得光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。本发明的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂及生防药剂具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点,且不易使病虫害产生耐药性。本发明的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂及生防药剂既可以防治水稻细菌性条斑病病害又能促进水稻生长。
本实施例中,光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的菌浓度为5×105cfu/mL~5× 107cfu/mL。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的制备方法,包括以下步骤:S1、将光合细菌类球红细菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养,培养至红色单菌落出现;S2、种子培养:将步骤S1培养出的红色单菌落接入至血清瓶中,以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液;S3、生产培养:将步骤S2中菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积3%~6%的接种量接种,培养至对数生长期获得光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。
本实施例中,步骤S2中种子培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌液体培养基的pH值为7.0~7.1;步骤S3中生产培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌菌株生产培养基的pH值为7.0~7.1。
如图2所示,根据本发明的另一方面,还提供了一种光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂,由上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂经离心分离收集上清液制得。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂的制备方法,将光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂进行发酵培养5d~7d,培养完成后进行离心分离,收集上清液,再经过细菌过滤器过滤,获得光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂。
本实施例中,发酵培养的条件为:发酵培养的温度为30℃~35℃,光照条件为3000Lx~ 4000Lx。离心分离的条件为:在7000rpm~8000rpm条件下离心14min~16min,离心的温度为3℃~5℃。
根据本发明的另一方面,还提供了一种如上述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂、光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂在促进水稻生长或防治水稻细菌性条斑病中的应用。
实施例
以下实施例中各化学试剂均为市售。
(1)、光合细菌类球红细菌A13菌株,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M 2018605,保藏单位地址位于中国武汉大学。
(2)、光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂
采用上述光合细菌类球红细菌A13菌株为原料,通过经活化、种子培养、生产培养制备得到,光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂的菌数为5×106cfu/mL,其具体制备方法包括以下步骤:
S1、活化:将光合细菌类球红细菌A13菌株的保存种按双层平板培养法进行培养,培养至红色单菌落出现;采用的培养基为光合细菌固体培养基,配方为:蛋白胨:5g/L、牛肉提取物:1.5g/L、YE:1.5g/L、K2HPO4:4.8g/L、KH2PO4:1.3g/L、微量金属元素贮液1.0ml/L、琼脂粉20g/L,pH值为7.0。微量金属元素贮液配方:准确称量EDTA:2.5g、ZnSO4:6.13g、 MgSO4:0.78g、CuSO4:0.25g、CoCl2:0.08g、FeSO4·7H2O:7.0g溶于1L蒸馏水中;
S2、种子培养:将步骤S1培养出的红色单菌落接入至120mL血清瓶中,在温度为35℃、光照条件为4000Lx、pH值为7.0条件下,用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为:蛋白胨:5g/L、牛肉提取物:1.5g/L、YE:1.5g/L、K2HPO4: 4.8g/L、KH2PO4:1.3g/L、微量金属元素贮液1.0ml/L、pH值为7.0。微量金属元素贮液配方:准确称量EDTA:2.5g、ZnSO4:6.13g、MgSO4:0.78g、CuSO4:0.25g、CoCl2:0.08g、FeSO4·7H2O: 7.0g溶于1L蒸馏水中;
S3、生产培养:将步骤S2种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中,用光合细菌菌株生产培养基进行生产培养,光合细菌菌株生产培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致,菌液的接种量为生产培养基总体积的5%,在温度为35℃、光照条件为4000Lx、pH值为7.0条件下,培养至对数生长期获得光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂。
(3)、光合细菌类球红细菌A13菌株的生防药剂
其具体制备方法包括以下步骤:
取上述获得的光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂经发酵培养6d,发酵培养在温度为35℃、光照条件为4000Lx条件下进行,发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同,然后在8000rpm条件下离心15min,温度为4℃,离心收集上清液,将上清液用细菌过滤器过滤,得到无光合细菌类球红细菌A13菌体的上清液即为生防发酵液,4℃保存备用。
实施例1
采用抑菌圈法测定光合细菌菌株类球红细菌A13对引起水稻细菌性条斑病病害的病原菌的抑制情况,取0.1ml病原细菌涂布于LB平板上,在中心放灭菌钢圈,在钢圈中加入0.05ml 光合细菌菌液,30℃培养7d,观察有无抑菌圈。
实施例2
在温室中条件下,将5×106cfu/mL光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂对30℃催芽至露白的水稻种子进行浸种1h处理,将处理后的稻种播种于盆钵中,鉴定期间幼苗保持在28 ℃、10h/d光照条件下的温室中培养,定期记录株高。选取3株代表性植株分别测定株高和湿重。水稻进入苗期后,对水稻苗进行水稻白叶枯病菌接种,接种7天后调查病情指数并计算防治效果。
对比例1
在温室中条件下,采用光合细菌培养基对30℃催芽至露白的水稻种子进行浸泡1h处理,其他步骤与实施例2相同。
对比例2
在温室中条件下,采用水对30℃催芽至露白的水稻种子进行浸泡1h处理,其他步骤与实施例2相同。
上述实施例1中,抑菌圈法测定钢圈周围有抑菌圈,说明光合细菌类球红细菌A13对引起水稻白叶枯病病害的病原菌具有抑制作用。
上述实施例2、对比例1和对比例2的测定结果如表1所示。
表1测定结果
从表1中可知,施用光合细菌类球红细菌A13菌株的生防菌剂处理后的水稻,生长能力快,抗水稻细菌性条斑病能力强。水稻株高相对于清水对照增加31.13%、水稻单棵鲜重相对于清水对照增加18.11%,光合细菌荚膜红细菌A12菌株的生防菌剂处理后的水稻白叶枯病防治效果达到68.9%。说明利用光合细菌荚膜红细菌菌株防治水稻白叶枯病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南省植物保护研究所
<120> 光合细菌类球红细菌菌株、菌剂药剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 光合细菌类球红细菌A13(Rhodobacter sphaeroides A13)
<400> 1
gggaattgcg gcagctacac atgcagtcga gcgaagtctt cggacttagc ggcggacggg 60
tgagtaacgc gtgggaacgt gccctttgct tcggaatagc cccgggaaac tgggagtaat 120
accgaatgtg ccctttgggg gaaagattta tcggcaaagg atcggcccgc gttggattag 180
gtagttggtg gggtaatggc ctaccaagcc gacgatccat agctggtttg agaggatgat 240
cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatct 300
tagacaatgg gcgcaagcct gatctagcca tgccgcgtga tcgatgaagg ccttagggtt 360
gtaaagatct ttcaggtggg aagataatga cggtaccacc agaagaagcc ccggctaact 420
ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg ggctagcgtt attcggaatt actgggcgta 480
aagcgcacgt aggcggatcg gaaagtcaga ggtgaaatcc cagggctcaa ccctggaact 540
gcctttgaaa ctcccgatct tgaggtcgag agaggtgagt ggaattccga gtgtagaggt 600
gaaattcgta gatattcgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctcactgg ctcgatactg 660
acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 720
taaacgatga atgccagtcg tcgggcagca tgctgttcgg tgacacacct aacggattaa 780
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acatggcgat cgcggttcca gagatggttc cttcagttcg gctggatcgc acacaggtgc 960
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttcggtt 1000

Claims (10)

1.一种光合细菌类球红细菌菌株,其特征在于,所述光合细菌类球红细菌菌株为光合细菌类球红细菌A13(Rhodobacter sphaeroides A13),其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No:M 2018605。
2.根据权利要求1所述的光合细菌类球红细菌菌株,其特征在于,
所述光合细菌类球红细菌A13在双层固体平板培养基上培养4d~8d,形成深色的圆形菌落,菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm~0.60mm;
所述光合细菌类球红细菌A13在液体培养基中培养7d呈深红色。
3.一种光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂,其特征在于,由权利要求1所述的光合细菌类球红细菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备获得所述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂,其特征在于,
所述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的菌浓度为5×105cfu/mL~5×107cfu/mL。
5.一种如权利要求3或4所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将光合细菌类球红细菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养,培养至红色单菌落出现;
S2、种子培养:将所述步骤S1培养出的红色单菌落接入至血清瓶中,以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液;
S3、生产培养:将所述步骤S2中菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积3%~6%的接种量接种,培养至对数生长期获得所述光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂。
6.根据权利要求5所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂的制备方法,其特征在于,
所述步骤S2中种子培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌液体培养基的pH值为7.0~7.1;
所述步骤S3中生产培养的温度为30℃~35℃,光照条件为2500Lx~4000Lx,光合细菌菌株生产培养基的pH值为7.0~7.1。
7.一种光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂,其特征在于,由权利要求3或4所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂经离心分离收集上清液制得。
8.一种如权利要求7所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂的制备方法,其特征在于,
将光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂进行发酵培养5d~7d,培养完成后进行离心分离,收集上清液,再经过细菌过滤器过滤,获得所述光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂。
9.根据权利要求8所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂的制备方法,其特征在于,
所述发酵培养的条件为:发酵培养的温度为30℃~35℃,光照条件为3000Lx~4000Lx;
所述离心分离的条件为:在7000rpm~8000rpm条件下离心14min~16min,离心的温度为3℃~5℃。
10.一种如权利要求3所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防菌剂、权利要求7所述的光合细菌类球红细菌菌株的生防药剂在促进水稻生长或防治水稻细菌性条斑病中的应用。
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