CN110192529B - 一种马铃薯种苗的扩繁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种马铃薯种苗的扩繁的方法，该方法为将脱毒试管苗接种于含固体培养基a的广口瓶中，切成带一叶的茎段b，在实验室条件下扩繁时，将茎段b接种含有液体培养基b的5L的气升式生物反应器中通入空气，得到试管苗b；在生产条件下扩繁时，将茎段b接种在含有液体培养基c的广口瓶静止培养，腋芽长到3cm～4cm，接入含液体培养基b的20L的气升式生物反应器中通入空气，得到试管苗c，将试管苗b或c切成茎段c扦插在混合基质中，得到扩繁后的马铃薯种苗。本发明将马铃薯脱毒试管苗和生物反应器技术结合，用茎段扦插构建马铃薯优良种苗扩繁体系，能解决优良种苗生产上高成本、低效率问题，实现马铃薯种苗的大批量、低成本快速繁殖。

Description

一种马铃薯种苗的扩繁的方法
技术领域
本发明属于植物微体快繁技术领域，具体涉及一种马铃薯种苗的扩繁的方法。
背景技术
为解决马铃薯病毒病引起的种薯退化问题，目前世界各国的马铃薯脱毒种薯繁育体系都是以茎尖脱毒试管苗作为核心种。在国内，马铃薯脱毒试管苗的生产主要采用传统植物组培法，采用的是小容器微体快繁方式。虽然这种方法具有诸多优势，但是在生产中具有一定的局限性，如操作繁琐、效率低及成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种马铃薯种苗的扩繁的方法，该方法将马铃薯脱毒试管苗和生物反应器技术相结合，同时利用茎段扦插构建马铃薯优良种苗扩繁体系，能有效解决优良种苗生产上存在高成本、低效率的问题，从而为产业化提供一条新途径，实现马铃薯种苗的大批量、低成本快速繁殖。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种马铃薯种苗的扩繁的方法，该方法包括以下步骤：
S1、采用PCR方法和酶联双抗体夹心法对马铃薯的试管苗进行病毒病和PSTV类病毒的检测，选取不带病毒的试管苗，得到脱毒试管苗；
S2、将S1中得到的脱毒试管苗切成带一叶的茎段a接种于含固体培养基a的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养4周后，得到试管苗a，将试管苗a切成带一叶的茎段b；
S3、气升式生物反应器扩繁：
S301、当在实验室条件下扩繁时，将100个S2中得到的带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.2L液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后，得到试管苗b；
S302、当在生产条件下扩繁时，用二步培养法进行扩繁，将20个S2中得到的带一叶的茎段b接种在含20mL液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行静止培养，培养条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；当腋芽长到3cm～4cm时，接入含1.8L液体培养基b的20L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，继续培养25d，得到试管苗c；
S4、将S301中得到的试管苗b或S302中得到的试管苗c每株均切成4～5个茎段c，将茎段扦插在混合基质中培养，得到扩繁的马铃薯种苗。
优选地，S2中所述固体培养基a由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L、蔗糖30000mg/L和琼脂8000mg/L。
优选地，S301和S302中所述液体培养基b由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO310111mg/L、NH4Cl 1069.8mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L。
优选地，S302中所述液体培养基c由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L和蔗糖30000mg/L。
优选地，S4中所述混合基质由以下质量分数的原料组成：椰糠60％、泥炭土15％、珍珠岩20％，余量为营养土。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明将脱毒试管苗接种含固体培养基a的广口瓶中培养，然后切成带一叶的茎段b，当在实验室条件下扩繁时，将带一叶的茎段b完全浸没接种含有液体培养基b的5L气升式生物反应器中培养并通入0.1vvm的空气，能够提高得到的试管苗b的生物量及有效茎段数；当在生产条件下扩繁时，用二步培养法进行扩繁，先将带一叶的茎段b接种在含有液体的培养基c的350mL的广口瓶中静止培养，能确保有效植株数，当腋芽长到3cm～4cm时，再接入含液体培养基b的20L的气升式生物反应器中培养，并通入0.1vvm的空气进行扩大培养，一次性可获得400～500个试管苗c，大规模培养可节约成本；将得到的试管苗b或试管苗c每株均切成4～5个茎段c扦插在混合基质中培养，得到扩繁后的马铃薯种苗，一次性扩繁的健康苗多，成活率高，从而建立马铃薯优良种苗生产体系，本发明将马铃薯脱毒试管苗和生物反应器技术相结合，同时利用茎段扦插构建马铃薯优良种苗扩繁体系，能有效解决优良种苗生产上存在高成本、低效率的问题，从而为产业化提供一条新途径，实现马铃薯种苗的大批量、低成本快速繁殖。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
本实施例的马铃薯种苗的扩繁的方法，该方法包括以下步骤：
S1、采用PCR方法和酶联双抗体夹心法对马铃薯的试管苗进行病毒病和PSTV类病毒的检测，选取不带病毒的试管苗，得到脱毒试管苗；
S2、将S1中得到的脱毒试管苗切成带一叶的茎段a接种于含固体培养基a的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养4周后，得到试管苗a，将试管苗a切成带一叶的茎段b；所述固体培养基a由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L、蔗糖30000mg/L和琼脂8000mg/L；
S3、气升式生物反应器扩繁：
S301、当在实验室条件下扩繁时，将100个S2中得到的带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.2L液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后，得到试管苗b；所述液体培养基b由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO310111mg/L、NH4Cl 1069.8mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；
S302、当在生产条件下扩繁时，用二步培养法进行扩繁，将20个S2中得到的带一叶的茎段b接种在含20mL液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行静止培养，培养条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；当腋芽长到3cm～4cm时，接入含1.8L液体培养基b的20L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，继续培养25d，得到500个试管苗c；所述液体培养基b由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO310111mg/L、NH4Cl 1069.8mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基c由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L和蔗糖30000mg/L；
S4、将S301中得到的试管苗b或S302中得到的试管苗c每株均切成4～5个茎段c，将茎段扦插在混合基质中培养，得到扩繁的马铃薯种苗，成活率为80％；所述混合基质由以下质量分数的原料组成：椰糠60％、泥炭土15％、珍珠岩20％，余量为营养土。
试管苗a平均每株的鲜重和干物重分别为0.41g和0.03g，株高为7.01cm。
当在实验室条件下扩繁时，通过在含液体培养基b的5L的气升式生物反应器中完全浸没接种得到的试管苗b平均每株的鲜重和干物重分别为4.11g和0.33g，株高为16.23cm，相对于试管苗a，试管苗b的生物量和株高得到了很大的提高，说明生物反应器技术能够快速、高效地繁殖试管苗，且试管苗的生物量得到了显著的提高，并且采用完全浸没在液体培养基b中的接种方式，得到的试管苗b叶片与试管苗a叶片相比，气孔密度低、叶肉细胞间隙大、排列疏松。试管苗b的叶片气孔相对密度低是可能表皮细胞变大导致，而且由于叶片内栅栏组织厚、海绵组织疏松可能使其植株获得更大更厚的叶片，使其能够生长旺盛、植株健壮。
利用5L的气升式生物反应器在实验室条件下扩繁时，通过培养方式、无机盐浓度、培养基中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比、培养基体积、接种密度对马铃薯脱毒试管苗生长的影响研究，建立了马铃薯试管苗的5L的气升式生物反应器培养体系。由于生物反应器利用空气注入进行外植体的液体悬浮培养，其培养环境不同于固体培养环境。在植物组培快繁中提高繁殖系数是关键。生物反应器内影响繁殖系数的因素很多,如培养基种类、激素种类配比和浓度、碳源种类和浓度、有机物种类和浓度等。其中无机盐是培养基中重要的营养成分，氮是培养基中的基本化学元素，也是制约植物生长的主要因素。因此，无机盐浓度和不同氮源比例与培养体的分化、增殖以及生长状况密切联系。在带叶片培养体的生物反应器培养中，培养苗在培养基中的浸泡时间非常重要，离体培养的成功一定程度上依赖于培养方式。并且，在培养过程中外植体数/培养基量比值也直接影响器官形成与发育。因此，本试验通过培养方式、无机盐浓度、培养基中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比、培养基体积、接种密度对马铃薯脱毒试管苗生长的影响研究，建立了马铃薯试管苗的5L的气升式生物反应器培养体系，为反应器的放大设计提供依据，也为今后的大规模培养提供一些参考指标。
当在生产条件下扩繁时，通过二步培养法，先将带一叶的茎段b接种在含液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行培养，能确保有效植株数，当腋芽长到3cm～4cm时，再接入含液体培养基b的20L的气升式生物反应器中得到的试管苗c，平均每株的鲜重和干物重分别为4.28g和0.36g，株高为16.51cm，通过扩大培养，在保证较高的生物量的同时，大规模培养可节约成本。
为节约成本，利用20L的气升式反应器进行扩大培养。为了提高20L反应器中的最终收获有效植株数，进行二步培养法：即利用350mL广口瓶进行试管苗液体静止培养(第一阶段)，把腋芽长到3-4cm的接入到20L的气升式反应器，确保有效植株数。350mL广口瓶和20L的气升式反应器的培养基条件不一样是通过试验得出来的：即20L反应器培养条件利用在5L生物反应器中已优化的条件；在广口瓶中也是通过对无机盐浓度、接种密度、培养基体积试验获得的培养条件进行350mL广口瓶培养。为了减少消耗品的成本，20L的气升式反应器可以用既能高压灭菌又不变形的塑料材质。
采用本实施例的马铃薯种苗的扩繁的方法，相对于常规的马铃薯种苗繁殖方法(整株进行扦插)，繁殖系数增加了至少4倍，扦插成活率能达到80％。
对比例1
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在实验室条件下扩繁时5L的气升式生物反应器反应体系的不同培养方式的优化：
(一)将带一叶的茎段b接入含液体培养基的容量为5L的气升式生物反应器中的方法中选择接触式、间歇接触式、浸没式三种方式培养，所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；
(1)浸没式培养：生物反应器内放入1.8L液体培养基，使接种茎段完全浸没在液体培养基；
(2)间歇接触式培养：在生物反应器内距底部15cm处放入一个支持网，使接种的带一叶的茎段b放置在支持网上，每隔60min供应一次液体培养基，每次60min，每天供应12次；
(3)接触式培养：生物反应器内放入1.8L的液体培养基，在液面位置放入一个支持网，使接种带一叶的茎段b放置在支持网上，始终保持茎段与液体培养基接触；
所述液体培养基同实施例1的液体培养基c；
(二)固体培养：将带一叶的茎段b接入含固体培养基的容量为350mL的广口瓶中进行培养，所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b。
分别将100个带一叶的茎段b按照接触式培养、间歇接触式培养和浸没式培养的方法接种在含1.8L液体培养基的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周之后调查试管苗的株高、鲜重、干重、叶长、叶宽、叶厚等生长特性，叶片和根系显微结构观察，培养基中蔗糖、果糖、葡萄糖含量，结果如表1所示；
将18个带一叶的茎段b接种在含30mL固体培养基的350mL的广口瓶中，培养4周之后调查试管苗的株高、鲜重、干重、叶长、叶宽、叶厚等生长特性，叶片和根系显微结构观察，结果如表1所示：
表1 5L的气升式生物反应器扩繁中不同培养方法对试管苗生长的影响
Figure BDA0002124920440000101
注：表中字母表示在p<0.05水平上的差异显著性，下述各表同。
由表1可知，不同的培养方式对试管苗生长有显著影响，生物反应器内培养的试管苗生物量和株高显著高于固体培养。在三种不同生物反应器培养中，浸没式培养的试管苗的生物量、株高、叶片等指标最好。浸没式培养中培养基内剩余的蔗糖、果糖和葡萄糖含量最低，与最大的生物量有关。叶片显微结构观察发现，生物反应器内培养的试管苗的叶片气孔密度低于固体培养；且在生物反应器内生长的试管苗叶片表皮细胞变大，栅栏组织变厚，海绵组织细胞排列疏松、细胞间隙大。但根部解剖结构特征没有显著差异。虽然在生物反应器中培养的试管苗的叶片气孔密度低，但是这是由于表皮细胞变大导致其气孔密度相对降低；而且生物反应器内植株长得更健壮、更茂盛是由于叶片内栅栏组织厚、海绵组织疏松使其具有更大、更厚的叶片有关。总之，与固体培养相比，利用生物反应器培养的试管苗具有更大的叶片和更粗壮的茎，因此适合于种苗大量生产，且浸没式生物反应器培养方式为最佳培养方式，浸没条件下更适宜马铃薯茎段生长成苗。
对比例2
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在实验室条件下扩繁时5L的气升式生物反应器反应体系的培养基的浓度的优化：
将带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.8L的不同的液体培养基浓度的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后调查植株株高、鲜重、干重，培养基中蔗糖、果糖、葡萄糖含量；结果如表2所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；
所述液体培养基分别为:
液体培养基d：所述液体培养基d由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO3475mg/L、NH4Cl412.5mg/L、KH2PO442.5mg/L、MgSO4·7H2O 92.5mg/L、CaCl2·2H2O 110mg/L、KI0.2075mg/L、H3BO31.55mg/L、MnSO4·4H2O 5.575mg/L、ZnSO4·7H2O 2.15mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.0625mg/L、CuSO4·5H2O 0.00625mg/L、CoCl2·6H2O 0.00625mg/L、Na2EDTA9.325mg/L、FeSO4·7H2O 6.95mg/L、肌醇25mg/L、盐酸硫胺0.1mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基e:所述液体培养基e由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO3950mg/L、NH4Cl 825mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·4H2O 11.15mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、CoCl2·6H2O 0.0125mg/L、Na2EDTA 18.65mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、肌醇50mg/L、盐酸硫胺0.2mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基c:所述液体培养基c由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4Cl 1650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L和蔗糖30000mg/L；同实施例1中的液体培养基c；
液体培养基f:所述液体培养基f由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO32850mg/L、NH4Cl2475mg/L、KH2PO4255mg/L、MgSO4·7H2O 555mg/L、CaCl2·2H2O 660mg/L、KI 1.245mg/L、H3BO39.3mg/L、MnSO4·4H2O 33.45mg/L、ZnSO4·7H2O 12.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.375mg/L、CuSO4·5H2O 0.0375mg/L、CoCl2·6H2O 0.0375mg/L、Na2EDTA 55.95mg/L、FeSO4·7H2O41.7mg/L、肌醇150mg/L、盐酸硫胺0.6mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基g:所述液体培养基g由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO33800mg/L、NH4Cl3300mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；
表2 5L的气升式生物反应器扩繁中培养基的浓度对试管苗生长的影响
Figure BDA0002124920440000131
Figure BDA0002124920440000141
由表2可知，采用液体培养基g，培养的试管苗具有最佳生长状态和最大生物量。采用液体培养基d和液体培养基e培养的试管苗均未正常生长。液体培养基c、液体培养基f和液体培养基g培养的试管苗能够正常生长，并且随着培养基的浓度增加，试管苗生长状态越好。培养基内剩余糖含量是随着培养基各原料浓度的增加而降低，在试管苗生长最好的培养基中糖含量最低。因此，在生物反应器培养中，液体培养基g有利于马铃薯试管苗生长。
对比例3：
本对比例为对比例2液体培养基g中的NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比例的优化：
把培养基中总氮摩尔浓度设定为120mmol/L，用NH4Cl和KNO3调节培养基中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为20:100，40:80，60:60，80:40，100:20，其他原料的浓度与对比例2中液体培养基g(除NH4 +与NO3 -)的浓度相同，即KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；得到5个不同NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比的液体培养基，分别为：
液体培养基b:同实施例1中的液体培养基b；所述液体培养基b由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO310111mg/L、NH4Cl 1069.8mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基b中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为20：100；
液体培养基g:同对比例2中的液体培养基g；所述液体培养基g由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO38088.8mg/L、NH4Cl 2139.6mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基g中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为40：80；
液体培养基j:所述液体培养基j由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO36066.6mg/L、NH4Cl 3209.4mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基j中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为60：60；
液体培养基k:所述液体培养基k由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO34044.4mg/L、NH4Cl 4279.2mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基k中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为80：40；
液体培养基l:所述液体培养基l由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO32022.2mg/L、NH4Cl 5349mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；所述液体培养基l中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比分别为100：20；
将带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.8L的不同的NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比例液体培养基(液体培养基b、液体培养基g、液体培养基j、液体培养基k和液体培养基l)的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后调查植株株高、鲜重、干重，培养基中蔗糖、果糖、葡萄糖含量；结果如表3所示；
表3 5L的气升式生物反应器扩繁中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比例对试管苗生长的影响
Figure BDA0002124920440000171
由表3可知，NH4 +与NO3 -不同的摩尔浓度对试管苗生长的影响不同，采用液体培养基b时，试管苗生长状态最好，生物量、株高都显著高于其他处理，采用液体培养基k和液体培养基l时试管苗都无法正常生长，说明高浓度硝态氮适宜试管苗生长，铵态氮含量过高抑制试管苗的生长。培养基内剩余糖浓度测定结果显示，5个处理中均未检测到蔗糖，在试管苗能够正常生长的三个处理中(液体培养基b、液体培养基g和液体培养基j)，果糖和葡萄糖含量最高的是NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比为20mmol/L:100mmol/L的处理，随着铵态氮的含量增加糖含量也随之降低,这可能与铵需要立即同化有关。因此，采用总氮摩尔浓度为120mmol/L，其中NH4 +与NO3 -的摩尔浓度比为20mmol/L:100mmol/L的液体培养基b是有利于马铃薯试管苗的生长的培养条件。
对比例4
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中5L的气升式生物反应器反应体系的不同液体培养基b体积的优化：
将100个带一叶的茎段b完全浸没接种在含不同体积的(0.6L、1.2L和1.8L)的液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后调查植株株高、鲜重和干重；结果如表5所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；
表4 5L的气升式生物反应器扩繁中不同体积液体培养基b对试管苗生长的影响
指标 鲜重(g/株) 干重(g/株) 株高(cm)
0.6L 3.51b 0.20b 11.91b
1.2L 4.09a 0.34a 17.14a
1.8L 3.91ab 0.31a 15.56ab
由表4可知，采用体积为1.2L的液体培养基b时试管苗生长最旺盛，而培养基体积为1.8L时，茎段发芽较慢，根形成也受到影响。当培养基体积为0.6L时虽然茎段发芽快、根形成早，但生物量及株高没达到最高。培养基用量过多会影响外植体对培养基的适应能力、增加相对湿度，导致试管苗生长缓慢；培养基用量过低虽试管苗生长快，但后期由于营养不足，不能获得最大的生物量。因此，适合于马铃薯试管苗健壮生长的培养基体积是1.2L。
对比例5：
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在实验室条件下扩繁时5L的气升式生物反应器反应体系的不同接种密度的优化：
分别将不同接种密度的(50个、100个、150个和200个)带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.2L的液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后调查植株株高、鲜重和干重；结果如表4所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；所述液体培养基b同实施例1的液体培养基b；
表5 5L的气升式生物反应器扩繁中不同接种密度对试管苗生长的影响
指标 鲜重(g/株) 干重(g/株) 株高(cm)
接种密度：50个 3.40b 0.28b 13.11b
接种密度：100个 4.11a 0.33a 16.23a
接种密度：150个 3.03c 0.21c 13.23b
接种密度：200个 2.38d 0.18cd 12.98b
由表5可知，采用接种密度为100个带一叶的茎段b时，生物量和株高明显比其它3种接种密度处理好。接种量为50个茎段时鲜重和干重明显高于150个和200个茎段处理，但未达到最佳生长状态。接种量提高到150个和200个茎段时，鲜重、干重、株高低于100个茎段处理。接种密度过高会限制营养成分和氧气的利用率，加快培养物达到生长极限，影响其正常生长；而接种密度过低，浪费培养空间和成本，并延长培养时间，也达不到大规模生产的目的。因此，含1.2L液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器培养中，适合马铃薯试管苗生长的接种量是100个茎段。
对比例6
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在生产条件下扩繁时二步培养法的350mL的广口瓶中不同液体培养基c体积的优化：
实施例1中S302的方法中，分别将15个带一叶的茎段b接种在不同体积的(10mL、20mL、30mL、40mL和50mL)液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养2周后调查植株株高、鲜重；结果如表8所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；所述液体培养基c同实施例1的液体培养基c；
表6二步培养法的350mL的广口瓶中不同体积的液体培养基c对试管苗生长的影响
Figure BDA0002124920440000201
Figure BDA0002124920440000211
由表6可知，采用体积为20mL的液体培养基c静止培养2周时，利于根部形成，茎段发芽快。培养体积过少时，因缺乏培养基无法获得最多的生物量；培养基体积过多时，茎段发芽慢、茎基部变短弯曲，甚至出现不生长死亡现象，可能是与茎段浸泡时间过长和没法获得氧气有关。因此，可以看出液体静止培养时器官形成与发育受培养基体积影响很大，在350ml广口瓶内茎段培养的适宜培养基体积为20ml。
对比例7
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在生产条件下扩繁时二步培养法的350mL的广口瓶中进行培养时培养基的浓度优化：
分别将15个带一叶的茎段b接种在含不同浓度的液体培养基的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养2周后调查植株株高、鲜重；结果如表7所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；
所述液体培养基的选择与对比例2(在实验室条件下扩繁时5L的气升式生物反应器反应体系的培养基的浓度的优化)的培养基的浓度的优化相同，分别为:
液体培养基d：所述液体培养基d由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO3475mg/L、NH4Cl412.5mg/L、KH2PO442.5mg/L、MgSO4·7H2O 92.5mg/L、CaCl2·2H2O 110mg/L、KI0.2075mg/L、H3BO31.55mg/L、MnSO4·4H2O 5.575mg/L、ZnSO4·7H2O 2.15mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.0625mg/L、CuSO4·5H2O 0.00625mg/L、CoCl2·6H2O 0.00625mg/L、Na2EDTA9.325mg/L、FeSO4·7H2O 6.95mg/L、肌醇25mg/L、盐酸硫胺0.1mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基e:所述液体培养基e由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO3950mg/L、NH4Cl 825mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·4H2O 11.15mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、CoCl2·6H2O 0.0125mg/L、Na2EDTA 18.65mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、肌醇50mg/L、盐酸硫胺0.2mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基c:所述液体培养基c由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4Cl 1650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L和蔗糖30000mg/L；同实施例1中的液体培养基c；
液体培养基f:所述液体培养基f由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO32850mg/L、NH4Cl2475mg/L、KH2PO4255mg/L、MgSO4·7H2O 555mg/L、CaCl2·2H2O 660mg/L、KI 1.245mg/L、H3BO39.3mg/L、MnSO4·4H2O 33.45mg/L、ZnSO4·7H2O 12.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.375mg/L、CuSO4·5H2O 0.0375mg/L、CoCl2·6H2O 0.0375mg/L、Na2EDTA 55.95mg/L、FeSO4·7H2O41.7mg/L、肌醇150mg/L、盐酸硫胺0.6mg/L和蔗糖30000mg/L；
液体培养基g:所述液体培养基g由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO33800mg/L、NH4Cl3300mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI 1.66mg/L、H3BO312.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O 55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L；
表7二步培养法的350mL的广口瓶中不同培养基对试管苗生长的影响
指标 鲜重(g/株) 株高(cm)
液体培养基d 0d 0d
液体培养基e 0.05c 1.4c
液体培养基c 0.13a 3.1a
液体培养基f 0.10b 2.8ab
液体培养基g 0.10b 2.5b
由表7可知，用液体培养基c静止培养2周时，试管苗生长最快，短时间内能够积累更多的生物量。液体培养基d和液体培养基e的试管苗，茎段发芽慢，甚至出现死亡现象；而液体培养基f和液体培养基g的试管苗，前期茎段生长速度低于液体培养基c内的茎段生长。由此可见，马铃薯试管苗的生长需要较高的培养基浓度，因此适合于茎段前期生长的最适培养基是液体培养基c。
对比例8
本对比例为实施例1的马铃薯种苗的扩繁的方法中在生产条件下扩繁时二步培养法的350mL的广口瓶中进行培养时不同接种密度的优化：
分别将不同接种密度的(10个、15个、20个和25个)带一叶的茎段b接种在含液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30μmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养2周后调查植株株高、鲜重；结果如表8所示；所述带一叶的茎段b同实施例1中的带一叶的茎段b；所述液体培养基c同实施例1的液体培养基c；
表8二步培养法的350mL的广口瓶中不同接种密度对试管苗生长的影响
指标 鲜重(g/株) 株高(cm)
接种密度：10个 0.11b 2.5b
接种密度：15个 0.11b 2.6b
接种密度：20个 0.15a 3.4a
接种密度：25个 0.09b 2.4b
由表8可知，当在生产条件下扩繁时，用二步培养法进行扩繁，将20个带一叶的茎段b接种在350mL的广口瓶中静止培养2周时,获得最大的生物量和株高。在培养基体积适宜的情况下，不同接种密度都能获得健壮植株，但接种密度较低或较高都无法获得最高生物量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (2)

1.一种马铃薯种苗的扩繁的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、采用PCR方法和酶联双抗体夹心法对马铃薯的试管苗进行病毒病和PSTV类病毒的检测，选取不带病毒的试管苗，得到脱毒试管苗；
S2、将S1中得到的脱毒试管苗切成带一叶的茎段a接种于含固体培养基a的容量为350mL的广口瓶中进行培养，培养的条件为：光照强度为30µmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；培养4周后，得到试管苗a，将试管苗a切成带一叶的茎段b；
S3、气升式生物反应器扩繁：
S301、当在实验室条件下扩繁时，将100个S2中得到的带一叶的茎段b完全浸没接种在含1.2L液体培养基b的容量为5L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，培养4周后，得到试管苗b；
S302、当在生产条件下扩繁时，用二步培养法进行扩繁，将20个S2中得到的带一叶的茎段b接种在含20mL液体培养基c的容量为350mL的广口瓶中进行静止培养，培养条件为：光照强度为30µmol·m-2·s-1，光照时间为每天16h，培养温度为23℃±2℃；当腋芽长到3cm～4cm时，接入含1.8L液体培养基b的20L的气升式生物反应器中，并同时注入供给量为0.1vvm的空气，继续培养25d，得到试管苗c；
S4、将S301中得到的试管苗b或S302中得到的试管苗c每株均切成4～5个茎段c，将茎段扦插在混合基质中培养，得到扩繁的马铃薯种苗;
S2中所述固体培养基a由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L、蔗糖30000mg/L和琼脂8000mg/L;
S301和S302中所述液体培养基b由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO310111mg/L、NH4Cl1069.8mg/L、KH2PO4340mg/L、MgSO4·7H2O 740mg/L、CaCl2·2H2O 880mg/L、KI1.66mg/L、H3BO3 12.4mg/L、MnSO4·4H2O 44.6mg/L、ZnSO4·7H2O 17.2mg/L、Na2MoO4·2H2O0.5mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.05mg/L、Na2EDTA 74.6mg/L、FeSO4·7H2O55.6mg/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺0.8mg/L和蔗糖30000mg/L;
S302中所述液体培养基c由以下原料加入到蒸馏水中制成：KNO31900mg/L、NH4NO31650mg/L、KH2PO4170mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺0.4mg/L和蔗糖30000mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯种苗的扩繁的方法，其特征在于，S4中所述混合基质由以下质量分数的原料组成：椰糠60%、泥炭土15%、珍珠岩20%，余量为营养土。
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