CN110187105B

CN110187105B - 一种检测牛、羊口蹄疫病毒o型抗体的b-elisa试剂盒及制备方法

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Publication number: CN110187105B
Application number: CN201910557109.8A
Authority: CN
Inventors: 韩佃刚; 张志诚; 段博芳; 艾军; 周晓黎; 祝贺; 尹尚莲; 刘敏; 李佳超; 赵胜兰; 杨园渊; 起绍琼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN110187105A

Abstract

本发明涉及一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒，包括分别放置的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板和口蹄疫病毒O型VP1蛋白特异性单克隆抗体。本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法。本发明试剂盒采用阻断ELISA的方式检测牛、羊血清中口蹄疫病毒O型抗体(仅适用于检测牛、羊)，可适用于牛、羊口蹄疫病毒O型血清抗体的快速诊断、检测和流行病学调查，可以在同行业界内进行推广。

Description

一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的B-ELISA试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及一种检测牛、羊(仅适用于检测牛、羊)口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒及其制备方法。

试剂盒中口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板为通过昆虫细胞表达系统(pFastBacHTA)制备的VP1蛋白，进而包被酶联免疫板制得；口蹄疫病毒O型VP1蛋白特异性单克隆抗体2D8(YNDJ-03)为杂交瘤细胞分泌；通过制备方法试制的试剂盒操作程序简单，检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(OIE)推荐的口蹄疫O型ELISA抗体检测方法。

背景技术

口蹄疫病毒O型(Food and mouth disease virus，FMDV O型)对反刍动物危害高，在发展中国家引起严重的社会经济问题，被OIE列为影响动物国际贸易的主要疫病。

口蹄疫病毒O型抗体检测方法，世界动物卫生组织推荐使用的方法为病毒中和试验(VN)和ELISA方法。中和试验实验环境要求高，需要生物安全三级及以上实验室；ELISA检测方法特异性和敏感性高，且适合于大量样品的检测，检测时间周期相对较短，因此广泛应用于口蹄疫病毒抗体检测。

本发明研制的B-ELISA检测方法，其检测灵敏性、特异性等指标均与OIE推荐的类似方法相近。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，利用昆虫细胞表达口蹄疫病毒O型VP1蛋白，包被ELISA板；研制针对VP1蛋白的特异性单抗；组装试剂盒，优化试剂盒各组份，试剂盒检测指标达到国际认可的检测值。

本发明采用如下技术方案实现。

一种检测口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒，其特征在于，包括分别放置的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板和口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体。

进一步为，本发明试剂盒中所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板为使用昆虫杆状病毒表达的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板；所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体为使用纯化的灭活口蹄疫病毒O型抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株2D8(YNDJC-03)，取杂交瘤细胞，注射降植烷处理的小鼠，取腹水，利用ProteinG柱纯化的2D8单抗。

进一步为，本发明试剂盒中还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

进一步为，本发明的试剂参数为，所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含质量分数0.05％～0.1％Tween-20的0.01mol/L pH 7.4 PBST；

稀释液为含质量分数0.05％～3％BSA、0.05％～0.1％Tween-20 pH 7.4的PBS；

底物液为可溶性TMB；

终止液为1mol/L H₂SO₄溶液。

该部分的参数看似常规，但实际使用时，若超出该范围参数区间的试剂则会直接影响后期的实验效果，且在该区间参数范围内的试剂使用时也有一定讲究，虽不影响后期的实验结果，但会适当影响检测的效果。

本发明的试剂盒各组成部分的体积或数量如下，可以直接生产，获得主管部门批准后作为产品上市。

一种口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)利用Invitrogen公司pFastBacHTA载体(货号10584-027)，扩增口蹄疫病毒O型株VP1基因；(VP1基因与NCBI基因序列号:DQ478937.1的序列同源性100％)

2)通过PCR和限制性内切酶EcoRI和KpnI，构建得口蹄疫病毒O型pFastBacHTA-FMDV O型VP1质粒，该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞；

3)经抗生素和PCR筛选，获得转座的杆粒Bacmid-FMDV O型VP1；

4)转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，再感染细胞，反复冻融，8000rpm离心，收获上清；

5)35000rpm超速离心，按超速离心前后体积300：1，用PBS稀释，获得口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原。

上述方法中步骤2、3中的PCR参数为，上游引物TTT GAA TTC ACC ACC TCC CCGGGC G，下游引物TTG GTA CCT TCA AAA GCT GTT TTG CGG GT，扩增条件95℃，3min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；4℃保存。

使用上述口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备包被板的方法，该方法包括以下步骤：

1)将口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原按照1:500～1:1000比列，用pH 9.0-10.0碳酸盐缓冲液稀释；

2)每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板(Costar 92592)，4℃放置18～24h；

3)洗板3次，用含质量分数0.5％～1％BSA PBS缓冲液封闭1h；

4)PBST洗液洗板，37℃干燥箱干燥1h～3h制得。

一种抗口蹄疫病毒O型VP1蛋白的单克隆抗体制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)用纯化的口蹄疫O型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；

2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，

3)用间接ELISA方法检测分泌抗FMDV O型VP1蛋白的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆；

4)获得能稳定传代并分泌抗FMDV O型VP1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的有益效果为，1)本发明的产品组成清楚，无需使用者二次配加，仅需按照说明书操作即可完成检测工作；2)本发明所涉及的抗原制备方法、包被板制备方法、单克隆抗体制备方法参数十分重要，是从众多备选的试剂、实验条件中筛选出来，能够经受住严苛的验证过程；3)使用本发明操作方法进行口蹄疫病毒O型抗体检测时间可以控制在3.5小时以内；4)本发明的产品、制备方法在实验可行性、操作便捷性、研发成本、生产成本、使用成本等因素进行了综合考虑，且检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(OIE)推荐的口蹄疫O型ELISA抗体检测方法标准；5)本发明的口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体具有极强的特异性，特异性高达97％；6)本发明试剂盒的敏感性为90％，具有较高敏感性，非常适合口蹄疫病毒O型抗体检测；7)本发明试剂盒采用阻断ELISA的方式检测血清中抗口蹄疫病毒O型抗体，可适用于口蹄疫病毒O型血清抗体的快速诊断、检测和流行病学调查，可以在同行业界内进行推广。

具体实施方式

进一步为，本发明试剂盒中还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

底物液为可溶性TMB；

终止液为1mol/L H₂SO₄溶液。

该部分的参数看似常规，但实际使用时，若超出该范围参数区间的试剂则会直接影响后期的实验效果，且在该区间参数范围内的试剂使用时也有一定讲究，虽不影响后期的实验结果，但会适当影响实验的效果。

本发明的试剂盒各组成部分的体积或数量如下，可以直接生产后作为产品上市。

1)利用Invitrogen公司pFastBacHTA载体(货号10584-027)，扩增口蹄疫病毒O型株VP1基因；(然后与NCBI基因序列号:DQ478937.1的序列进行比较)

3)经抗生素和PCR筛选，获得转座的杆粒Bacmid-FMDV O型VP1；

5)35000rpm超速离心，按超速离心前后体积300：1，用PBS稀释，获得口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原。(举例：离心前300ml，离心后的沉淀用1ml PBS溶解，体积达到300:1)

上述方法中步骤2、3中的PCR参数为，上游引物TTT GAA TTC ACC ACC TCC CCGGGC G，下游引物TTG GTA CCT TCA AAA GCT GTT TTG CGG GT，扩增条件95℃，3min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；4℃保存。使用上述口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原制备包被板的方法，该方法包括以下步骤：

3)洗板3次，用含质量分数0.5％～1％BSA PBS缓冲液封闭1h；

4)PBST洗液洗板，37℃干燥箱干燥1h～3h制得。

以下提供制备上述试剂盒的具体实例：

1、制备口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板：利用Invitrogen公司pFastBacHTA载体(货号10584-027)，扩增口蹄疫病毒O型株(NCBI基因序列号:DQ478937.1)VP1基因，通过PCR和限制性内切酶EcoRI和KpnI，构建得口蹄疫病毒O型pFastBacHTA-FMDV O型VP1质粒，该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞，经抗生素和PCR筛选，获得转座的杆粒Bacmid-FMDV O型VP1。转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，再感染细胞，反复冻融，8000rpm离心，收获上清。35000rpm超速离心，按超速离心前后体积300：1，用PBS稀释，获得口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原。口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原按照1:500～1:1000比列，用pH9.0-10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板(Costar92592)，4℃放置18～24h，洗板3次，用含0.5％～1％BSA PBS缓冲液封闭1h，PBST洗板，干燥1h～3h制得。

2、制备抗口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体：用纯化的口蹄疫O型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗FMDV O型VP1蛋白的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗FMDV O型VP1蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原具有极高的特异性免疫反应，与其它相关病毒(如FMDV A型、FMDV Asia I、BTV、AKV、BVDV等)均没有任何免疫反应。

3、制备强阳性对照：挑选体格健壮的16个月以上的山羊2～3只，将FMDV O型疫苗经背部皮下注射，5mL/只；首免后第2周和第4周分别用FMDV O型疫苗进行二免和三免；待山羊血清中抗FMDV O型抗体酶联免疫吸附试验效价达1:100以上，无菌采血分离血清，离心或过滤除去沉淀，抽滤除菌，3mL/管分装，贴上标签，-80℃保存。

4、阴性对照的制备：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血，用酶联免疫吸附试验方法检测是否有口蹄疫病毒O型抗体，证实无口蹄疫病毒O型抗体的山羊，无菌采血分离血清。3mL/管分装，贴上标签，-80℃保存。

5、制备弱阳性对照：利用阴性对照，倍比稀释口蹄疫病毒O型强阳性对照，采用OIE推荐的ELISA方法进行效价测定，与国际标准阳性血清进行比较，制备口蹄疫病毒O型弱阳性对照。

6、包被缓冲液：0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液(NaHCO₃ 1.465g、Na₂CO₃0.795g或Na₂CO₃.10H₂O 1.2g、水500mL)。溶解后过滤除菌，置于4℃冰箱，一周内使用。

7、单克隆抗体制备：取2D8杂交瘤细胞株，利用20％胎牛血清的IMDM培养基进行培养，收集细胞上清，8000rpm离心，取上清利用ProteinG柱进行纯化，纯化后，稀释成0.48mg/mL进行保存。

8、底物液：TIANGEN(中国)，可溶性单组份TMB(货号：PA107-01)。

9、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液、终止液的优选：本发明通过试验，选定如下最佳的洗涤液、稀释液，终止液配方。

20倍浓缩洗涤液配方：NaCL160g，KH₂PO₄ 4.8g，Na₂HPO₄29g，KCL4g，Tween-2010mL，蒸馏水1000mL，充分溶解，过滤除菌后分装。用时作20倍稀释。

稀释液配方：NaCL8g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO41.44g，KCL 0.2g，蒸馏水1000mL，充分溶解，加入3％BSA，过滤除菌后分装。

终止液：将10.87ml初始浓度为95％～98％的硫酸缓慢加入到89.13ml的去离子水中混匀，即为终止液。

10.羊抗鼠二抗：采用商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(USA，KPL公司，货号074-1806，1.0mg)，作1：50稀释。

11.酶联免疫吸附板：选用商品化的Costar 92592酶联免疫吸附板(CorningIncorporated,Lot No.14609006)。

12、试剂盒的组装：将按上述方法制备好的口蹄疫病毒O型VP1蛋白包被板、单克隆抗体、HRP羊抗鼠二抗、稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照定量分装，分别贴上标签与说明。1份详细的试剂盒使用操作说明书。6张贴板纸。装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。

13、试剂盒中各种试液的配制与分装

试剂盒中试液的配制分装表

使用上述试剂盒进行检测操作的程序如下：

1.试剂工作液的配置

PBST洗液：利用试剂盒提供的20×洗液(洗液中如出现沉淀，37℃加热使其溶解)，用去离子水或蒸馏水进行20倍稀释，即为PBST洗液。

FMDV O型单克隆抗体工作液：用试剂盒提供的稀释液按1:50稀释FMDV O型单克隆抗体(如：10μL单克隆抗体+490μL试剂盒提供稀释液)，即为FMDVO单克隆抗体工作液。

HRP羊抗鼠二抗工作液：用试剂盒提供的稀释液进行1:100稀释HRP羊抗鼠二抗(如：10μLHRP羊抗鼠二抗+990μL稀释液)，即为HRP羊抗鼠二抗工作液。

2.操作步骤：

计算测试样品数量，取所需测试ELISA板条，进行试验。

(1)每孔加入40μL稀释液，然后分别加入：

a：加10μL稀释液到A1，A2孔；

b：加10μL待检血清样品到测试孔中，每孔加一份样品；

c：加10μL FMDV O型强阳性对照到B1，B2，C1，C2孔；

d：加10μL FMDV O型弱阳性对照到D1，D2，E1，E2孔；

e：加10μL FMDV O型阴性对照到F1，F2，G1，G2孔；

37℃连续震荡反应1h；

(2)不要洗板。A1，A2孔加50μL稀释液，其余每孔加入50μL FMDV O型单克隆抗体工作液。

(3)37℃连续震荡反应1h。

(4)用PBST洗液，每孔加250μL，洗板3次，甩干。

(5)每孔加入HRP羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃连续震荡反应1h。

(6)用PBST洗液，每孔加250μL，洗板3次，甩干。

(7)每孔加入底物液100μL，37℃避光静置10min～15min。

(8)每孔加终止液100μL。

(9)用ELISA仪，在450nm波长下读数。

3.结果判定：

①计算公式：

PI(抑制百分率)＝100-血清样本平均OD值/M孔平均OD值*100

②判定标准：

PI	结果
		≥50	阳性
＜50	阴性

注：若每份样品做双孔，在结果判定时如出现1孔PI值大于等于50，1孔PI值小于50时，需重新检测。

注：1.试剂盒置4℃保存。2.可疑样品，需用其它方法进行检测。

试剂盒阳性判定值的确定：按照上述试剂盒的检测程序，采用OIE(2010)《口蹄疫病毒O型病毒中和试验》检测方法，确认的30份阴性对照和120份阳性血清，进行B-ELISA试验后，结果所有阳性血清的PI≥50％，所有阴性对照PI＜50。通过检测阴性血清获得的PI平均值，加上3倍标准偏差，获得B-ELISA阴性判定值(cut-off value)为：PI＜50％被检血清FMDV O型抗体阴性；PI≥50％被检血清FMDV O型抗体阳性。

试剂盒的临床样品检测与应用以及试剂盒敏感性、特异性的评价：按照上述试剂盒的检测程序，用OIE(2010)《口蹄疫病毒O型病毒中和试验》检测方法确认的30份阴性对照和30份阳性血清，进行B-ELISA试验。统计获得试剂盒的特异性为97％(阴性结果数/阴性样品总数＝29/30)，敏感性为90％(阳性结果数/阳性样品总数＝27/30)，本试剂盒的特异性极强，敏感性为良好。

应用上述试剂盒检测云南地区采集的200份血清样本，检出阳性60份，阴性140份，同时用商品化的口蹄疫液相阻断ELISA试剂进行检测，发现本发明的检测试剂盒与液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果均相同。

上述具体实施例的实验数据表明，本发明的口蹄疫病毒O型抗体阻断酶联免疫吸附(B-ELISA)抗体检测试剂盒特异性极强，敏感性好，非常适用于牛、羊口蹄疫病毒O型的快速诊断、检测和流行病学调查。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内(如离心转数等参数)，轻易想到的变化或替换的，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护。

<110> 艾军

周晓黎

段博芳

<120>一种检测牛、羊口蹄疫病毒O型抗体的B-ELISA试剂盒及制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTTGAATTCACCACCTCCCCGGGCG

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTGGTACCTTCAAAAGCTGTTTTGCGGGT

Claims

1.一种检测口蹄疫病毒O型抗体的试剂盒，其特征在于，包括分别放置的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板和口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体；

所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板的制备方法包括以下步骤：

1）利用pFastBacHTA载体，扩增口蹄疫病毒O型株VP1基因；

2）通过PCR和限制性内切酶EcoRI和KpnI，构建得口蹄疫病毒O型pFastBacHTA-FMDV O型VP1重组质粒，所述重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞；PCR参数为，上游引物TTT GAA TTC ACC ACC TCC CCG GGC G，下游引物TTG GTA CCT TCA AAA GCTGTT TTG CGG GT，扩增条件95℃，3min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；4℃保存；

3）经抗生素和PCR筛选，获得转座的杆粒Bacmid-FMDV O型VP1；PCR参数为，上游引物TTT GAA TTC ACC ACC TCC CCG GGC G，下游引物TTG GTA CCT TCA AAA GCT GTT TTG CGGGT，扩增条件95℃，3min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；4℃保存；

4）转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，再感染细胞，反复冻融，8000rpm离心，收获上清；

5）35000rpm超速离心，按超速离心前后体积300:1，用PBS稀释，获得口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原；

6）将口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原按照1:500~1:1000比例，用pH9.0-10.0碳酸盐缓冲液稀释；

7）每孔100ul加入高吸附可拆酶标板，4℃放置18~24h；

8）洗板3次，用含质量分数0.5%~1%BSA的PBS缓冲液封闭1h；

9）PBST洗液洗板，37℃干燥箱干燥1h~3h制得；

所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体制备方法包括以下步骤：

1）用纯化的口蹄疫O型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；

2）取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞；

3）用间接ELISA方法检测分泌抗FMDV O型VP1蛋白的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆；

4）获得能稳定传代并分泌抗FMDV O型VP1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞2D8株；

5）所述的口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞2D8株分泌。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含质量分数0.05%~0.1% Tween-20的0.01mol/L pH 7.4 PBST；稀释液为含质量分数0.05%~3%BSA、0.05%~0.1% Tween-20 pH 7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1mol/ L H₂SO₄溶液。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒各组成部分的体积或数量如下：口蹄疫病毒O型VP1蛋白抗原包被板1块，口蹄疫病毒O型VP1蛋白单克隆抗体0.3mL，强阳性对照0.6 mL，弱阳性对照0.6 mL，阴性对照0.6 mL，HRP标记羊抗鼠二抗0.3mL，20倍浓缩洗涤液50mL，稀释液60 mL，底物液25 mL，终止液25 mL，封板纸6张，说明书1份。