CN110184205A

CN110184205A - 一种青霉素降解菌株的发酵方法

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Publication number: CN110184205A
Application number: CN201810154425.6A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 王小春; 刘守信; 董哲; 徐凯丽
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2018-02-23
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2038-02-23
Also published as: CN110184205B

Abstract

本发明涉及一种青霉素降解菌株的发酵方法，包括如下步骤：步骤S1：将副球菌KDSPL‑02菌悬液离心，并将离心后的沉淀物接种到发酵培养液中；步骤S2：加入微量元素溶液及青霉素，搅拌发酵；步骤S3：每隔8‑16个小时补料一次，补料2‑5次后发酵结束。本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法，发酵工艺容易控制，使用原料易得，成本低，产品活菌数高，易保存，全细胞能有效降解青霉素，可用于高效降解青霉素发酵菌渣中的青霉素残留，实现其无害化处理，为青霉素发酵菌渣资源化综合利用奠定了基础。

Description

一种青霉素降解菌株的发酵方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种青霉素降解菌株的发酵方法。

背景技术

伴随人类对大健康及生物医药的重视程度的提高，全世界医药工业特别是抗生素发酵的生产水平及工业化发展程度可谓日新月异。如：2008年，我国抗生素生产种类达到70种，占世界抗生素总产量的20-30%。然而，伴随制药工业的迅速发展，一些问题也逐渐显现出来，特别是环境污染问题不容忽视。这其中，抗生素发酵生产过程中的固体废弃菌渣被国家明确列为固体废物。据统计2013年我国抗生素产量达到12万吨，按照生产1吨抗生素产生8-10吨菌渣计算，2013年我国抗生素废弃菌渣达到100万吨以上。然而，抗生素生产过程中，实际上只有一部分营养物质被利用转化为抗生素，所以这些废弃菌渣包含有大量未被利用或不能利用的蛋白、多糖、纤维素等营养物质，而这些营养物为易被生物体利用的生物资源。目前采用的无论是焚烧、填埋，还是厌氧发酵产沼气均为破坏性的处理，不仅造成资源的浪费，而且不可避免地产生严重的二次污染。所以，开发选择性地仅降解青霉素，其他成分能有效保留的技术，如生物法无害化处理技术，是十分迫切的课题，也成为整个发酵制药行业的难题。

发明内容

为解决这一难题，本发明提供了一种青霉素降解菌株的发酵方法，包括如下步骤：

步骤S1：将副球菌KDSPL-02菌悬液离心，并将离心后的沉淀物接种到发酵培养液中；

步骤S2：加入微量元素溶液及青霉素，搅拌发酵；

步骤S3：每隔8-16个小时补充一次发酵培养液，以实现发酵，补料2-5次后发酵结束。

其中，所述步骤S1中，发酵培养液所包括的成分及各成分的浓度如下：磷酸氢二钾1.1-2.2g/L、磷酸二氢钾0.2-1.0 g/L、氯化钙0.010-0.031g/L、七水硫酸镁0.1-0.45 g/L、六水氯化铁 0.0016-0.0040 g/L、硝酸铵0.18-0.85 g/L、酵母浸膏1.4-3.8 g/L及液糖8-35ml/L。

其中，所述步骤S2中，微量元素选自下述成分中的至少一项，各成分及其浓度为：六水氯化镍 ≦0.02 mg/0L、二水钼酸钠 ≦0.038 mg/L、六水氯化钴 ≦0.018 mg/L、七水硫酸锌 ≦0.21 mg/L、核黄素 0.001-0.009 mg/L、盐酸吡哆醛 0.005-0.027 mg/L。

其中，所述步骤S1中，副球菌KDSPL-02菌的接种量介于1-12%；

所述步骤S2中，青霉素的加入量介于2-60mg/L，搅拌速度介于60-150r/min；

所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的10%-60%。

其中，所述步骤S1中，副球菌KDSPL-02菌的接种量介于2-8%；

所述步骤S2中，青霉素的加入量介于20-50mg/L；

所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的25%-45%。

其中，所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的30%-50%。

其中，发酵温度介于25-39℃。

其中，发酵pH值介于6.5-7.8。

其中，所述发酵pH值介于6.8-7.2，通过20%氨水控制。

本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法，发酵工艺容易控制，使用原料易得，成本低，产品活菌数高，易保存，全细胞能有效降解青霉素，可用于高效降解青霉素发酵菌渣中的青霉素残留，实现其无害化处理，为青霉素发酵菌渣资源化综合利用奠定了基础。

具体实施方式

为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。

利用生物法进行选择性地降解抗生素残留是一种绿色可行的方法，可用于青霉素废菌渣的清洁、资源化处理。而发酵是获得高活性细菌制剂的有效途径，也是保证后期的应用的首要条件。采用间歇和连续补加新鲜培液，可使菌体复制时间延长以实现发酵。

本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法，所发酵的菌株为副球菌，分类命名为Paracoccus sp.，菌株编号为KDSPL-02，为河北科技大学药用分子实验室筛选，已于2016年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12494，地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。

为了获得高活性副球菌KDSPL-02菌体，本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法，具体操作步骤如下：

步骤S1：将副球菌KDSPL-02菌悬液离心，并将离心后的沉淀物，按照1-12%，较佳为2-8%的接种量接种到发酵培养液中；发酵培养液所包括的成分及各成分的浓度如下：磷酸氢二钾1.1-2.2g/L、磷酸二氢钾0.2-1.0 g/L、氯化钙0.010-0.031g/L、七水硫酸镁0.1-0.45 g/L、六水氯化铁 0.0016-0.0040 g/L、硝酸铵0.18-0.85 g/L、酵母浸膏1.4-3.8 g/L及液糖8-35ml/L。副球菌KDSPL-02菌的接种量介于1-12%，优选2-8%，接种量的多少依据接种细胞的活性而定，以满足实际应用。

步骤S2：加入微量元素溶液及青霉素，以60-150r/min的速度搅拌发酵。微量元素选自下述成分中的至少一项，各成分及其浓度为：六水氯化镍 ≦0.02 mg/L、二水钼酸钠≦0.038 mg/L、六水氯化钴 ≦0.018 mg/L、七水硫酸锌 ≦0.21 mg/L、核黄素 0.001-0.009 mg/L、盐酸吡哆醛 0.005-0.027 mg/L。青霉素的加入量介于2-60mg/L，优选量为20-50mg/L，过量加入将抑制细胞的活性。

步骤S3：每隔8-16个小时补充一次发酵培养液，补料2-5次后发酵结束，发酵温度介于25-39℃，发酵pH值介于6.5-7.8，较佳介于6.8-7.2，通过20%氨水控制发酵pH值，补料体积介于初始培养液体积的10%-60%，较佳为25%-45%或者30%-50%。

根据本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法所获得的降解菌株，可实现青霉素全细胞的完全降解，青霉素浓度为100mg/L以下时，48h完全降解；可降解青霉素的最高浓度为800mg/L，并且，72h可实现彻底降解。

根据本发明提供的青霉素降解菌株的发酵方法，可获得青霉素高效降解菌细胞菌体量（OD₆₀₀）大于10.0，且青霉素降解活性U≧6.8单位的活细胞菌株。

其中，细胞菌体量OD₆₀₀通过分光光度法测得，选择的光的波长为600nm。细胞菌体的活性通过HPLC测得，其单位是U，代表每小时0.01mL湿的全细胞所能降解青霉素的mg数。而降解产物应为无机小分子。

细胞菌体活性的具体测定方法为：取30ml的发酵液，2800rpm/min离心10min，将湿菌体加入青霉素水溶液中搅拌。仅离心分离，获取上清液，以C18柱，流动相为磷酸二氢钾(0.500 mol L^-1，磷酸溶液调节pH至3.5):三蒸水:甲醇= 1:4:5 (V/V/V),高效液相色谱仪测定青霉素减少量。

本发明所确定的青霉素水溶液中青霉素降解率所采用的公式是：

底物降解率（%）=（初始底物浓度-剩余底物浓度）/初始底物浓度×100%

为进一步了解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例加以说明。本发明实施例所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

1、将Paracoccus sp.KDSPL-02种子液以5%接种量接种于由1.6 g/L磷酸氢二钾、0.4g/L磷酸二氢钾、0.025 g/L氯化钙、0.2 g/L七水硫酸镁、0.0023 g/L六水氯化铁、0.5 g/L硝酸铵、2.4 g/L酵母浸膏和10ml/L液糖组成的发酵培养液。

2、同时加入由0.01 mg/L六水氯化镍、0.02 mg/L二水钼酸钠、0.01 mg/L六水氯化钴、0.1 mg/L七水硫酸锌、0.005 mg/L核黄素、0.01 mg/L盐酸吡哆醛组成的微量元素溶液和45mg/L青霉素，于35℃和120r/min搅拌条件下发酵36h。

3、过程中用20%氨水调节pH值在6.8-7.0，并每隔12h，补料一次，补料体积为发酵培养基起始体积的30-50%。

所得全细胞的生物量OD600为13.5，青霉素降解活性为7.2U。

实施例2：

1、将Paracoccus sp.KDSPL-02种子液以8%接种量接种于由2.0 g/L磷酸氢二钾、0.8g/L磷酸二氢钾、0.03 g/L氯化钙、0.4 g/L七水硫酸镁、0.004 g/L六水氯化铁、0.8 g/L硝酸铵、3.5 g/L酵母浸膏和25ml/L液糖组成的发酵培养液。

2、同时加入由0.02 mg/L六水氯化镍、0.03 mg/L二水钼酸钠、0.015 mg/L六水氯化钴、0.2 mg/L七水硫酸锌、0.008 mg/L核黄素、0.02 mg/L盐酸吡哆醛组成的微量元素溶液和50mg/L青霉素，于35℃和150r/min搅拌条件下发酵36h。

所得全细胞的生物量OD600为15.3，青霉素降解活性为6.8U。

实施例3：

1、将Paracoccus sp.KDSPL-02种子液以3%接种量接种于由1.2 g/L磷酸氢二钾、0.6g/L磷酸二氢钾、0.01 g/L氯化钙、0.3 g/L七水硫酸镁、0.003 g/L六水氯化铁、0.2 g/L硝酸铵、1.5 g/L酵母浸膏和20ml/L液糖组成的发酵培养液。

2、同时加入由0.01 mg/L六水氯化镍、0.01 mg/L二水钼酸钠、0.02 mg/L六水氯化钴、0.1 mg/L七水硫酸锌、0.002 mg/L核黄素、0.01 mg/L盐酸吡哆醛组成的微量元素溶液和20mg/L青霉素，于32℃和100r/min搅拌条件下发酵36h。

所得全细胞的生物量OD600为12，青霉素降解活性为7.5U。

虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S2：加入微量元素溶液及青霉素，搅拌发酵；

步骤S3：每隔8-16个小时补充一次发酵培养液，补料2-5次后发酵结束。

2.如权利要求1所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：所述步骤S1中，发酵培养液所包括的成分及各成分的浓度如下：磷酸氢二钾1.1-2.2g/L、磷酸二氢钾0.2-1.0g/L、氯化钙0.010-0.031g/L、七水硫酸镁0.1-0.45 g/L、六水氯化铁 0.0016-0.0040 g/L、硝酸铵0.18-0.85 g/L、酵母浸膏1.4-3.8 g/L及液糖8-35ml/L。

3. 如权利要求1所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：所述步骤S2中，微量元素选自下述成分中的至少一项，各成分及其浓度为：六水氯化镍 ≦0.02 mg/L、二水钼酸钠 ≦0.038 mg/L、六水氯化钴 ≦0.018 mg/L、七水硫酸锌 ≦0.21 mg/L、核黄素 0.001-0.009 mg/L、盐酸吡哆醛 0.005-0.027 mg/L。

4.如权利要求1所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：

所述步骤S1中，副球菌KDSPL-02菌的接种量介于1-12%；

所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的10%-60%。

5.如权利要求4所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：

所述步骤S1中，副球菌KDSPL-02菌的接种量介于体积比2-8%；

所述步骤S2中，青霉素的加入量介于20-50mg/L；

所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的25%-45%。

6.如权利要求4所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：所述步骤S3中，补料体积介于初始培养液体积的30%-50%。

7.如权利要求1所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：发酵温度介于25-39℃。

8.如权利要求1所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：发酵pH值介于6.5-7.8。

9.如权利要求8所述的青霉素降解菌株的发酵方法，其特征在于：所述发酵pH值介于6.8-7.2，通过20%氨水控制。