CN113957022B

CN113957022B - 一种复合微生物菌剂的制备方法及其应用

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Publication number: CN113957022B
Application number: CN202111496954.2A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 于枭燕; 霍凯; 赵国群
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2024-06-25
Anticipated expiration: 2041-12-09

Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂的制备方法，是将功能性芽孢杆菌和微藻混合、离心、重悬后制备而成；本发明还提供了上述复合微生物菌剂的应用，用于去除淀粉废水中的有机质，同时制备可再生能源。本发明的制备方法利用功能性芽孢杆菌和微藻之间的共生协同作用，促进微藻和功能性芽孢杆菌大量增殖，从而有效提高复合微生物菌剂的生物量，适用于复合微生物菌剂的制备，所制复合微生物菌剂进一步应用于去除淀粉废水中的有机质，也可用于可再生能源的制备。

Description

一种复合微生物菌剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及微生物菌剂，具体地说是一种复合微生物菌剂的制备方法及其应用。

背景技术

众所周知，生物质能源是地球上最普遍的一种可再生能源，它是通过植物光合作用，将太阳能以化学能的形式贮存在生物体内的一种能量形式，被称为绿色能源。其中，微藻以其具有种类多样、生物产量高、生长繁殖快、生长周期短和自身合成油脂能力强、不需占用农业用地、环境适应能力强等特点，被认为是理想的产能生物。而微藻在生长过程中需要大量的水资源、碳源、氮磷营养盐。

淀粉废水是以玉米、马铃薯、小麦、大米等农产品为原料生产淀粉或淀粉深加工产品淀粉糖、葡萄糖、淀粉衍生物等物质过程中产生的废水，它属于高浓度有机废水，含有大量的溶解性淀粉和少量的蛋白质等物质，其化学需氧量和总氮排放量均处于较高的水平，若废水被直接排放入环境水体，会造成水体富营养化、腐败变质严重等环境污染问题，且无法有效利用废水中的有机质，造成了资源的严重浪费，故淀粉废水必须经过处理后才能进行排放。但淀粉废水的处理过程难度大、成本高，因此，人们针对氨氮、磷、总氮等污染物的治理进行了广泛的研究。

将微藻生长与淀粉废水处理联系在一起，微藻细胞在生长过程中可利用淀粉废水中的底物，以水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化三种形式将废水中的有机氮磷等物质转化为自身所需的高能有机化合物，从而有效地消耗淀粉废水中氮、磷等有机物。这一联系即利用了淀粉废水中丰富的营养物质，又促进了生物质生产力，可以达到双重优化的效果。

传统生物技术与物化技术在去除淀粉废水中的有机质时，一方面需要消耗能源，另一方面需要进一步保持微生物的活性与深度处理才能完成氮磷元素的高效去除。迄今已筛选出多种可高效净化水质的藻种，尤以绿藻居多。然而，藻类生长速度相对缓慢，且对淀粉废水中某些较复杂的有机物、有机氮的利用能力不强。因此，对于含有大量有机物的淀粉废水，需要有额外的措施强化其处理效能。

现有技术，授权公告号CN 110128181 A的中国发明专利，公开了一种基于沼液的藻菌肥料的生产装置，可利用沼液为发酵原料连续生产含有益生菌及养分(N、P、K)的沼液肥料，并可用于培养小球藻或光合细菌，但是没有具体说明对沼液废水各个营养物质的去除效果，也没有说明藻菌在废水中的具体生长情况和藻菌混合培养处理废水的研究；授权公告号CN 107629962 A的中国发明专利，公开了一种利用分子印迹介孔材料制备的仿蜂巢反应室处理淀粉废水培养微藻的方法，但并未给出藻菌共培养的启示；授权公告号CN104357327 A的中国发明专利，公开了一种利用豆制品废水大规模培养微藻的方法，可以节约大量水资源和营养盐，大大降低微藻的培养成本，又可以有效地去除废水中的COD、TN、TP，但并未披露大幅提升微藻生物量的方法。

发明内容

本发明的目的，旨在提供一种复合微生物菌剂的制备方法，以在所制复合微生物菌剂使用时，能提高藻类在淀粉废水中生长速度，从而实现复合微生物菌剂在去除淀粉废水中的有机质的同时，还可以制备可再生能源的效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种复合微生物菌剂的制备方法，该培养方法包括依次进行的以下步骤：

S1.将功能性芽孢杆菌依次进行斜面培养、种子培养和发酵培养至对数期后，离心取沉淀物、重悬，得功能性芽孢杆菌菌泥；另外，

S2.将微藻进行高密度培养至对数期、离心取沉淀物、重悬，得微藻藻泥；

S3.取功能性芽孢杆菌菌泥和微藻藻泥，经混合、离心、重悬，即得所述复合微生物菌剂。

作为一种限定，步骤S1中，所述功能性芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；

所述斜面培养，温度为30-37℃，时间为24-48h，培养基为LB固体培养基，培养基质中琼脂的重量为培养基总重量的2-5％。

作为另一种限定，步骤S1中，所述种子培养，是将斜面培养结束后得到的功能性芽孢杆菌菌种，转接至液体种子培养基中进行震荡培养，得一级种子液；将一级种子液接入新的液体种子培养基中进行再培养，得二级种子液。

作为进一步限定，所述震荡培养，温度为30-37℃，时间为24-36h，转速为150-300rpm；

所述再培养，接种量与培养基体积比为1:50，温度为30-37℃，时间为24-36h，转速为150-300rpm；

所述液体种子培养基，以重量份数计包括：无水葡萄糖20-35份、蛋白胨8-15份、酵母浸粉3-8份、磷酸二氢钾3-6份、碳酸钙2-3份、硫酸铵2-3份。

作为第三种限定，步骤S1中，所述发酵培养，温度为30-37℃，时间为24-36h，转速为150-300rpm；

培养基以重量份数计包括：蛋白胨8-15份、酵母提取物3-8份、氯化钠8-15份，pH为7.4；

所述离心，转速为4000-8000rpm，时间为3-10min；

所述重悬是在超纯水中重悬三次。

作为第四种限定，步骤S2中，所述微藻为蛋白核小球藻、鱼腥藻、小单歧藻；

所述高密度培养，是将无菌小球藻γ于23-30℃、光照强度为2000-2800lux、光照周期为24h：0h明暗比的条件下，在BG11液体培养基中培养至对数生长期，得无菌小球藻ψ；

所述离心，转速为6000-10000rpm，时间为8-15min；

所述重悬是在超纯水中重悬三次；

所述BG-11培养基，以重量份数计包括：100-200份的NaNO₃、3-5份的K₂HPO₄、6-9份的MgSO₄·7H₂O、3-4份的CaCl₂·2H₂O、0.5-0.7份的ammoniumcitrate、0.5-0.7份的ferr icammonium citrate、0.1-0.2份的EDTA-Na₂、1-3份的Na₂CO₃和100-300份的A5培养液。

作为进一步限定，所述A5培养液，以重量份数计包括：2-3份的H₃BO₃、1.5-2份的MnCl₂·4H₂O、0.2-0.3份的ZnSO₄·7H₂O、0.3-0.5份的Na₂MoO₄·2H₂O、0.05-0.1份的CuSO₄·5H₂O、0.03-0.09份的Co(NO₃)₂·6H₂O。

作为第五种限定，步骤S3中，所述功能性芽孢杆菌菌泥和微藻藻泥的体积比为1：0.8-1.5；

所述离心，转速为4000-8000rpm，时间为3-10min；

所述重悬是在超纯水重悬三次。

本发明还提供了上述复合微生物菌剂的一种应用，所述复合微生物菌剂通过权利要求1-8中任意一项所述的一种复合微生物菌剂的制备方法制得，所述复合微生物菌剂用于去除淀粉废水中的有机质。

本发明还提供了上述复合微生物菌剂的另一种应用，所述复合微生物菌剂通过权利要求1-8中任意一项所述的一种复合微生物菌剂的制备方法制得，所述复合微生物菌剂用于制备可再生能源-生物柴油。

由功能性芽孢杆菌和微藻复配而成的复合微生物菌剂，可以通过将小球藻内油脂进行甲酯化的方法制备可再生能源生物柴油，其利用的原理为微藻通过光合作用将光能和CO₂转化生成油脂，油脂与甲醇等物质进行转酯化反应最终可形成生物柴油，因此提高藻细胞内总脂含量对微藻生物柴油的制备具有重要意义。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

①本发明的复合微生物菌剂的制备方法中，选用的功能性芽孢杆菌，可以大量分泌谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、柠檬酸和甜菜碱等胞外分泌物，而这些胞外分泌物是微藻生长所必需的微量元素，具有促进微藻生长、繁殖的有益效果；

②本发明的复合微生物菌剂的制备方法中，选用的微藻可以大量分泌磷酸和肌醇等胞外分泌物，而这些胞外分泌物是功能性芽孢杆菌生长所必需的微量元素，具有促进功能性芽孢杆菌生长、繁殖的有益效果；

③本发明的复合微生物菌剂的的应用中，将微藻与功能性芽孢杆菌进行混合培养，通过协同和优势互补，提升了微生物菌剂的生物量；

④本发明的复合微生物菌剂，可以充分利用淀粉废水中的有机质，作为自身生长所需的营养物质，在有效去除淀粉废水中的有机质的同时，还可以制备可再生能源。

本发明的制备方法适用于制备复合微生物菌剂，所制备的复合微生物菌剂适用于去除淀粉废水中的有机质，同时制备可再生能源。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明；

图1为本发明实施例5中蛋白核小球藻上清液、枯草芽孢杆菌上清液和复合微生物菌剂ε上清液的胞外分泌物检测结果；

图2为本发明实施例5中蛋白核小球藻上清液中的胞外分泌物对枯草芽孢杆菌生长影响的检测结果；

图3为本发明实施例5中枯草芽孢杆菌上清液中的胞外分泌物对蛋白核小球藻生长影响的检测结果；

图4为本发明实施例6中功能性芽孢杆菌和蛋白核小球藻的混合培养基中芽孢杆菌和小球藻的密度；

图5为本发明实施例6中功能性芽孢杆菌和蛋白核小球藻的淀粉废水中芽孢杆菌和小球藻的密度。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

生物材料：

小球藻：来自于阿尔格生物科技有限公司；

枯草芽孢杆菌：来自于河北省发酵技术创新中心(河北科技大学)实验室；

实施例1一种微藻的培养方法

本实施例包括依次进行的以下步骤：

取菌体密度为1×10⁶cfu/mL的无菌小球藻γ10mL，于BG11液体培养基中进行培养，培养温度为26℃、光照强度为2400lux、光照周期为24h：0h明暗比，培养至对数生长期后，得无菌小球藻ψ培养液，将无菌小球藻ψ培养液在8000rpm条件下离心10min，用超纯水重悬浮三次，得蛋白核小球藻藻泥，即微藻藻泥X₁；

其中，BG11液体培养基中各组分的含量如表1所示：

表1 BG11液体培养基配方

主要成分	浓度值
		NaNO₃(g/L)	1.5
K₂HPO₄(g/L)	0.04
		MgSO₄·7H₂O(g/L)	0.075
CaCl₂·2H₂O(g/L)	0.036
		Ammonium citrate(g/L)	0.006
Ferric ammonium citrate(g/L)	0.006
		EDTA-Na₂(g/L)	0.001
Na₂CO₃(g/L)	0.02
		微量元素A5溶液(mL/L)	1

BG-11固体培养基α，是在BG11液体培养基中加入BG11液体培养基总重量2％的琼脂，混合均匀后制备而成的；

其中，微量元素A5溶液中各组分的含量如表2所示。

表2微量元素A5溶液成分配方

实施例2-6微藻的培养方法

实施例2-6分别为一种蛋白核小球藻的培养方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于原料用量及工艺参数的不同，具体详见表3：

表3实施例2-6中各项工艺参数一览表

其中，实施例2-6中BG11液体培养基中各组分的含量如表4所示：

表4实施例2-6中BG11液体培养基配方

其中，实施例2-6中微量元素A5溶液中各组分的含量如表5所示：

表5实施例2-6中微量元素A5溶液成分配方

实施例2-6分别制备出微藻藻泥X₂-X₆。

实施例7一种功能性芽孢杆菌的培养方法

S1.菌种斜面培养：以划线的方式将枯草芽孢杆菌接种到含有2％重量琼脂的LB固体斜面培养基上，在37℃下培养24h，得菌种δ；

S2.种子培养：将菌种δ转接到种子培养基，在30℃，转速为200rpm条件下摇晃培养30h，得一级种子液，将一级种子液按2％的接种量接入新的种子培养基中，在37℃，200rpm条件下培养24h，得二级种子液；

S3.发酵培养：将二级种子液按照2％体积比的接种量接入LB培养基中，在35℃，200rpm条件下进行发酵培养24h，至对数生长期后，在4000rpm条件下离心10min，用超纯水重悬浮，重复三次，得枯草芽孢杆菌菌泥，即功能性芽孢杆菌菌泥Y₁；

其中，LB培养基的组分为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，LB培养基的pH为7.4；

种子培养基的组分为:无水葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、磷酸二氢钾4.5g/L、碳酸钙2.5g/L、硫酸铵2.5g/L。

实施例8-12功能性芽孢杆菌的培养方法

实施例8-12分别为一种功能性芽孢杆菌的培养方法，它们的步骤与实施例7基本相同，不同之处仅在于原料用量及工艺参数的不同，具体详见表6：

表6实施例8-12中各项工艺参数一览表

实施例8-12分别制备出功能性芽孢杆菌菌泥Y₂-Y₆；

其中，实施例8-12中LB培养基中各组分的含量如表7所示：

表7实施例8-12中LB培养基配方

其中，实施例8-12中种子培养基中各组分的含量如表8所示：

表8实施例8-12中种子培养基配方

实施例13一种复合微生物菌剂的制备方法

取0.5L密度为8×10⁶cfu/mL的功能性芽孢杆菌菌泥Y₁和0.5L密度为1.1×10⁵cfu/mL的微藻藻泥X₁，混合后在6000转速下进行离心10min，取沉淀物在超纯水中重悬三次，得复合微生物菌剂Z₁。

实施例14-18复合微生物菌剂的制备方法

实施例14-18分别为一种复合微生物菌剂的培养方法，它们的步骤与实施例13基本相同，不同之处仅在于原料用量及工艺参数的不同，具体详见表9：

表9实施例14-18中各项工艺参数一览表

实施例14-18分别制备出复合微生物菌剂Z₂-Z₆。

实施例19复合微生物菌剂处理玉米浆淀粉废水的验证

S1.取3L玉米浆淀粉废水静置4h后去除沉淀，将pH值调节至7，得玉米浆淀粉废水A₁，对玉米浆淀粉废水A₁进行水质测试，测试结果如表3所示：

表10玉米浆淀粉废水A1水质测试结果

有机质	COD(mg/L)	总氮(mg/L)	总磷(mg/L)	氨氮(mg/L)
					含量	8098.83	531.86	164.15	600.824

取300mL(接种量10％)复合微生物菌剂Z₆接种于玉米浆淀粉废水A₁中，控制玉米浆淀粉废水A₁中蛋白核小球藻密度为1.1×10⁵cfu/mL，枯草芽孢杆菌密度为8×10⁶cfu/mL，在光照强度2400lux，温度30℃，转速140rpm的条件下对玉米浆淀粉废水A₁进行处理，8天后，分别采用快速分光光度法测定、GB/T11894—89碱性过硫酸钾紫外分光光度法、GB/T11893—89钼酸铵分光光度法和纳氏试剂分光光度法对废水中的COD、TN、TP和氨氮的去除率进行测定，经测定COD的去除率为90％，总氮去除率为82％，总磷去除率为氨氮去除率为78％，氨氮去除率为64％。

实施例20功能性芽孢杆菌和蛋白核小球藻协同作用的验证

对照一组：蛋白核小球藻

对照二组：枯草芽孢杆菌

实验组：复合微生物菌剂Z₃

实验方法：将对照一组、放置于BG11培养基中，在28℃、140rpm、光照强度2400Lux条件下培养7天，在4℃、10000rpm下离心10min。

对照二组和实验组分别置于LB培养基和BG11培养基中，对照二组在37℃、200rpm的条件下培养24h，实验组放置于BG11培养基中，在28℃、140rpm、光照强度2400Lux条件下培养7天。分别取对照一组、对照二组和实验组的培养液在10000转速下离心10min，取上清液，得蛋白核小球藻上清液、枯草芽孢杆菌上清液和复合微生物菌剂Z₃上清液，置于液氮中存放20min后，对三种上清液中的胞外分泌物进行检测，检测结果如图1所示；

由图1可知，蛋白核小球藻上清液中的胞外分泌物主要为磷酸和肌醇；

枯草芽孢杆菌上清液的胞外分泌物主要为谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、柠檬酸和甜菜碱；

复合微生物菌剂ε上清液的胞外分泌物主要为谷氨酸、异亮氨酸、维生素B6、苯丙氨酸；

采用代谢物体外验证实验，将蛋白核小球藻上清液中的胞外分泌物分别加入到枯草芽孢杆菌培养液中，观察蛋白核小球藻上清液中的胞外分泌物对枯草芽孢杆菌的生长影响，结果如图2所示；

由图2可知，当添加的磷酸浓度为0.1g/L和0.5g/L时，均能促进芽孢杆菌的生长，而浓度为0.1g/L时，促进率为8％，浓度为0.5g/L时，提高率为7％；添加肌醇对芽孢杆菌的生长有促进作用，肌醇添加浓度为1g/L时，芽孢杆菌的生长速度最快，当添加肌醇至浓度为1g/L的8h后，对芽孢杆菌生长的提高率达到30％；

采用代谢物体外验证实验，将枯草芽孢杆菌上清液中的胞外分泌物分别加入到蛋白核小球藻培养液中，观察枯草芽孢杆菌上清液中的胞外分泌物对蛋白核小球藻的生长影响，结果如图3所示；

由图3可知，当添加的谷氨酸浓度达到0.1g/L时，对小球藻的生物量提高了94.3％；当添加的脯氨酸浓度达到0.15g/L时，对小球藻的生物量提高了110％；当添加的酪氨酸浓度达到0.1g/L时，对小球藻的生物量提高了70.3％；当添加的甘氨酸浓度达到2g/L时，对小球藻的生物量提高了268％；当添加的柠檬酸浓度达到0.1g/L时，对小球藻的生物量提高了16.7％；当添加的甜菜碱浓度为0.05g/L时，对小球藻的生物量提高了15.08％。

实施例21功能性芽孢杆菌和蛋白核小球藻共培养体系效果验证

空白一组：100mL培养至对数生长期的小球藻的BG11培养基；

空白二组：100mL培养至对数期的枯草芽孢杆菌LB培养基；

实验一组：100mL培养至对数生长期的小球藻，与100mL培养至对数期的枯草芽孢杆菌BG11培养基；

实验二组：100mL培养至对数生长期的小球藻，与100mL培养至对数期的枯草芽孢杆菌的淀粉废水溶液；

实验方法：将空白一组、空白二组、实验一组和实验二组同时置于在温度为28℃、光照强度为2400Lux、140rpm的磁场光照培养箱中培养5天后，取出分别测定空白一组、空白二组、实验一组和实验二组中微生物的密度；

经测定，空白一组中，小球藻的密度为0.58×10⁷cfu·mL^-1；

空白二组中，芽孢杆菌的密度为4.5×10⁷cfu·mL^-1；

实验一组的检测结果如图4所示，其中，芽孢杆菌的密度为6.6×10⁷cfu·mL^-1，小球藻的密度为0.85×10⁷cfu·mL^-1；相较于空白二组中芽孢杆菌的密度提升了31.8％，相较于空白一组中小球藻生物量提高了46.6％；

实验二组的检测结果如图5所示，其中，芽孢杆菌的密度为8.6×10⁷cfu·mL^-1，小球藻的密度为0.78×10⁷cfu·mL^-1；相较于空白二组中芽孢杆菌的密度提升了91.1％，相较于空白一组中小球藻生物量提高了34％。

实施例22枯草芽孢杆菌接入时间点对蛋白核小球藻生物量的影响

将培养至对数期的小球藻分别接种至A、B、C、D、E五个培养基中，分别于接种后0h、12h、24h、36h、48h后向五个培养基中接种培养至对数期的枯草芽孢杆菌，且五个培养基中小球藻和枯草芽孢杆菌的接种量均相同，待发酵结束后，检测A、B、C、D、E五个培养基中藻菌生物量来获得最优接菌时间，检测结果如表4所示：

表4小球藻培养时间点接入枯草芽孢杆菌

培养基	接入时间(h)	发酵周期(h)	小球藻密度(cfu/mL)	枯草芽孢杆菌密度(cfu/mL)
					A	0	168	3.5×10⁷	1.42×10⁷
B	12	336	2.96×10⁷	1.02×10⁷
					C	24	192	4.2×10⁷	2.15×10⁷
D	36	120	3.23×10⁷	1.25×10⁷
					E	48	100	2.75×10⁷	0.8×10⁷

由表4可知，当小球藻培养24h时接入枯草芽孢杆菌后获得的小球藻生物量最高，其中，小球藻密度为4.2×10⁷cfu·mL^-1，枯草芽孢杆菌密度为2.15×10⁷cfu·mL^-1。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims

1.一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，所述复合微生物菌剂用于去除淀粉废水中的有机质；

所述复合微生物菌剂的制备方法包括依次进行的以下步骤：

S3.取功能性芽孢杆菌菌泥和微藻藻泥，经混合、离心、重悬，即得所述复合微生物菌剂；

所述功能性芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；

所述微藻为小单歧藻。

2.根据权利要求1所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，步骤S1中，所述斜面培养，温度为30-37℃，时间为24-48h，培养基为LB固体培养基，培养基质中琼脂的重量为培养基总重量的2-5%。

3.根据权利要求1所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，步骤S1中，所述种子培养，是将斜面培养结束后得到的功能性芽孢杆菌菌种，转接至液体种子培养基中进行震荡培养，得一级种子液；将一级种子液接入新的液体种子培养基中进行再培养，得二级种子液。

4.根据权利要求3所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，所述震荡培养，温度为30-37℃，时间为24-36h，转速为150-300rpm；

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，步骤S1中：

所述发酵培养，温度为30-37℃，时间为24-36h，转速为150-300rpm；

所述离心，转速为4000-8000rpm，时间为3-10min；

所述重悬是在超纯水中重悬三次。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，步骤S2中：

所述离心，转速为6000-10000rpm，时间为8-15min；

所述重悬是在超纯水中重悬三次；

所述BG-11培养基，以重量份数计包括：100-200份的NaNO₃、3-5份的K₂HPO₄、6-9份的MgSO₄·7H₂O、3-4份的CaCl₂·2H₂O、0.5-0.7份的ammoniumcitrate、0.5-0.7份的ferricammonium citrate、0.1-0.2份的EDTA-Na₂、1-3份的Na₂CO₃和100-300份的A5培养液；

所述A5培养液，以重量份数计包括：2-3份的H₃BO₃、1.5-2份的MnCl₂·4H₂O、0.2-0.3份的ZnSO₄·7H₂O、0.3-0.5份的Na₂MoO₄·2H₂O、0.05-0.1份的CuSO₄·5H₂O、0.03-0.09份的Co(NO₃)₂·6H₂O。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种复合微生物菌剂的应用，其特征在于，步骤S3中，所述离心，转速为4000-8000rpm，时间为3-10min；

所述重悬是在超纯水重悬三次。