CN110184179A - 一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法 - Google Patents

一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法，包括移动装置、反应纸条、检测纸条、样品输入部件、电压导针；所述移动装置安装在反应纸条上，所述移动装置为能够使反应纸条接触检测纸条或远离检测纸条的装置；所述反应纸条负载丁酰胆碱酯酶探针，所述丁酰胆碱酯酶探针包括金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物，金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物通过Au‑S键连接，所述检测纸条设有能够与纸喷雾质谱检测装置配合的尖端；所述样品输入部件为能够将检测样品输送至反应纸条的装置，所述样品输入部件与反应纸条配合；所述电压导针为能够将高压直流电源提供的电压提供给检测纸条的导针。

Description

一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法
技术领域
本公开属于分析检测技术领域，涉及一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
丁酰胆碱酯酶(BuChE)主要由肝脏合成并立即释放到血浆中，因此血清中丁酰胆碱酯酶的活性是测定肝细胞蛋白质合成功能的灵敏指标。临床中，测定血清丁酰胆碱酯酶活性是诊断有机磷化合物如有机磷毒气、有机磷农药和可卡因等中毒的重要途径之一。另外，近年来研究表明，丁酰胆碱酯酶的活性与许多神经性疾病机制相关，如可用与协助阿尔茨海默症的诊断。因此，BuChE是一项重要的酶学指标，开发相应的检测装置具有重要的意义。
据本公开发明人研究了解，目前测定丁酰胆碱酯酶常用的测定方法有：pH指示剂试纸法、pH差示法、免疫分析法、连续监测法、比色法等。临床生化检验中以连续监测法和比色法应用最多，pH差示法由于方法简单，也较常用。连续监测法主要用自动生化分析仪测量血浆(血清)中的活力。将血浆(血清)样品与商品试剂盒溶液(主要成分为DTNB、碘化丁酰硫代胆碱和磷酸盐缓冲液)1：150混合后，通过连续监测反应体系90s内的吸光度变化来计算丁酰胆碱酯酶的活性。目前临床检验科即采用此检测方法，其特点是试剂商品化，不需终止反应，检验迅速，但对检验设备要求较高。Ellman比色法的原理为丁酰胆碱被丁酰胆碱酯酶水解生成丁酸和胆碱，胆碱与5,5-二硝基-双-2硝基苯甲酸(DTNB)生成黄色物质，通过对黄色物质的测定来推算反应体系中的丁酰胆碱酯酶的含量。此方法的灵敏度较高，但较易受到反应体系中其它物质的干扰而产生误差。pH差示法是用丁酰胆碱作基质，丁酰胆碱酯酶水解丁酰胆碱生成乙酸会引起pH值下降，通过pH的降低来计算酶活性。该法快速简单，但在测全血丁酰胆碱酯酶活性的时候需要抑制掉乙酰胆碱酯酶活性，否则会对结果产生影响。据本公开发明人研究发现，以上方法存在操作过程繁琐、误差较大、样品量大、成本较高、检测时间较长等缺陷。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本公开基于酶反应器的恒温保湿的特点以及质谱精确快速高通量的优势，建立快速高效的集反应和检测于一体的反应器质谱法检测丁酰胆碱酯酶，然而，现有技术中并没有关于检测丁酰胆碱酯酶一体化的反应器，从而难以实现快速高效的质谱法检测丁酰胆碱酯酶，因而本公开的目的是提供一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，包括移动装置、反应纸条、检测纸条、样品输入部件、电压导针；
所述移动装置安装在反应纸条上，所述移动装置为能够使反应纸条接触检测纸条或远离检测纸条的装置；
所述反应纸条负载丁酰胆碱酯酶探针，所述丁酰胆碱酯酶探针包括金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物，金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物通过Au-S键连接，
所述检测纸条设有能够与纸喷雾质谱检测装置配合的尖端；
所述样品输入部件为能够将检测样品输送至反应纸条的装置，所述样品输入部件与反应纸条配合；
所述电压导针为能够将高压直流电源提供的电压提供给检测纸条的导针。
本公开的一体化反应器设置反应纸条和检测纸条，丁酰胆碱酯酶能够将反应纸条中的丁酰胆碱酯酶探针降解形成游离的胆碱，通过反应纸条与检测纸条的配合，将游离的胆碱分离至检测纸条，然后施加高压对检测纸条进行纸喷雾质谱检测，通过检测游离的胆碱的量对丁酰胆碱酯酶进行定量分析。通过金纳米颗粒固定丁酰胆碱，能够保证丁酰胆碱酯酶探针更好的负载在反应纸条上，防止未降解的丁酰胆碱酯酶探针进入检测纸条，实现对丁酰胆碱酯酶精确定量。
另一方面，一种检测丁酰胆碱酯酶的质谱检测方法，提供上述一体化反应器，将反应纸条远离检测纸条，通过样品输入部件将样品输送至反应纸条，反应后，将反应纸条与检测纸条接触，通过样品输入部件向反应纸条注入溶剂，使反应后的游离的胆碱信号分子进入检测纸条，然后将反应纸条远离检测纸条，将电压导针与检测纸条配合，通过纸喷雾质谱检测法检测检测纸条中的胆碱信号分子。
本公开的有益效果为：
1.本公开通过反应纸条中设有丁酰胆碱酯酶探针，能够与丁酰胆碱酯酶实现特异性反应，并通过移动装置和样品输入部件将反应后的胆碱信号分子输送至检测纸条，最终通过纸喷雾质谱法对丁酰胆碱酯酶进行定量检测，该反应器实现了丁酰胆碱酯酶反应、分离和检测的一体化，操作方法简单、便于携带和运输。
2.本公开的反应器对样品的用量要求较低、反应时间短，能够实现即采即测，可最大程度的减少酶活性的损失。
3.本公开提供的检测方法对丁酰胆碱酯酶检测具有高灵敏度、快速稳定、操作简便、高准确度等优点。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例1的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器的结构示意图；
图2为梯子形3D支架结构示意图；
图3为本公开实施例1的检测过程示意图；
图4为本公开实施例1检测丁酰胆碱酯酶的标准曲线；
图5为本公开实施例1检测血清中丁酰胆碱酯酶的表征图；
其中，1、微量注射器(100μL)，2、高压直流电源，3、磁体胶带，4、检测纸条，5、小孔，6、反应单元，7、磁铁，8、温控箱，9、梯子形3D支架，10、水槽&隔离垫，11、加热片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
基于现有技术中没有关于检测丁酰胆碱酯酶一体化的反应器导致的无法实现快速高效的集反应和检测一体化的不足，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器及质谱检测方法。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，包括移动装置、反应纸条、检测纸条、样品输入部件、电压导针；
所述移动装置安装在反应纸条上，所述移动装置为能够使反应纸条接触检测纸条或远离检测纸条的装置；
所述反应纸条负载丁酰胆碱酯酶探针，所述丁酰胆碱酯酶探针包括金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物，金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物通过Au-S键连接，
所述检测纸条设有能够与纸喷雾质谱检测装置配合的尖端；
所述样品输入部件为能够将检测样品输送至反应纸条的装置，所述样品输入部件与反应纸条配合；
所述电压导针为能够将高压直流电源提供的电压提供给检测纸条的导针。
本公开的一体化反应器设置反应纸条和检测纸条，丁酰胆碱酯酶能够将反应纸条中的丁酰胆碱酯酶探针降解形成游离的胆碱，通过反应纸条与检测纸条的配合，将游离的胆碱分离至检测纸条，然后施加高压对检测纸条进行纸喷雾质谱检测，通过检测游离的胆碱的量对丁酰胆碱酯酶进行定量分析。通过金纳米颗粒固定丁酰胆碱，能够保证丁酰胆碱酯酶探针更好的负载在反应纸条上，防止未降解的丁酰胆碱酯酶探针进入检测纸条，实现对丁酰胆碱酯酶精确定量。
样品输入部件为能够将检测样品输送至反应纸条的装置，其方式可以为容器倒入、导管导入、注射器注入等，采用注射器能够更为方便的将样品输送至反应纸条，而且能够将定量输送样品，该实施方式的一种或多种实施例中，样品输入部件为微量注射器。微量注射器为容积不超过100μL的注射器。由于本公开的反应纸条中负载的丁酰胆碱酯酶探针对丁酰胆碱酯酶的灵敏度较高，无需容积更高的注射器，且采用微量注射器能够降低反应器的体积和重量，更加方便携带。
电压导针为能够将高压直流电源提供的电压提供给检测纸条的导针，其目的是导电，仅要求导针的材料为导电材料即可。由于微量注射器采用的针头为金属材质，为了进一步减少反应器的重量，因而该系列实施例中，所述电压导针为微量注射器的针头。针头通过带有金属夹的导线与高压直流电源连接，金属夹夹持在针头上。导线一端连接金属夹，导线另一端连接高压直流电源。
为了能够进行多次检测，该实施方式的一种或多种实施例中，所述反应纸条设有多个反应单元，相邻反应单元之间采用蜡间隔；所述检测纸条设有多个检测单元，反应纸条与检测纸条接触时，每个检测单元均对应一个反应单元，每个检测单元均设有尖端。所述尖端可以为针状结构的针尖端，也可以为片状结构的角尖端(如方形结构的角尖端、三角形结构的角尖端等)，为了降低成本，该系列实施例中，所述尖端为三角形结构的角尖端。
为了更为方便的携带，该实施方式的一种或多种实施例中，包括箱体，所述反应纸条、检测纸条设置在箱体内，箱体开设与样品输入部件、电压导针配合的通孔。
移动装置为能够使反应纸条接触检测纸条或远离检测纸条的装置，可以为滑轮滑轨的滑动配合装置，也可以通过系线实现。为了更为方便控制反应纸条的运动，同时能够方便更换反应纸条，该系列实施例中，所述移动装置包括磁铁和磁性胶带，反应纸条的两端分别粘有一个磁性胶带，磁性胶带与箱体接触，每个磁性胶带与一个磁铁配合。为了更为方便的移动反应纸条，该系列实施例中，所述磁铁设置在箱体外壁。
该实施方式的一种或多种实施例中，包括加热片。能够对反应器内的反应进行加热。
该系列实施例中，包括温度控制器、温度传感器，温度传感器将反应器的温度信号传输至温度控制器，温度控制器根据接受的温度信号控制加热片加热或停止。实现对反应器控温反应。
该实施方式的一种或多种实施例中，包括水槽&隔离垫，所述水槽&隔离垫为在隔离垫的中央设置有封闭的长方形水槽，用于保证反应器内的湿度，同时隔离加热片，避免加热片受到污染。
该实施方式的一种或多种实施例中，包括梯子形的3D支架，所述梯子形的3D支架固定和支撑检测纸条。
本公开的另一种实施方式，提供了一种检测丁酰胆碱酯酶的质谱检测方法，提供上述一体化反应器，将反应纸条远离检测纸条，通过样品输入部件将样品输送至反应纸条，反应后，将反应纸条与检测纸条接触，通过样品输入部件向反应纸条注入溶剂，使反应后的游离的胆碱信号分子进入检测纸条，然后将反应纸条远离检测纸条，将电压导针与检测纸条配合，通过纸喷雾质谱检测法检测检测纸条中的胆碱信号分子。
该实施方式的一种或多种实施例中，反应的温度为36.5～37.5℃。能够保证酶的最佳反应活性，从而获得良好的信号响应和检测结果的重现性。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述溶剂为乙腈水溶液。当乙腈与水的体积比为1：0.9～1.1时，能够更好的将胆碱信号分子洗脱至检测纸条。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，如图1所示，包括带有内部容置空间的便携盒体、外接温控箱8和高压直流电源2。盒体内部由上而下依次是反应纸条6(两端贴有磁铁胶带3)、检测纸条4、梯子形3D支架9、水槽&隔离垫10、加热片11。水槽&隔离垫10其作用是保证盒子内部处于一个湿润的状态，其结构为隔离垫上有一个四周封闭的长方形水槽，可以防止缓冲溶液的四溢，也可以避免缓冲溶液打湿加热片；另外，隔离加热片，也可保证盒子内部加热均匀。
反应纸条6负载丁酰胆碱酯酶探针，丁酰胆碱酯酶探针包括金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物，金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物通过Au-S键连接，反应纸条6有6个正方形的反应单元(5mm×5mm)和7个蜡印的小长方形(5mm×2mm)，两端贴有磁铁胶带3，盒体外壁设有磁铁7用于带动磁铁胶带3移动反应纸条6。检测纸条4构造与反应纸条6类似，只是每个检测单元比反应单元多出了个等腰三角形。检测纸条4固定在梯子形的3D支架9上。梯子形的3D支架的结构如图2所示。
加热片11通过电线和外部的温控箱8连接，可将酶反应器温度稳定在最佳反应温度37℃上，以获得良好的信号响应和检测结果的重现性。
盒体顶面有6个小孔5，微量注射器1(100μL)可穿过小孔5与反应纸条6接触，起到传送样品和喷雾溶剂的作用。在纸喷雾质谱检测的时候，连有高压直流电源2的铜夹可夹住微量注射器1的针头，起到给检测单元加高压直流电的作用。
检测原理是丁酰胆碱酯酶催化水解金纳米负载的底物生成胆碱信号分子，通过反应单元和检测单元的接触冲洗，使胆碱分子冲洗至检测单元，利用注射器的针头给检测单元加上高压直流电，实现信号分子的纸喷雾质谱检测。接触冲洗过程中，部分干扰分子被反应单元拦截，从而提高检测灵敏度。
金纳米探针的制备过程为：制备浓度为4.2×10-10mol/L的金纳米颗粒溶液，浓缩至100μL后形成8.69×10-7mol/L金纳米颗粒溶液，加入1.74×10-8mol式Ⅰ所示化合物，在室温下，搅拌24h，获得金纳米探针溶液。
检测纸条的制备过程为：采用移液器将金纳米探针溶液转移至纸条的检测单元上，干燥后即可获得。
检测过程如图3所示，首先，将6个反应单元上铺上16微升的金纳米探针(浓度为8.69×10-7mol/L，每个金纳米探针上接约200个式Ⅰ所示化合物)，干燥后，通过盒子外壁两侧磁铁的引力将反应纸条悬空于盒子内，不与测试纸条接触。将不同浓度的丁酰胆碱酯酶标准物通过微量注射器滴到反应单元上，在酶反应器反应过程中丁酰胆碱酯酶会将金纳米探针上负载的酯键催化水解生成胆碱信号分子。
移动反应纸条使其与检测纸条接触，通过注射器滴加优化比例的乙腈水溶液(v/v，1:1)，实现胆碱分子从反应单元至检测单元的高效转移。
将反应纸条移走，待检测纸条充分干燥后，将注射器针头与检测单元接触，并将连有高压直流电源的铜夹夹在针头上，实现高压直流电下检测单元的接触式纸喷雾质谱检测，得到图4所示的标准曲线，最低检测限是0.02U/mL，线性范围是0.05U/mL～0.55U/mL。
采集血样(正常人、肝病患者)，将血液在4℃下，以1600×g转速离心10分钟，获得血清。
将血清稀释40倍，用微量注射器吸取4μL后，滴到反应单元上，按照以上同样的步骤检测血清中的丁酰胆碱酯酶。
将获得的信号在标准曲线上找出对应的酶浓度，从而获得不同血清样品中丁酰胆碱酯酶的含量，并与标准的Ellman比色法所得结果作对比，检测结果如图5所示。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，包括移动装置、反应纸条、检测纸条、样品输入部件、电压导针；
所述移动装置安装在反应纸条上，所述移动装置为能够使反应纸条接触检测纸条或远离检测纸条的装置；
所述反应纸条负载丁酰胆碱酯酶探针，所述丁酰胆碱酯酶探针包括金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物，金纳米颗粒和式Ⅰ所示化合物通过Au-S键连接，
所述检测纸条设有能够与纸喷雾质谱检测装置配合的尖端；
所述样品输入部件为能够将检测样品输送至反应纸条的装置，所述样品输入部件与反应纸条配合；
所述电压导针为能够将高压直流电源提供的电压提供给检测纸条的导针。
2.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，样品输入部件为微量注射器；
优选的，所述电压导针为微量注射器的针头。
3.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，所述反应纸条设有多个反应单元，相邻反应单元之间采用蜡间隔；所述检测纸条设有多个检测单元，反应纸条与检测纸条接触时，每个检测单元均对应一个反应单元，每个检测单元均设有尖端；优选的，所述尖端为三角形结构的角尖端。
4.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，包括箱体，所述反应纸条、检测纸条设置在箱体内，箱体开设与样品输入部件、电压导针配合的通孔；
优选的，所述移动装置包括磁铁和磁性胶带，反应纸条的两端分别粘有一个磁性胶带，磁性胶带与箱体接触，每个磁性胶带与一个磁铁配合；进一步优选的，所述磁铁设置在箱体外壁。
5.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，包括加热片；
优选的，包括温度控制器、温度传感器，温度传感器将反应器的温度信号传输至温度控制器，温度控制器根据接受的温度信号控制加热片加热或停止。
6.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，包括水槽&隔离垫，所述水槽&隔离垫为在隔离垫的中央设置有封闭的长方形水槽。
7.如权利要求1所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，其特征是，包括梯子形的3D支架，所述梯子形的3D支架固定和支撑检测纸条。
8.一种检测丁酰胆碱酯酶的质谱检测方法，其特征是，提供权利要求1～7任一所述的检测丁酰胆碱酯酶的一体化反应器，将反应纸条远离检测纸条，通过样品输入部件将样品输送至反应纸条，反应后，将反应纸条与检测纸条接触，通过样品输入部件向反应纸条注入溶剂，使反应后的游离的胆碱信号分子进入检测纸条，然后将反应纸条远离检测纸条，将电压导针与检测纸条配合，通过纸喷雾质谱检测法检测检测纸条中的胆碱信号分子。
9.如权利要求8所述的检测丁酰胆碱酯酶的质谱检测方法，其特征是，反应的温度为36.5～37.5℃。
10.如权利要求8所述的检测丁酰胆碱酯酶的质谱检测方法，其特征是，所述溶剂为乙腈水溶液；优选的，乙腈与水的体积比为1：0.9～1.1时。
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