CN110183511B

CN110183511B - 一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法

Info

Publication number: CN110183511B
Application number: CN201910496925.2A
Authority: CN
Inventors: 邸多隆; 刘建飞
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110183511A

Abstract

本发明公开了一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，该方法是将枸杞子粉碎、过筛、亚临界脱脂、高速剪切低温破壁水提、乙醇沉淀、热水复溶、高速离心、微滤膜纯化、纳滤膜浓缩、三氯乙酸脱蛋白、活性炭脱色、冷冻干燥，得到具有预防和修复抗结核药物诱导的肝损伤功能枸杞糖肽。主要组分分析表明该枸杞糖肽的分子量为10kD~5kD，多糖含量≥85%，糖醛酸含量≥10%。活性实验表明，本发明该枸杞糖肽能够增强肝细胞活力，显著下调异烟肼、利福平导致的谷丙转氨酶活性和谷草转氨酶水平，对抗结核药物利福平、异烟肼引起的肝损伤具有较好的预防和修复作用，可作为有效成分，用于保健食品和药物制剂的制备。

Description

一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法

技术领域

本发明涉及一种枸杞糖肽的制备方法，尤其涉及一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，属于食品、保健食品及药品技术领域。

背景技术

2017年10月30日，在WHO发布的《2017年全球结核病报告》中指出：据估算2016年全球新发结核病患者约1040万例，估算发病率为142/10万。男性 670 万例，女性 370 万例，儿童 104 万例。结核病仍然是全球前10位死因之一，是头号传染病杀手。2016年全球估算结核病死亡约167万，中国是全球30个结核病高负担国家之一，WHO估算2016年中国约有新发结核病患者89.5万，估算发病率为64/10万。包括中国在内的七个国家占到全球总负担的64%，分别是印度、印度尼西亚、中国、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚和南非。目前，我国对肺结核病患者应用一线抗结核药品固定剂量复合制剂（FDC）为主的标准化疗方案，疗程长达6-8个月。结核病需要多种抗结核药品联合使用，不间断用药半年以上，在治疗过程中患者可能出现各种不同程度的药品不良反应(adverse drug reactions，ADRs)，肝毒性是最主要的不良反应，在疗程最初数周内，少数患者可出现血清氨基转移酶升高、肝肿大和黄疸，大多为无症状的血清氨基转移酶一过性升高，在疗程中可自行恢复。不良反应表现为食欲不佳、异常乏力或软弱、恶心或呕吐（肝毒性的前驱症状）及深色尿、眼或皮肤黄染（肝毒性）。异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇均可引起肝脏损害。目前认为，异烟肼的肼类代谢产物为联合化疗时产生肝毒性的主要因素，利福平的肝微粒体酶诱导作用可促使异烟肼的肝毒性，对胆红素代谢产生竞争性抑制。异烟肼、利福平、吡嗪酰胺三药联用的肝毒性更大，可导致药物性肝炎，甚至可出现致命的急性肝坏死和肝功能衰竭。虽然抗结核药物的应用对有效控制结核病发挥了巨大作用，但其治疗作用和不良反应构成了药物作用的两重性，在解除结核病人痛苦，切断结核菌传播的同时又可能产生与用药目的不相符、给患者带来另外的痛苦，甚至危及生命的不良反应，更有许多患者因为抗结核药物所致的肝损伤无法得到有效救治而不得不中断治疗。耐药结核菌是抗结核治疗失败的重要因素，而抗结核药物所致肝损伤是耐药菌株出现的关键原因、也是引起患者死亡的主要原因。目前为了降低耐药菌的发生，多采用两药联用、三药联用，这样做的结果可以显著提高疗效、降低耐药菌株的产生，但同时也大大增加了肝损伤的机率。

目前，解决抗结核药物不良反应的途径主要是合理用药和对抗结核药物不良反应的修复，其中研发对抗结核药物肝损伤具有修复功能的新药研究是此领域重要的需求。尽管目前市场上有许多保肝药包括水飞蓟素、双环醇、甘草酸相关制剂等用于抗结核药物性肝损伤的报道，但由于种种原因，该问题至今没有得到有效解决。目前临床上对药物性肝损害的治疗关键依然是停用并防止重新给予引起肝损害的药物。因此，医药市场急需能对抗结核组合药引起药物性肝损害产生有效防治作用的药物上市，这也引起了国家相关部门的高度重视。因此，为有效抑制结核的发展，临床上急需一个能有效防止抗结核药物性肝损伤的新药上市，将结核消灭在初治期。

宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科多年生落叶灌木，其干燥成熟果实枸杞子自古以来就被视为保肝的名贵中药材，同时又是国家卫生部公布的药食同源品种之一，在我国已有2000多年的药用历史。现代科学研究表明，枸杞中发挥肝损伤修复作用的主要有效成分是枸杞糖肽。CN108524668A报道了从枸杞中分离得到的对药物性肝损伤具有修复和治疗作用的枸杞提取物，其主要由75kD~3.5kD分子量的枸杞多糖和甜菜碱组成，动物实验表明该提取物对利福平肝损伤以及异烟肼引起的肝损伤具有较好的保护作用，具有作为功能食品或保健食品原料的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，为抗结核药物诱导的肝损伤的治疗提供新的途径。

一、枸杞糖肽制备

本发明枸杞糖肽制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）将枸杞子清洗、干燥、置于粉碎机中粉碎，过40~60目筛，冲入氮气冷藏保存；

（2）将粉碎过筛的枸杞粉置于提取袋中，以丙烷、丁烷、二甲醚等有机溶剂为萃取介质进行亚临界超声提取：枸杞粉和萃取剂的固液比为：1~3 kg/L，萃取压力为0.1~1MPa，超声频率为10~30KHz，萃取时间为10~60min，萃取次数为1~5次；萃取结束后分离，得到枸杞渣。亚临界超声提取不仅可以得到活性组分枸杞果油，延长枸杞的产业链，并且起到脱脂和除色素的作用，可以间接提高枸杞糖肽的纯度；

（3）将上述枸杞渣按照1:8~1:12的料液质量比加入去离子水中，在高速剪切和搅拌下进行提取，得枸杞糖肽提取混合物。剪切转速为6000~12000转/分钟，提取温度50~60℃，提取时间为0.5~2 h；高速剪切提取能够将枸杞提取液与刀模产生剧烈振动摩擦，从而达到剪切的效果。枸杞提取液物料被转子中心吸入，在高速转子转动所产生的离心力作用下由中心向四周迅速扩散。在扩散的过程中，枸杞物料首先受到叶片的搅拌，并在叶片和定子的间隙中收到剪切，而后进入内圈齿轮的狭小空间，在机械力和流体力联合效应的作用下，产生强大的剪切、摩擦、撞击以及物料间的相互碰撞和摩擦作用下使得物料充分破碎分裂。同时，此方法使得枸杞样品受到气蚀、机械效应和剪切效应，在这3种作用力的协同作用下对枸杞样品的处理效果更充分更高效快捷，提高枸杞糖肽的提取率，缩短提取时间，提高提取效率；

（4）将上述枸杞糖肽提取混合物离心，得枸杞糖肽提取液A；离心转速为8000~16000转/分钟；

（5）将枸杞糖肽提取液A减压浓缩至其体积的1/2~1/5，加入乙醇，使乙醇的最终浓度为50%~70%；静置，过滤，得枸杞糖肽沉淀；再将枸杞糖肽沉淀加入热水搅拌复溶，离心弃去不溶物，得枸杞糖肽溶液B；

（6）将上述枸杞糖肽溶液B泵入混合串联微滤膜包系统，收集分子量在10kD~5kD之间的截留液，得枸杞糖肽溶液C；

所述的混合串联微滤膜包系统由至少2台10kD分子量的微滤膜和2台5kD分子量的微滤膜组成，其中10kD分子量的微滤膜和5kD分子量的微滤膜之间串联，2台10kD分子量的微滤膜和2台5kD分子量的微滤膜之间即可串联也可并联；

（7）在上述所得枸杞糖肽溶液C中加入三氯乙酸，使其三氯乙酸在枸杞糖肽溶液C中最终的浓度在5%~10%；冰水浴下搅拌2~3 h，离心得上清液，然后加入0.1mol/L~1mol/L的NaOH调至中性，透析4~6 h，得枸杞糖肽溶液D；

（8）在枸杞糖肽溶液D加入颗粒状活性炭，搅拌吸附1~3 h，滤除活性炭，得枸杞糖肽溶液E；枸杞糖肽溶液E经冷冻干燥，得到白色絮状的枸杞糖肽。

本发明制备的枸杞糖肽成淡黄色或类白色的絮状固体，分子量为10kD~5kD，蛋白质含量≥8%。

枸杞糖肽的多糖含量≥90%。检测方法胺照枸杞子国家标准GB/T 18672-2014中“枸杞多糖”含量测定方法进行。

枸杞糖肽的糖醛酸含量≥10%。具体检测方法如下：采用硫酸咔唑法进行测定。半乳糖醛酸的标准曲线绘制：精密称取干燥的半乳糖醛酸标准品25 mg，于500 mL容量瓶中蒸馏水定容。用移液管精确移取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL于具塞试管中，加蒸馏水至1mL，置于冰水浴中，加入浓硫酸6 mL，振摇使混合均匀后，85℃水浴20 min，冷却至室温，分别加0.2 mL 0.1%咔唑乙醇液，在室温下放置2 h后，于530 nm处测定各吸光度A530，以标准溶液中的糖醛酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；不同醇沉组分的糖醛酸含量测定：分别取不同醇沉组分的样液0.5 mL于具塞试管中定容至1mL，按照以上方法进行测定，并由标准曲线方程计算得出各样品的糖醛酸含量。

二、枸杞糖肽活性试验

下面以本发明实施例1、2制备的产物LBP-1和LBP-2为例，对本发明制备的枸杞糖肽活性进行分析说明。

1、LBP-1和LBP-2的细胞活力：见表1

如表1所示，本发明所示的方法制备的枸杞糖肽LBP-1和LPB-2对异烟肼和利福平所致L-02肝细胞损伤细胞存活率具有良好的改善作用。50μg/mL、100μg/mL的LBP-1和LPB-2均可以显著提升异烟肼诱导的L-02肝细胞损伤的细胞存活率，50μg/mL、100μg/mL的LBP-1和25μg/mL、 50μg/mL、100μg/mL的LBP-2均可以显著增加利福平诱导的L-02肝细胞损伤的细胞存活率，这可能与LBP-2的多糖含量、糖醛酸含量均比LPB-1略高有关系。

2、对异烟肼、利福平导致的肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶活性和谷草转氨酶：见表2

如表2所示，本发明制备的枸杞糖肽LBP-1和LPB-2对异烟肼诱导的L-02细胞损伤转氨酶水平具有良好的下调作用。不同浓度的LBP-1和LPB-2(25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)均可明显下调异烟肼诱导的L-02细胞的AST水平，不同浓度的LBP-2(25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)和100μg/mL的LBP-1也可以显著下调异烟肼诱导的L-0细胞的ALT水平。

3、对利福平所致L-02细胞损伤转氨酶水平的影响：见表3

如表3所示，本发明所示的方法制备的枸杞糖肽不同浓度的LBP-1和LPB-2(25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)均对利福平诱导的L-02细胞损伤转氨酶水平具有良好的下调作用。

综上所述，本发明制备的高纯度枸杞糖肽对异烟肼和利福平所致L-02肝细胞损伤细胞存活率具有良好的改善作用。能够明显下调异烟肼和利福平诱导的L-02细胞损伤转氨酶水平。对两种抗结核药-异烟肼和利福平，尤其是利福平导致的肝损伤具有良好的修复和预防作用。

本发明相对现有技术具有以下有益效果：

1、本发明利用乙醇沉淀和膜过滤分子量截留偶联技术，使其枸杞糖肽的纯度进一步提高，品质稳定；

2、本发明利用活性追踪的方式，进一步确定了枸杞糖肽防治抗结核药物诱导的肝损伤的有效组分，精准锁定了其活性物质。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明对枸杞子提取物的制备方法、有效成分及对药物性肝损伤具有修复和治疗作用做进一步说明。

实施例1

（2）取5kg上述粉碎过筛的枸杞原料置于提取袋中，置入亚临界超声萃取设备的密闭萃取罐中，关闭进料通道，抽真空至-0.075MPa，打开丁烷储存罐，按照料液比1:1.5kg/L通入0.75L的丁烷，加热至35℃，设置萃取压力0.5MPa，萃取时间15min，超声频率为15KHz，萃取3次；萃取结束后，将萃取溶剂抽出至分离罐中。开启真空泵，将分离罐的压力降至-0.06MPa，温度保持在35℃，蒸发物料中的丁烷，并将气化的丁烷经隔膜压缩机压缩成液态，回流至溶剂罐中，关闭真空泵，使分离罐的压力达到0MPa，排出枸杞果油，将枸杞渣从提取罐中取出；

（3）取上述亚临界萃取后的枸杞渣100g，置于多功能提取罐，加入1.2L去离子水，待将水浴温度设置为60℃，开启高速剪切系统，设置转速为10000 转/分钟，提取0.5 h，10000转/分钟离心10分钟，合并上清液并抽滤，得1.0L枸杞糖肽提取液A；

（4）取上述1.0L枸杞糖肽提取液A用旋转蒸发仪减压浓缩至250mL，加入95%乙醇430mL，静置过夜，离心除去上清液，沉淀加入60℃蒸馏水250mL，超声助溶，10000转/分钟离心10分钟，合并上清液并抽滤，得250mL枸杞糖肽溶液B；

（5）取上述250mL枸杞糖肽溶液B泵入混合串联微滤膜包系统（2台10kD分别和2台5kD微滤膜串联，2台10kD微滤膜并联），收集10kD~5kD之间的枸杞糖肽溶液C；

（6）去上述所得80mL枸杞糖肽溶液C，加入5mL三氯乙酸，水浴下剧烈搅拌3 h，10000转/分钟离心得上清液，加入0.5mol/L的氢氧化钠调至中性，1kD透析6 h，得枸杞糖肽溶液D；

（7）将枸杞糖肽溶液D加入15g颗粒状活性炭，搅拌1 h，超滤滤除活性炭，得枸杞糖肽溶液E，枸杞糖肽溶液E经冷冻干燥，得到白色絮状的枸杞糖肽，记为产品LBP-1。

实施例2

（3）取上述亚临界萃取后的枸杞渣25kg置于多功能提取罐中，加入300L纯水，设置温度为60℃，开启电加热，设置高速剪切机转速为5000转/分钟并开启。待料液温度为60℃时开始计时，1 h后停止加热和剪切。向提取罐蒸汽夹层通入水，加速冷却。待冷却至室温后泵入三足式离心机，滤布目数为300目，将滤液进一步泵入16000转/分钟的管式离心机，收集得250L的枸杞糖肽提取液A；

（4）将上述250L枸杞糖肽提取液A用双效减压蒸馏系统浓缩至50L，泵入500L醇沉罐，搅拌下缓慢加入95%乙醇85L，静置过夜，从醇沉罐的上出口除去上清液，沉淀加入60℃蒸馏水50L，搅拌助溶，泵入16000转/分钟管式离心机离心，得50L枸杞糖肽溶液B；

（5）将上述枸50L杞糖肽溶液B泵入膜过滤系统（2只10kD的超滤膜并联，2只5kD微滤膜并联），设置温度为30±5℃，收集10kD~5kD之间的枸杞糖肽溶液C；

（6）在上述所得的16L枸杞糖肽溶液C中加入800mL三氯乙酸，机械搅拌3 h，16000转/分钟管式离心机离心得上清液，加入0.5mol/L的氢氧化钠调至中性，1kD透析6 h，得枸杞糖肽溶液D；

（7）将枸杞糖肽溶液D加入3kg颗粒状活性炭，搅拌1 h，超滤滤除活性炭，得到枸杞糖肽溶液E；枸杞糖肽溶液E经冷冻干燥，得到白色絮状的枸杞糖肽，即为产品LBP-2。

LBP-1和LBP-2的性能测试

1、LBP-1和LBP-2的理化参数：见表4

如表1所示：本发明所述的方法制备的枸杞糖肽的纯度高，多糖含量＞90.0%，糖醛酸含量＞10.0%，色泽均一，水溶性好。

Claims

1.一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，包括以下工艺步骤：

（2）将粉碎过筛的枸杞粉置于提取袋中，以丙烷、丁烷或二甲醚为萃取介质，进行亚临界超声提取；萃取结束后分离，得到枸杞渣；

（3）将上述枸杞渣按照1:8~1:12的料液质量比加入去离子水中，在高速剪切和搅拌下进行提取，得枸杞糖肽提取混合物；

（4）将上述枸杞糖肽提取混合物离心，得枸杞糖肽提取液A；

（6）将上述枸杞糖肽溶液B泵入混合串联微滤膜包系统，收集截留液，得枸杞糖肽溶液C；所述的混合串联微滤膜包系统由至少2台10kD分子量的微滤膜和2台5kD分子量的微滤膜组成，其中10kD分子量的微滤膜和5kD分子量的微滤膜之间串联，2台10kD分子量的微滤膜和2台5kD分子量的微滤膜之间串联或并联；

（7）在上述所得枸杞糖肽溶液C中加入三氯乙酸，使三氯乙酸在枸杞糖肽溶液C中的最终浓度在5%~10%；冰水浴下搅拌2~3h，离心得上清液，然后加入0.1mol/L~1mol/L的NaOH调至中性，透析4~6 h，得枸杞糖肽溶液D；

（8）在枸杞糖肽溶液D加入颗粒状活性炭，搅拌吸附1~3h，滤除活性炭，得枸杞糖肽溶液E；枸杞糖肽溶液E经冷冻干燥，得到白色絮状的枸杞糖肽。

2.如权利要求1所述一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，其特征在于：步骤（2）亚临界超声提取条件：枸杞粉和萃取剂的固液比为：1~3kg/L，萃取压力为0.1~1MPa，超声频率为10~30KHz，萃取时间为10~60min，萃取次数为1~5次。

3.如权利要求1所述一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，其特征在于：步骤（3）高速剪切破壁提取条件：剪切转速为6000~12000转/分钟，提取温度50~60℃，提取时间为0.5~2 h。

4.如权利要求1所述一种对抗结核药物诱导的肝损伤具有修复和预防作用的枸杞糖肽制备方法，其特征在于：步骤（4）中，离心转速为8000~16000转/分钟。