CN110167960B - 针对金黄色葡萄球菌溶血素a毒素的人类抗体 - Google Patents

针对金黄色葡萄球菌溶血素a毒素的人类抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN110167960B
CN110167960B CN201880005378.7A CN201880005378A CN110167960B CN 110167960 B CN110167960 B CN 110167960B CN 201880005378 A CN201880005378 A CN 201880005378A CN 110167960 B CN110167960 B CN 110167960B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
hemolysin
antigen
antibodies
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880005378.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110167960A (zh
Inventor
A·科皮
P·马松
W·奥尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN110167960A publication Critical patent/CN110167960A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110167960B publication Critical patent/CN110167960B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供结合于金黄色葡萄球菌(S.AUREUS)溶血素A毒素的抗体和使用方法。根据本发明的某些实施例，所述抗体是结合于溶血素A的完全人类抗体。本发明的抗体适用于抑制或中和溶血素A活性，因此提供预防或治疗如金黄色葡萄球菌感染等溶血素A相关疾病或病症的手段。在一些实施例中，本发明的抗体用于治疗金黄色葡萄球菌感染的至少一种症状或并发症。

Description

针对金黄色葡萄球菌溶血素A毒素的人类抗体
技术领域
本发明涉及特异性结合于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)溶血素A毒素的人类抗体和其抗原结合片段，和使用这类抗体和片段的治疗和诊断方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种格兰氏阳性(Gram-positive)、兼性需氧菌，其常常移生于健康个体的皮肤和鼻部。所述细菌被视为机会性病原体且可在许多身体部位引起多种疾病/病状。其在世界范围内是血流、皮肤和软组织和呼吸道感染的主要原因。由金黄色葡萄球菌引起的健康照护和小区相关感染的频率已增加，且为了对抗这些感染作出的努力因出现耐药菌株，具体地说，耐甲氧西林性(methicillin-resistant)或MRSA菌株而受到妨碍。
金黄色葡萄球菌表达许多帮助细菌入侵和散布于宿主中的毒力因子(细胞表面表达和分泌)。在分泌的毒力因子中许多是毒素，其中最突出的是成孔毒素溶血素A。金黄色葡萄球菌溶血素A是一种33kDa分泌单体，其在宿主细胞的膜中寡聚化成七聚结构以形成孔隙，从而导致细胞溶解、上皮障壁破坏、炎症和组织损伤(Berube等人，(2013)，《毒素(Toxins)》5：1140-1166)。
多种哺乳动物细胞类型被溶血素A溶解，包括血小板、单核细胞、内皮和上皮细胞。已提出这些细胞类型中的一种或多种是溶血素A而不是红血球(RBC)的生理相关目标，因为人类RBC仅在暴露于高浓度的溶血素A时易于溶解(Hildebrand等人，(1991)，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》266：17195-17200；Wilke等人，(2010)，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U S A)》107：13473-13478；Berube等人，(2013)，《毒素》5：1140-1166)。
已证实在金黄色葡萄球菌感染的动物模型中，溶血素A在肺炎、皮肤坏死(dermonecrosis)、心内膜炎和败血病中起作用(Tkaczyk等人，(2012)，《临床疫苗免疫(Clin.Vaccine Immunol.)》19：377-385和Kennedy等人，(2010)，《传染病杂志(J.Infect.Dis.)》202：1050-1058)。金黄色葡萄球菌是皮肤和软组织感染的主要原因(Moran，等人(2006)，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》355：666-674))，常常引起蜂窝组织炎和皮肤脓肿。在小鼠模型中，使用非产毒形式的溶血素A的主动免疫或使用溶血素A-特异性抗血清或单克隆抗体(mAb)的被动免疫使皮肤病变的尺寸显著减小，且预防由产生溶血素A的金黄色葡萄球菌菌株引起的皮肤坏死(Kennedy等人，(2010)，《传染病杂志》202：1050-1058；Tkaczyk等人，(2012)，《临床疫苗免疫》19：377-385)。金黄色葡萄球菌也是就医患者的肺炎的主要原因(Kollef等人，(2005)，《胸腔(Chest)》128：3854-3862(Erratum inChest 129：831)；Shorr等人，(2006)，《关键护理(Crit.Care)》10：R97)，且已显示在肺脏感染的小鼠模型中起作用(Bubeck Wardenberg等人，(2007)，《感染免疫(Infect.Immun.)》75∶1040-1044)。使用非产毒形式的溶血素A的主动免疫或使用溶血素A-特异性抗血清或mAb的被动免疫使肺炎小鼠模型中的发病率和死亡率显著降低(Bubeck Wardenburg和Schneewind，(2008)，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》205：287-294；Hua等人，(2014)，《抗微生物药物化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)》58：1108-1117)。
金黄色葡萄球菌是医院和小区中的感染的主要原因。金黄色葡萄球菌的更难以用标准类型的抗生素处理的耐抗生素性菌株(如耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA))的出现是当前临床医学中的问题，且需要研发新的方法来进行抗细菌预防和治疗(Kennedy等人，(2010)，《传染病杂志》202：1050-1058)。
发明内容
本发明提供特异性结合于金黄色葡萄球菌溶血素A的完全人类单克隆抗体(mAb)和其抗原结合片段。这类抗体可以适用于中和溶血素A的活性。所述抗体可以起到预防金黄色葡萄球菌感染、使其进展停止或减轻其严重程度；或减少感染复发的次数、持续时间或降低其严重程度；或改善至少一种与感染相关的症状的作用。在一些情况下，所述抗体可以用于预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的病状或适应症，如皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。这类抗体可以单独或结合适合用于治疗金黄色葡萄球菌感染的第二药剂使用。在某些实施例中，对溶血素A具有特异性的抗体可以结合第二药剂治疗性地给予，以减轻金黄色葡萄球菌感染的严重程度，或减少感染复发的次数、持续时间或降低其严重程度，或改善至少一种与金黄色葡萄球菌感染相关的症状。在一些情况下，组合疗法可以用于治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的病状或适应症，如皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。在某些实施例中，所述抗体可以预防性地用作独立疗法来防止患者处于发展金黄色葡萄球菌感染的危险之中。举例来说，某些患者群体可能处于发展金黄色葡萄球菌感染的危险之中，包括年长患者、免疫系统变弱的患者或处于更大的医院感染风险之中的患者，如手术后患者。当本发明的抗体单独或结合第二药剂给予时，这些患者群体中的任一种可以受益于使用本发明的抗体的治疗。
本发明的抗体可以用于治疗患者的金黄色葡萄球菌感染。所述抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab′)2或scFv片段)，且可以经修饰以影响功能，例如清除残余效应子功能(Reddy等人，(2000)，《免疫学杂志(J.Immunol.)》164：1925-1933)或增加mAb半衰期(Zalevsky等人，(2010)，《自然生物科技(Nature Biotechnology)》28：157-159)。本发明包括任何抗体或其抗原结合片段，其包含本文规定的键联到重链恒定区(例如人类恒定区)的VH区中的任一个，如γ(例如γ-1、γ-2、γ-3或γ-4)、δ、α、μ或ε；和/或本文规定的键联到轻链恒定区(例如人类恒定区)的任何VL区，如λ或κ。
因此，在第一方面中，本发明提供一种特异性结合于溶血素A的经分离的完全人类单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，人类单克隆抗体结合于野生型溶血素A(SEQ ID NO：291)或经修饰的溶血素A(SEQ ID NO：295)。
在一个实施例中，经分离的人类抗体或其抗原结合片段如通过表面等离子共振所测量以等于或小于10-7M的KD结合于溶血素A。
在一些实施例中，经分离的抗体或其抗原结合片段展现一种或多种选自由以下组成的组的特性：(a)如通过表面等离子共振所测量，在37℃下以小于约80nM的结合解离平衡常数(KD)结合于野生型溶血素A；(b)如通过表面等离子共振所测量，在37℃下以大于约0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合于野生型溶血素A；(c)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于约30nM的KD结合于野生型溶血素A；(d)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以大于约1.5分钟的t1/2结合于野生型溶血素A；(e)如通过表面等离子共振所测量，在37℃下以小于约20nM的结合解离平衡常数(KD)结合于经修饰的溶血素A；(f)如通过表面等离子共振所测量，在37℃下以大于约0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合于经修饰的溶血素A；(g)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于约10nM的KD结合于经修饰的溶血素A；和(h)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以大于约1.5分钟的t1/2结合于经修饰的溶血素A。
在一些情况下，结合于溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区(HCVR)序列中的任一个内所含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链可变区序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282；和/或如下轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内所含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链可变区序列选自由以下组成的组：SEQID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270。用于识别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是所属领域中众所周知的且可以用于识别本文所公开的规定的重链可变区(HCVR)和/或轻链可变区(LCVR)氨基酸序列内的CDR。可以用于识别CDR边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般地说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区的位置，而AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中方法。参见例如Kabat，《免疫相关蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani等人，(1997)，《分子生物学(J.Mol.Biol.)》273：927-948；和Martin等人，(1989)，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》USA 86：9268-9272。公共数据库也可以用于识别抗体内的CDR序列。
在一些实施例中，结合于溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段包含HCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282。
在一些实施例中，结合于溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段包含LCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270。
在一些情况下，结合于溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段包含(a)HCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282；和(b)LCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270。
在一个实施例中，结合于溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264和284；
(b)HCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266和286；
(c)HCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268和288；
(d)LCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252和272；
(e)LCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254和274；和
(f)LCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256和276。
在各个实施例中，本发明提供一种结合于溶血素A的完全人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段展现以下特征中的一种或多种：(i)包含HCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(ii)包含LCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268和288、536、552、568和584，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和LCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256和276，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(iv)包含HCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264和284，或其具有至少90％，至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；HCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266和286，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；LCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252和272，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和LCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254和274，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和/或(v)如通过表面等离子共振所测量以等于或小于10-7M的KD结合于溶血素A。
在另一方面中，本发明提供一种与参考抗体或抗原结合片段竞争结合于溶血素A的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，所述重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282；和轻链可变区(LCVR)的CDR，所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270。
在另一方面中，本发明提供一种与参考抗体或抗原结合片段结合溶血素A上相同的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)的CDR，所述重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282；和轻链可变区(LCVR)的CDR，所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270。
在一些实施例中，本发明提供一种结合溶血素A的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列配对：SEQ ID NO：2/10、22/30、42/50、62/70、82/90、102/110、122/130、142/150、162/170、182/190、202/210、222/230、242/250、262/270和282/270。
在另一方面中，本发明提供编码抗溶血素A抗体或其片段的核酸分子。如同通过在容许产生抗体的条件下培养宿主细胞且回收所产生的抗体来制备抗体的方法一般，带有本发明的核酸的重组表达载体和这类载体已引入其中的宿主细胞也由本发明涵盖。
在一些实施例中，本发明提供一种抗体或其片段，其包含由选自由以下组成的组的核酸序列编码的HCVR：SEQ ID NO：1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241、261和281，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本上一致的序列。
在一些实施例中，抗体或其片段进一步包含由选自由以下组成的组的核酸序列编码的LCVR：SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249和269，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本上一致的序列。
在一些情况下，本发明提供一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的HCDR3结构域：SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267和287，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的LCDR3结构域：SEQ ID NO：15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255和275，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。
在一些实施例中，本发明提供一种抗体或其片段，其进一步包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的HCDR1结构域：SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263和283、563和579，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的HCDR2结构域：SEQ ID NO：5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265和285，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的LCDR1结构域：SEQ ID NO：11、31、51、71、91、111、131、151、171、191、211、231、251和271，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的LCDR2结构域：SEQ ID NO：13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253和273，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列。
在一些实施例中，如本文所描述结合于溶血素A的抗体或其抗原结合片段可键联到可检测标记，如放射性核素标记或MRI-可检测标记。
在另一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包含如上文或本文所描述结合于溶血素A的经分离的完全人类单克隆抗体或其抗原结合片段，和医药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些实施例中，医药组合物包含具有上文或本文所描述的特征中的任何一种或多种的结合于溶血素A的完全人类单克隆抗体。在一个实施例中，抗体以等于或小于10-7M的KD结合于溶血素A。在各个实施例中，组合物包含结合于溶血素A且具有选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列配对的抗体：SEQ ID NO：2/10、22/30、42/50、62/70、82/90、102/110、122/130、142/150、162/170、182/190、202/210、222/230、242/250、262/270和282/270。本发明还提供一种经分离的人类抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(i)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；(ii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列；(iii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQID NO：58中所示的氨基酸序列；(iv)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：80中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列；(v)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：100中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列；(vi)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：120中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列；(vii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：140中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：138中所示的氨基酸序列；(viii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：160中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列；(ix)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：180中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：178中所示的氨基酸序列；(x)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：200中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：198中所示的氨基酸序列；(xi)轻链免疫球蛋白，其包含SEQID NO：220中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：218中所示的氨基酸序列；(xii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：240中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：238中所示的氨基酸序列；(xiii)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ IDNO：260中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：258中所示的氨基酸序列；(xiv)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：280中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：278中所示的氨基酸序列；或(xv)轻链免疫球蛋白，其包含SEQ IDNO：280中所示的氨基酸序列，和重链免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO：290中所示的氨基酸序列。
在一些情况下，本发明以一种组合物为特征，所述组合物是本发明的抗体或抗体的抗原结合片段与第二治疗剂的组合。第二治疗剂可以是小分子药物、蛋白质/多肽、抗体、核酸分子(如反义寡核苷酸)或siRNA。第二治疗剂可以是合成的或天然衍生的。第二治疗剂可以是有利地与本发明的抗体或其片段组合的任何药剂。
在某些实施例中，第二治疗剂可以是帮助抵消或降低与本发明的抗体或抗体的抗原结合片段相关的任何可能的副作用(如果这类副作用会发生)的药剂。
还应了解，本发明的抗体和医药学上可接受的组合物可以用于组合疗法中，即抗体和医药学上可接受的组合物可以与一种或多种其它所需治疗剂或医学程序同时、在其之前或在其之后给予。用于组合方案中的具体疗法(治疗剂或程序)组合将考虑所需治疗剂和/或程序与所要实现的所需治疗作用的兼容性。还应了解，所采用的疗法可以针对相同病症实现所要作用(例如抗体可以与用以治疗相同病症的另一药剂同时给予)，或其可以实现不同作用(例如控制任何有害作用)。如本文所用，通常为了治疗或预防具体疾病或病状而给予的额外治疗剂适合于正在治疗的疾病或病状。如相关领域中认可的，当共同给予多种治疗剂时，可相应地调整剂量。
在另一方面中，本发明提供一种预防、治疗或管理由金黄色葡萄球菌引起的原发性感染，和降低、清除或预防金黄色葡萄球菌感染复发的方法。在一些情况下，本发明包括一种预防和/或治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症是如皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。在某些实施例中，本发明提供一种治疗罹患金黄色葡萄球菌感染的患者，或治疗至少一种与金黄色葡萄球菌感染相关的症状或并发症，或使金黄色葡萄球菌感染的进展停止的方法，所述方法包括向患者给予有效量的结合于溶血素A的抗体或其抗原结合片段；或包含有效量的结合于溶血素A的抗体或其抗原结合片段的医药组合物，使得金黄色葡萄球菌感染相关病状或疾病得到预防，或严重程度减轻和/或持续时间减少，或至少一种与病状或疾病相关的症状或并发症得到预防或改善，或金黄色葡萄球菌感染的频率降低和/或持续时间减少或严重程度降低。在上文所讨论的方法的各个实施例中，金黄色葡萄球菌细菌可能对一种或多种类型的抗生素治疗具有抗性。在一个实施例中，细菌是耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在所述方法的一些实施例中，与第二治疗剂组合向患者给予包含本发明的抗体的医药组合物。
在本发明的实施例中，抗体或其抗原结合片段或包含抗体的医药组合物是经皮下、经静脉内、经皮内、经口或经肌肉内给予。
在相关实施例中，本发明包括本发明的经分离的抗溶血素A抗体或抗体的抗原结合部分的用途，其用于制造用以预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染或存在溶血素A毒素有关或由其引起的疾病或病症的药剂。本发明还包括经分离的抗溶血素A抗体或其抗原结合部分用于预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染或存在溶血素A毒素有关或由其引起的疾病或病症的用途。在各个实施例中，这些疾病或病症包括皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。在一个实施例中，本发明包括经分离的抗溶血素A抗体或其抗原结合片段在用于治疗金黄色葡萄球菌感染的药剂的制造中的用途。在一些情况下，本发明包括如上文或本文所讨论的抗溶血素A抗体或其抗原结合片段用于治疗罹患金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染风险中的患者的用途。在一些实施例中，本发明包括如上文或本文所讨论的抗溶血素A抗体或其抗原结合片段用于治疗罹患皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)的患者的用途。
由随后的详细描述的综述来看其它实施例将变得显而易见。
附图说明
图1显示抗溶血素A抗体与金黄色葡萄球菌溶血素A的结合。
图2a、2b和2c显示抗溶血素A抗体与金黄色葡萄球菌双组分毒素的F亚单位的结合：图2a显示与LukF的结合；图2b显示与LukD的结合；而图2c显示与HlgB的结合。
图3a、3b和3c显示抗溶血素A抗体H1H15381P与金黄色葡萄球菌双组分毒素的组分的结合：图3a显示与LukF、LukS和LukE的结合；图3b显示与HlgA和HlgC的结合；而图3c显示与δ毒素的结合。
图4a和4b：图4a显示抗溶血素A抗体H1H15377P、H1H15381P或H1H15399P阻断毒素诱导的ADAM10活性，而图4b显示抗溶血素A抗体H1H15377或H1H15399防止溶血素A结合于兔红血球膜。
图5a、5b和5c显示在感染金黄色葡萄球菌CA-127且以5、0.5或0.125mg/kg用各种抗体(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或对照抗体)治疗的小鼠中皮肤坏死病变的尺寸。
图6a、6b和6c显示在感染金黄色葡萄球菌Newman且以5、0.5或0.125mg/kg用各种抗体(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或对照抗体)治疗的小鼠中皮肤坏死病变的尺寸。
图7a和7b显示给予各种抗溶血素A mAb(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或对照抗体)的小鼠的皮肤中的金黄色葡萄球菌CA-127(MRSA)或金黄色葡萄球菌Newman(MSSA)细菌计数。
图8a和8b显示以1.25或0.325mg/kg用各种抗体(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或对照抗体)治疗的感染金黄色葡萄球菌CA-127的小鼠的肺脏中的细菌负荷。
具体实施方式
在描述本发明方法之前，应了解本发明不限于具体方法和所描述的实验条件，因而方法和条件可变化。还应了解，本文中所用的术语是仅用于描述具体实施例的目的，且不旨在具有限制性，因为本发明的范围将仅由随附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。虽然类似或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料均可以用于实践或测试本发明，但现描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物以全文引用的方式并入本文中。
定义
术语“溶血素A”和“溶血素A毒素”可互换地指由金黄色葡萄球菌分泌的33kDa单聚蛋白质，其在宿主细胞膜中寡聚化成七聚结构以形成孔隙，从而导致细胞溶解、炎症和组织损伤。野生型溶血素A的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：291中。经修饰的溶血素A(H35L突变体)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：295中。除非另外指出，否则提及溶血素A是指野生型形式。Hla-H35L是位置35的组氨酸已变成白氨酸的溶血素A。这允许毒素在宿主细胞膜上组装直到前孔形成步骤，但未形成完全功能孔隙。这使得溶血素A是非产毒的。
如本文所用，术语“抗体”意在指包含四个多肽链(通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链)的免疫球蛋白分子(即，“完全抗体分子”)，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。各重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。各轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变异性区域，其间散布有称为构架区(FR)的较保守的区域。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人类生殖系序列相同，或可以经天然或人造修饰。氨基酸共同序列可以基于两个或更多个CDR的并行分析来定义。
一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的省略也是可能的。科学文献中已描述关于结合可以省掉一或两个CDR的抗体。Padlan等人(《美国实验生物学会联合会会志(FASEB J.)》1995，9：133-139)基于所公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，且得出以下结论：仅约五分之一到三分之一的CDR残基实际上接触抗原。Padlan还发现一或两个CDR中没有氨基酸与抗原接触的许多抗体(还参见Vajdos等人2002《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》320：415-428)。
不接触抗原的CDR残基可基于先前研究(例如CDRH2中的残基H60-H65常常是不需要的)通过分子模型化和/或根据经验由位于Chothia CDR外部的Kabat CDR的区域来识别。如果省去CDR或其残基，那么其通常用另一人类抗体序列或这类序列的共同序列中占据对应位置的氨基酸取代。CDR内用于取代的位置和用于取代的氨基酸也可以根据经验来选择。经验取代可以是保守或非保守取代。
本文所公开的完全人类抗溶血素A单克隆抗体可以与对应生殖系序列相比在重链和轻链可变域的构架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。可以通过将本文所公开的氨基酸序列与可以获自例如公共抗体序列数据库的生殖系序列相比较来轻易地确定这类突变。本发明包括衍生自本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个构架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变是衍生出所述抗体的生殖系序列的对应残基，或另一人类生殖系序列的对应残基，或对应生殖系残基的保守氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。所属领域的一般技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列是起始物质，可容易地制备许多包含一个或多个个别生殖系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基均突变回在衍生出所述抗体的原始生殖系序列中发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基突变回原始生殖系序列，例如仅在FR1的头8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其它实施例中，构架和/或CDR残基中的一种或多种突变是不同生殖系序列(即，不同于最初衍生出所述抗体的生殖系序列的生殖系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可以含有构架和/或CDR区内的两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变是具体生殖系序列的对应残基，而不同于原始生殖系序列的某些其它残基保留或突变是不同生殖系序列的对应残基。一旦获得含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段，即可容易地测试其一种或多种所需特性，如改良的结合特异性、增加的结合亲和力、改良或增强的拮抗或促效生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖于本发明内。
本发明还包括完全人类抗溶血素A单克隆抗体，其包含本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的具有一个或多个保守取代的变异体。举例来说，本发明包括具有相对于本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个含有例如10个或更少个、8个或更少个、6个或更少个、4个或更少个等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗溶血素A抗体。
如本文所用，术语“人类抗体”意在包括具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人类mAb可例如在CDR和具体地说，CDR3中包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在活体外通过随机或定位诱变或在活体内通过体细胞突变所引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人类抗体”，不意在包括衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列已接枝到人类FR序列上的mAb。
术语“特异性结合”或“特异性结合于”等类似术语意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征可以是平衡解离常数是至少约1×10-6M或更小(例如较小的KD表示较紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法是所属领域中众所周知的且包括例如平衡渗析、表面等离子共振和类似方法。如本文所描述，已通过表面等离子共振(例如BIACORETM)识别特异性结合于溶血素A的抗体。此外，如本文所用，结合于溶血素A中的一个结构域和一种或多种额外抗原的多特异性抗体或结合于溶血素A的两个不同区的双特异性抗体仍然被视为“特异性结合”的抗体。
术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子共振(例如BIACORETM)或溶液-亲和力ELISA所测量对溶血素A具有以KD表示至少10-7M；优选10-8M；更优选10-9M，甚至更优选10- 10M，甚至更优选10-11M的结合亲和力的mAb。
术语“缓慢解离速率”、“K解离”或“kd”意在描述如通过表面等离子共振(例如BIACORETM)所测定以1×10-3s-1或更小、优选1×10-4s-1或更小的速率常数自溶血素A解离的抗体。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”和类似术语，包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在、酶促可获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体中保留结合于溶血素A的能力的一个或多个片段。
在具体实施例中，本发明的抗体或抗体片段可以结合于治疗剂部分(“免疫结合物”)，如抗生素、第二抗溶血素A抗体或针对如IL-1、IL-6或TGF-β的细胞因子的抗体或适合用于治疗疾病或病状的任何其它治疗剂部分，所述疾病或病状包括金黄色葡萄球菌感染、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。
如本文所用，“经分离的抗体”意在指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体(Ab)的抗体(例如特异性结合溶血素A的经分离的抗体或其片段基本上不含特异性结合不是溶血素A的抗原的Ab)。
如本文所用，术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，其允许通过例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度改变来分析即时生物分子相互作用。
如本文所用，术语“KD”意在指具体抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定位。单一抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以结合于抗原上的不同区域且可以具有不同生物效应。术语“表位”也指抗原上B细胞和/或T细胞作出反应的位点。其还指抗原中由抗体结合的区。表位可以按结构或功能来定义。功能表位通常是结构表位的子集，且具有直接促成相互作用亲和力的残基。表位还可以是构象的，其由非线性氨基酸组成。在某些实施例中，表位可以包括决定位，所述决定位是如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面分组，且在某些实施例中，可以具有具体三维结构特征和/或具体电荷特征。
当提及核酸或其片段时，术语“实质一致性”或“基本上一致”表明当以适当核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，如通过如下文所讨论的任何众所周知的序列一致性算法(如FASTA、BLAST或GAP)所测量，在至少约90％且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列一致性。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质一致性的核酸分子可以编码与由参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
如适用于多肽，术语“实质相似性”或“基本上类似”意指当如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空隙权重最佳比对时，两个肽序列拥有至少90％序列一致性，甚至更优选是至少95％、98％或99％序列一致性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基由侧链(R基团)具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般说来，保守氨基酸取代将不会显著改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列彼此因保守取代而不同的情况下，可以调高相似百分比或程度以校正取代的保守性。用于进行这一调节的手段是所属领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24：307-331，其以引用的方式并入本文中。侧链具有类似化学性质的氨基酸群的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：离氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选保守氨基酸取代群是：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、离氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷酰胺。或者，保守置换是在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256：144345中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列相似性典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有如GAP和BESTFIT的程序，其可以在默认参数情况下用于测定紧密相关多肽(如来自不同物种的有机体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG版本6.1。也可以使用FASTA以默认或推荐参数比较多肽序列；GCG版本6.1中的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和检索序列之间最佳重叠的区的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库相比较时，另一优选算法是计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215：403-410和(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25：3389-3402，其各自以引用的方式并入本文中。
在具体实施例中，用于本发明方法中的抗体或抗体片段可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可以对目标多肽的不同表位具特异性或可以含有对超过一种目标多肽的表位具特异性的抗原结合域。可以用于本发明的背景中的示例性双特异性抗体格式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二IgCH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，且其中至少一个氨基酸差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比有所减少。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号是H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU是Y436F)。可以存在于第二CH3内的其它修饰包括：在IgG1 mAb的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2mAb的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU是N384S、K392N和V422I)；和在IgG4mAb的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所描述的双特异性抗体格式的变化涵盖于本发明范围内。
词组“治疗有效量”意指产生给予其所要实现的所要作用的量。确切量将取决于治疗目的，且将是由所属领域的技术人员使用已知技术(参见例如Lloyd(1999)《医药化合物工艺、科学和技术(The Art，Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)》)可以确定的。
总体描述
金黄色葡萄球菌溶血素A毒素是一种所分泌的33kDa单聚蛋白质，其在宿主细胞膜中寡聚化成七聚结构以形成孔隙，从而导致细胞溶解、炎症和组织损伤。已证实溶血素A在肺炎、皮肤坏死、心内膜炎和败血病中起作用。
本文所描述的抗体展示特异性结合于溶血素A且在一些实施例中，可以适用于治疗罹患金黄色葡萄球菌感染的患者，或预防这类感染。使用这类抗体可以是治疗罹患金黄色葡萄球菌感染的患者的有效手段，或可以用于减轻金黄色葡萄球菌感染的症状的严重程度。其可以单独或作为辅助疗法与所属领域中已知用于治疗金黄色葡萄球菌感染的其它治疗剂部分或模式一起使用，所述其它治疗剂部分或模式是如但不限于抗生素、非类固醇消炎药(NSIAD)(或其它姑息疗法)或皮质类固醇，如普赖松(prednisone)。其可以与对不是溶血素A的抗原具有特异性的额外抗体结合使用，或可以与其它类型的治疗组合。
在一些实施例中，本文所描述的抗体可以适合用于预防、治疗或管理金黄色葡萄球菌感染的疾病或病状，包括但不限于皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎和疖病和痈病(疖)。
在某些实施例中，本发明的抗体是从用第一免疫原，如天然、全长溶血素A(SEQ IDNO：291)或用经修饰形式的溶血素A(SEQ ID NO：295)或溶血素A片段免疫，随后用第二免疫原或用溶血素A的免疫原活性片段免疫的小鼠获得。
免疫原可以是溶血素A的免疫原性片段或编码其片段的DNA。免疫原可以是偶合到组氨酸标签和/或抗体的Fc区的片段的溶血素A。
全长溶血素A的氨基酸序列如SEQ ID NO：291所示。经修饰的溶血素A的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：295所示。
在某些实施例中，特异性结合于溶血素A的抗体可以使用上文提及的区的片段，或从本文所描述的区的N或C未端中任一个或两个延伸超过指定区约5到约20个氨基酸残基的肽来制备。在某些实施例中，上文所提及的区或其片段的任何组合可以用于制备溶血素A-特异性抗体。在某些实施例中，溶血素A的上文所提及的区中的任何一种或多种或其片段可以用于制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
抗体的抗原结合片段
除非另外特别指出，否则如本文所用，术语“抗体”应理解是涵盖包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即，“完全抗体分子”)以及其抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”和类似术语，包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在、酶促可获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体中保留特异性结合于溶血素A的能力的一个或多个片段。抗体片段可以包括Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或经分离的CDR。抗体的抗原结合片段可以使用任何适合的标准技术衍生自例如完全抗体分子，所述适合的标准技术是如蛋白水解消化或涉及DNA编码抗体可变和(视情况)恒定域的操纵和表达的重组基因工程改造技术。这类DNA是已知的和/或是从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)轻易可获得的或可以是合成的。可以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如将一个或多个可变和/或恒定域布置成适合的组态，或引入密码子；形成半胱氨酸残基；修饰、添加或去除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如经分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽。如以下的其它工程改造分子也涵盖于如本文所用的表述“抗原结合片段”内：结构域-特异性抗体、单-结构域抗体、结构域-缺失抗体、嵌合抗体、CDR-接枝抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(nanobody)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段将典型地包含至少一个可变域。可变域可以具有任何尺寸或氨基酸组成，且通常将包含至少一个CDR，其邻近一个或多个构架序列或与其同框。在VH结构域与VL结构域相缔合的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以任何适合的排列相对于彼此定位。举例来说，可变区可以是二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单聚VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有共价键联到至少一个恒定域的至少一个可变域。本发明的抗体的抗原结合片段内可以发现的可变和恒定域的非限制性、示例性组态包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CHl-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变和恒定域的包括上文所列的示例性组态中的任一个的任何组态中，可变和恒定域可彼此直接键联或可以通过完全或部分铰链或连接符区键联。铰链区可以由至少2(例如5、10、15、20、40、60或更多)个氨基酸组成，其在单一多肽分子中在邻近可变和/或恒定域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含上文所列的可变和恒定域组态中的任一个彼此非共价缔合和/或与一个或多个单聚VH或VL结构域(例如通过二硫键)的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。
就完全抗体分子来说，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段将典型地包含至少两个不同的可变域，其中各可变域能够特异性结合于单独的抗原或相同抗原上不同的表位。任何多特异性抗体格式(包括本文所公开的示例性双特异性抗体格式)均可适合于使用所属领域中可用的常规技术在本发明的抗体的抗原结合片段的背景下使用。
本发明包括抗溶血素A抗体和抗原结合片段，其具有包括本文所列的氨基酸序列以及具有细胞和/或活体外翻译后修饰的变异体的免疫球蛋白链。举例来说，本发明包括特异性结合于溶血素A的抗体和其抗原结合片段，其包含本文所列的重链和/或轻链氨基酸序列(例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)；以及一个或多个氨基酸残基经糖基化、一个或多个Asn残基经脱酰氨基化、一个或多个残基(例如Met、Trp和/或His)经氧化、N端Gln是焦谷氨酸(pyroE)和/或C端离氨酸丢失的抗体和片段。
本发明包括用于制备本发明的抗溶血素A抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，其包括(i)引入编码所述抗体或抗原结合片段的轻免疫球蛋白链和/或重免疫球蛋白链(例如重链或其VH或包含其HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白和/或轻链或其VL或包含其LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白)的一个或多个聚核苷酸，例如其中聚核苷酸位于载体中和/或可操作地连接到启动子；(ii)在有利于表达所述或所述聚核苷酸的条件下培养宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或毕赤酵母属(Pichia)细胞或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)细胞)，和(iii)视情况，从宿主细胞和/或生长宿主细胞的培养基分离抗体或片段或链。当制备包含超过一条免疫球蛋白链的抗体或抗原结合片段，例如包含两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的抗体时，所述链在单一宿主细胞中共同表达使得链例如在细胞中或在细胞表面上或在细胞外部(如果这类链被分泌)缔合，从而形成抗体或抗原结合片段分子。所述方法包括仅表达重免疫球蛋白链或仅表达轻免疫球蛋白链(例如本文所讨论的免疫球蛋白链中的任一个，包括其成熟片段和/或可变域)的方法。这类链适合作为例如包括这类链的抗体或抗原结合片段的表达中的中间物。本发明包括这类表达方法的产物(例如抗体、抗原结合片段、VH或VL)。
人类抗体的制备
在转基因小鼠中产生人类抗体的方法是所属领域中已知的。在本发明的背景下可以使用任何这类已知方法来制备特异性结合于溶血素A的人类抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术(参见例如US 6,596,541，Regeneron Pharmaceuticals，
Figure BDA0002106228890000261
)或任何其它已知用于产生单克隆抗体的方法，最初分离了具有人类可变区和小鼠恒定区的针对溶血素A的高亲和力嵌合抗体。
Figure BDA0002106228890000262
技术涉及产生转基因小鼠，其基因组包含可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人类重链和轻链可变区，使得小鼠响应于抗原刺激产生包含人类可变区和小鼠恒定区的抗体。分离编码抗体的重链和轻链的可变区的DNA且可操作地连接到编码人类重链和轻链恒定区的DNA。然后，使DNA在能够表达完全人类抗体的细胞中表达。
通常，用相关抗原激发
Figure BDA0002106228890000271
小鼠，且自表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)。淋巴细胞可与骨髓瘤细胞株融合以制备永生杂交瘤细胞株，且这类杂交瘤细胞株经筛选和选择以识别产生对相关抗原具特异性的抗体的杂交瘤细胞株。可分离编码重链和轻链的可变区的DNA且键联到重链和轻链的所需同型恒定区。这类抗体蛋白质可以在细胞(如CHO细胞)中产生。或者，可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变域的DNA。
最初分离具有人类可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如以下实验部分中，对抗体进行表征且针对包括亲和力、选择性、表位等所需特征进行选择。小鼠恒定区经所需人类恒定区置换以产生本发明的完全人类抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。虽然所选恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和目标特异性特征存在于可变区中。
一般说来，本发明的抗体具有极高亲和力，当通过结合于固定于固相上或液相中的抗原来测量时，典型地具有约10-12到约10-7M的KD。小鼠恒定区经所需人类恒定区置换以产生本发明的完全人类抗体。虽然所选恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和目标特异性特征存在于可变区中。
生物等效物
本发明的抗溶血素A抗体和抗体片段涵盖氨基酸序列不同于所描述的抗体但保留结合溶血素A的能力的蛋白质。这类变异体抗体和抗体片段当与亲本序列相比较时包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但展现基本上等效于所描述的抗体的生物活性。同样地，本发明的抗体编码DNA序列涵盖当与所公开的序列相比较时包含一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，但编码基本上生物等效于本发明的抗体或抗体片段的抗体或抗体片段的序列。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是当在类似实验条件下以相同摩尔剂量(单一剂量或多个剂量)给予时吸收速率和程度不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，那么其被视为生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度方面是等效的，但在其吸收速率方面不等效，那么其将被视为等效物或药物替代物，然而可被视为生物等效的，因为这类在吸收速率方面的差异是有意的且在标记中被反映出来，在例如长期使用时不是达到有效体内药物浓度所必需的，且对于所研究的具体药物产品来说被认为在医学上不重要。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和性能方面不存在临床上有意义的差异，那么其是生物等效的。
在一个实施例中，如果患者可在参考产品与生物产品之间转换一或多次而与未进行这类转换的持续疗法相比没有包括临床上显著的免疫原性变化或有效性减弱的有害作用风险的预期增加，那么两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白两者均通过针对使用条件的常见作用机制(在这类机制已知的情况下)起作用，那么其是生物等效的。
生物等效性可以通过活体内和/或活体外方法来证实。生物等效性测量包括例如(a)在人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中测量随时间变化在血液、血浆、血清或其它生物流体中抗体或其代谢产物的浓度；(b)已与人类活体内生物可利用性数据相关联且适当预示人类活体内生物可利用性数据的活体外测试；(c)人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中抗体(或其目标)的适当急性药理学作用经测量是时间的函数；和(d)在建立抗体的安全性、功效或生物可利用性或生物等效性的良好控制的临床试验中。
可以通过例如进行残基或序列的各种取代或去除生物活性不需要的未端或内部残基或序列来构筑本发明的抗体的生物等效变异体。举例来说，可以去除不是生物活性所必需的半胱氨酸残基或用其它氨基酸置换以防止在复原后形成不必要或不恰当的分子内二硫键。在其它情形中，生物等效抗体可以包括包含氨基酸变化的抗体变异体，所述氨基酸变化改变抗体的糖基化特征，例如清除或去除糖基化的突变。
包含Fc变异体的抗溶血素A抗体
根据本发明的某些实施例，所提供的抗溶血素A抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，其增强或削弱例如与中性pH值相比在酸性pH值下抗体与FcRn受体的结合。举例来说，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗溶血素A抗体，其中所述或所述突变使在酸性环境中(例如在pH值在约5.5到约6.0范围内的内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力增加。这类突变可以使得当给予动物时抗体的血清半衰期增加。这类Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施例中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如308F和/或308P)。在另一实施例中，修饰包含265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)修饰。
举例来说，本发明包括包含Fc结构域的抗溶血素A抗体，所述Fc结构域包含一个或多个选自由以下组成的组的突变对或突变群：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能的组合和本文所公开的抗体可变域内的其它突变涵盖于本发明范围内。
本发明还包括包含嵌合重链恒定(CH)区的抗溶血素A抗体，其中嵌合CH区包含衍生自超过一种免疫球蛋白同型的CH区的区段。举例来说，本发明的抗体可以包含嵌合CH区，所述嵌合CH区包含衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH2结构域的一部分或全部与衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH3结构域的一部分或全部的组合。根据某些实施例，本发明的抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合CH区。举例来说，嵌合铰链可以包含衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“上部铰链”氨基酸序列(根据EU编号自位置216到227的氨基酸残基)与衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“下部铰链”序列(根据EU编号自位置228到236的氨基酸残基)的组合。根据某些实施例，嵌合铰链区包含衍生自人类IgG1或人类IgG4上部铰链的氨基酸残基和衍生自人类IgG2较低铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，如本文所描述包含嵌合CH区的抗体可以展现改变的Fc效应子功能，而不会不利地影响抗体的治疗或药物动力学特性。(参见例如2013年2月1日申请的美国临时申请案第61/759,578号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
本发明还包括包含经修饰重链恒定(CH)区的抗溶血素A抗体，其中已引入妨碍结合蛋白质A的一个或多个取代(例如突变)。举例来说，在一些实施例中，本发明的抗溶血素A抗体具有His435已突变成Arg的IgG1恒定区。在重链恒定区中存在这种点突变的情况下，本发明的抗溶血素A抗体将不结合于蛋白质A。在本发明的其它实施例中，抗溶血素A抗体在重链恒定区中含有二肽突变H435R/Y436F(EU编号；根据IMGT是H95R/Y96F)以消除蛋白质A结合。(参见例如2010年6月25日申请的美国专利第8,586,713号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。)
抗体的生物学特征
一般说来，本发明的抗体可通过结合于溶血素A来起作用。在一些实施例中，本发明的抗体可以结合于另一抗原(可交叉反应的抗体)。
在某些实施例中，本发明的抗体可以结合于除溶血素A之外的其它细菌毒素或毒素亚单位。本发明的抗体可结合的金黄色葡萄球菌的额外毒素或毒素亚单位包括双组分成孔白细胞毒素(例如杀白细胞素或γ溶血素)和/或这些毒素的S或F亚单位(例如LukF、LukD和/或HlgB)。在某些实施例中，本发明的抗体仅显示显著结合于溶血素A。在某些实施例中，本发明的抗体仅可检测地结合于溶血素A。
在某些实施例中，本发明的抗体可以是双特异性抗体。本发明的双特异性抗体可以结合溶血素A的一个结构域中的一个表位且也可以结合第二结构域中的一个表位。在某些实施例中，本发明的双特异性抗体可以结合相同结构域中的两个不同表位。
在一个实施例中，本发明提供一种结合于溶血素A的完全人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段展现以下特征中的一种或多种：(i)包含HCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262和282，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(ii)包含LCVR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250和270，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268和288，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和LCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256和276，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；(iv)包含HCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264和284，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；HCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266和286，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；LCDR1结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252和272，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和LCDR2结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254和274，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似的序列；和(v)以等于或小于10-7的KD结合于溶血素A。
如通过活体外或活体内分析所测定，本发明的某些抗溶血素A抗体能够结合于溶血素A且中和其活性。本发明的抗体结合于溶血素A和中和其活性的能力可以使用所属领域的技术人员已知的任何标准方法来测量，包括如本文所描述的结合分析或活性分析。
用于测量结合活性的非限制性、示例性活体外分析说明于本文中的实例3和4中。在实例6中，通过表面等离子共振来测定人类抗溶血素A抗体的结合亲和力和动力学常数，且在T200Biacore仪器上进行测量。实例5描述使用溶血素A-特异性抗体中和金黄色葡萄球菌溶血素A。
本发明还包括结合于以下蛋白质或肽中的任一个的至少一个生物活性片段的抗溶血素A抗体和其抗原结合片段：SEQ ID NO：291(全长野生型溶血素A)或SEQ ID NO：295(经修饰形式的溶血素A)。本文所描述的溶血素A肽中的任一个或其片段可以用于产生抗溶血素A抗体。
肽可经修饰以包括某些残基的添加或取代，用于标记或用于结合于载体分子(如KLH)的目的。举例来说，可以在肽的N端或C端添加半胱氨酸，或可以添加连接符序列以制备用于结合于例如KLH以进行免疫的肽。
对溶血素A具特异性的抗体可不含额外标记或部分，或其可以含有N端或C端标记或部分。在一个实施例中，所述标记或部分是生物素。在结合分析中，标记(如果有)的位置可以确定肽相对于与肽结合的表面的取向。举例来说，如果表面涂有亲和素，那么含有N端生物素的肽将经取向使得肽的C端部分将在所述表面的远程。在一个实施例中，标记可以是放射性核素、荧光染料或MRI可检测标记。在某些实施例中，这类标记抗体可以用于诊断分析，包括成像分析。
表位定位和相关技术
本发明包括与存在于溶血素A的一个或多个区内的一个或多个氨基酸相互作用的抗溶血素A抗体。与抗体结合的表位可以由定位于溶血素A分子的上述区中的任一个内的3或更多(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)个氨基酸的单一连续序列组成(例如结构域中的线性表位)。或者，表位可以由定位于溶血素A分子的上述区中的任一个或两个内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如构象表位)。
所属领域的一般技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断分析，如描述于《抗体(Antibodies)》，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)中的分析。其它方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽墨点分析(Reineke(2004)《分子生物学方法》248：443-63)、肽裂解分析、结晶研究和NMR分析。此外，可采用如表位切除、表位萃取和抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)《蛋白质科学(Protein Science)》9：487-496)。可以用于识别与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般地说，氢/氘交换法涉及对相关蛋白质进行氘标记，随后使抗体结合于经氘标记的蛋白质。接着，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，且由抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比不是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氘至氢反交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，且因此与未包括在界面中的氨基酸相比展现相对较高的质量。在抗体解离之后，对目标蛋白质进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此公开含有与抗体相互作用的特异性氨基酸的含有氘标记残基的肽。参见例如Ehring(1999)《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2)：252-259；Engen和Smith(2001)《分析生物化学》73：256A-265A。
术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞作出反应的位点。B细胞表位可均由连续氨基酸或因蛋白质的三级折叠而并列的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时典型地被保留，而通过三级折叠而形成的表位在用变性溶剂处理时典型地丢失。表位典型地包括呈独特空间构象的至少3个，且更通常是至少5或8-10个氨基酸。
修饰辅助分型(MAP)亦称为基于抗原结构的抗体分型(ASAP)，是一种根据各抗体对经化学或酶修饰的抗原表面的结合型态的相似性对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US 2004/0101920，其具体地说以全文引用的方式并入本文中)。各类别可反映明显不同于由另一类别表示的表位或与其部分重叠的独特表位。此技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，使得表征可集中于遗传上不同的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于识别产生具有所需特征的mAb的罕见杂交瘤纯系。MAP可以用于将本发明的抗体分类到结合不同表位的抗体群中。
在某些实施例中，抗溶血素A抗体或其抗原结合片段结合例示于野生型溶血素A中的如SEQ ID NO：291中所例示或经修饰的溶血素A中的如SEQ ID NO：295中所例示的区中的任何一种或多种内的表位或其片段。
本发明包括与本文所描述的特异性示例性抗体中的任一个或具有本文所描述的示例性抗体中的任一个的CDR序列的抗体结合于相同表位或表位的一部分的人类抗溶血素A抗体。同样地，本发明还包括与本文所描述的特异性示例性抗体中的任一个或具有本文所描述的示例性抗体中的任一个的CDR序列的抗体竞争结合于溶血素A或溶血素A片段的抗溶血素A抗体。
我们可以通过使用所属领域中已知的常规方法容易地确定抗体是否与参考抗溶血素A抗体结合于相同表位或发生竞争结合。举例来说，是确定测试抗体是否与本发明的参考抗溶血素A抗体结合于相同表位，允许参考抗体在饱和条件下结合于溶血素A蛋白质或肽。接着，评估测试抗体结合于溶血素A分子的能力。如果在与参考抗溶血素A抗体饱和结合的后测试抗体能够结合于溶血素A，那么可得出以下结论：测试抗体结合于与参考抗溶血素A抗体不同的表位。另一方面，如果在与参考抗溶血素A抗体饱和结合的后测试抗体不能结合于溶血素A蛋白质，那么测试抗体可以结合于与由本发明的参考抗溶血素A抗体所结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参考抗溶血素A抗体竞争结合，以两种取向执行上文所描述的结合方法：在第一取向中，允许参考抗体在饱和条件下结合于溶血素A蛋白质，随后评估测试抗体与溶血素A分子的结合。在第二取向中，允许测试抗体在饱和条件下结合于溶血素A分子，随后评估参考抗体与溶血素A分子的结合。如果在两种取向中，仅第一(饱和)抗体能够结合于溶血素A分子，那么得出以下结论：测试抗体与参考抗体竞争结合于溶血素A。如所属领域的一般技术人员将了解，与参考抗体竞争结合的抗体未必可以与参考抗体结合于相同的表位，但可以通过结合重叠或邻近表位在空间上阻断参考抗体的结合。
如果两种抗体各自竞争抑制(阻断)另一者与抗原的结合，那么其结合于相同或重叠的表位。换句话说，如在竞争结合分析中所测量，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体将另一种抗体的结合抑制达到少50％，但优选75％、90％或甚至99％(参见例如Junghans等人，《癌症研究(Cancer Res.)》199050：1495-1502)。或者，如果抗原中基本上所有减少或清除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或清除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同表位。如果一些减少或清除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或清除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
然后可以进行额外常规实验(例如肽突变和结合分析)以证实所观察到的测试抗体结合缺乏是否事实上归因于与参考抗体结合于相同的表位，或者是否是空间阻断(或另一现象)造成了所观察到的结合缺乏。这类别的实验可以使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或所属领域中可用的任何其它定量或定性抗体结合分析来进行。
免疫结合物
本发明涵盖一种结合于治疗剂部分的人类抗溶血素A单克隆抗体(“免疫结合物”)，所述治疗剂部分是如能够降低金黄色葡萄球菌感染的严重程度或改善至少一种与金黄色葡萄球菌感染相关的症状或其严重程度的药剂。如本文所用，术语“免疫结合物”是指化学或生物学键联到放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告子部分、酶、毒素或治疗剂的抗体。抗体可沿分子在任何位置键联到放射性药剂、细胞因子、干扰素、目标或报告子部分、酶、毒素或治疗剂，只要其能够结合其靶标即可。免疫结合物的实例是抗体药物结合物。在一些实施例中，药剂可以是针对溶血素A或针对细胞因子(如IL-1、IL-6)或趋化因子(如TGF-β)的第二种不同的抗体。可结合于抗溶血素A抗体的治疗剂部分的类型将考虑所要治疗的病状和所要实现的所需治疗作用。适合用于形成免疫结合物的药剂的实例是所属领域中已知的；参见例如，WO 05/103081。免疫结合物和免疫毒素的制备是所属领域中普遍众所周知的(参见例如美国专利第4340535号)。免疫结合物详细描述于例如US 7250492、US7420040和US 7411046中，所述专利各自以全文并入本文中。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可对目标多肽的不同表位具特异性或可以含有对超过一种目标多肽具特异性的抗原结合域。参见例如Tutt等人，1991，《免疫学杂志》147：60-69；Kufer等人，2004，《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》22：238-244。本发明的抗体可以键联到另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)或与其共同表达。举例来说，抗体或其片段可以功能上键联(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或以其它方式)到一个或多个其它分子实体，如另一抗体或抗体片段，以制备具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。举例来说，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对溶血素A的N端区或其片段具特异性，而免疫球蛋白的另一条臂对溶血素A的C端区或第二治疗剂靶标具特异性，或结合于治疗剂部分。可以用于本发明的背景中的示例性双特异性抗体格式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，且其中至少一个氨基酸差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比有所减少。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号是H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU是Y436F)。第二CH3内可发现的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU是N384S、K392N和V422I)；和在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。关于上文所描述的双特异性抗体格式的变化涵盖于本发明范围内。
可以用于本发明的背景中的其它示例性双特异性格式包括但不限于例如基于scFv或双功能抗体双特异性格式、IgG-scFv融合物、双重可变域(DVD)-Ig、四体杂交瘤(Quadroma)、杵入臼结构、常见轻链(例如具有杵入臼结构的常见轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、白氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(关于前述格式的综述参见例如Klein等人2012，mAbs 4：6，1-11和其中所引用的参考文献)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸结合来构筑，例如其中具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于产生位点特异性抗体-寡核苷酸结合物，其然后自组装成具有所规定的组成、价数和几何形状的多聚复合物。(参见例如Kazane等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》[电子出版：2012年12月4日)。
治疗剂给予和调配物
本发明提供包含如本文所讨论的抗溶血素A抗体或其抗原结合片段的治疗剂组合物。根据本发明的治疗剂组合物可以与适合的载剂、赋形剂和并入调配物中以提供改良的转移、递送、耐受性和类似性质的其它药剂一起给予。在所有医药化学工作者已知的配方书中可以发现许多适当的调配物：Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，PA。这些调配物包括例如粉剂、糊剂、膏剂、果冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTINTM)、DNA结合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)《医药科学技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52：238-311。
抗体的剂量可视所要给予的个体的年龄和体征、目标疾病、病状、投药途径和类似因素而变化。当本发明的抗体用于预防或治疗成人患者的皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎或疖病和痈病(疖)或用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染时，通常以每千克体重约0.1到约100mg，更优选每千克体重约5到约100、约10到约90或约20到约70mg的单一剂量经静脉内给予本发明的抗体是有利的。视病状的严重程度而定，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，可以初始剂量是至少约0.1mg到约800mg、约1到约500mg、约5到约300mg或约10到约200mg、到约100mg或到约50mg的形式给予本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，在初始剂量之后可以与初始剂量相比可能大致相同或更小的量给予第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中后续剂量相隔至少1天到3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
各种递送系统是已知的且可以用于给予本发明的医药组合物，例如于脂质体中的封装物、微粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人(1987)《生物化学杂志》262：4429-4432)。引入的方法包括但不限于真皮内、经真皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可通过任何方便途径给予组合物，例如通过输注或快速注射、通过通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收且可以与其它生物活性剂一起给予。给予可以是全身的或局部的。也可以在囊泡，具体地说脂质体中递送医药组合物(参见例如Langer(1990)《科学》249：1527-1533)。
使用纳米粒子来递送本发明的抗体也涵盖于本文中。抗体结合的纳米粒子可以用于治疗与诊断应用。抗体结合的纳米粒子和制备方法和用途由以引用的方式并入本文中的Arruebo，M.等人2009(“Antibody-conjugated nanoparticles for biomedicalapplications”，《纳米材料杂志(J.Nanomat.)》第2009卷，文章编号439389,24页，doi：10.1155/2009/439389)详细描述。用于递送药物的纳米粒子亦已描述于例如US 8277812、US 8258256、US 8257740、US 8246995、US 8236330中，所述专利各自以全文并入本文中。
在某些情况下，可以在控制释放系统中递送医药组合物。在一个实施例中，可以使用泵。在另一实施例中，可以使用聚合材料。在另一实施例中，可以将控制释放系统放置于组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公众已知的方法来制备。举例来说，可以例如通过将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备注射制剂。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂的等张溶液等，其可以与如以下的适当的增溶剂组合使用：醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，存在已采用的例如芝麻油、大豆油等，其可与如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。因此制备的注射优选填充于适当的安瓿中。
本发明的医药组合物可以用标准针头和注射器进行皮下或静脉内递送。此外，相对于皮下递送，笔式递送装置已容易地应用于递送本发明的医药组合物。这类笔式递送装置可以是可再次使用的或抛弃式的。可再次使用的笔式递送装置通常利用含有医药组合物的可替换药筒。一旦已给予筒内的所有医药组合物且药筒是空的，即可轻易地将空的药筒弃去且用含有医药组合物的新药筒代替。然后可以再次使用所述笔式递送装置。在抛弃式笔式递送装置中，没有可替换的药筒。相反地，抛弃式笔式递送装置预填充有保持在装置内的储集器中的医药组合物。一旦储集器内的医药组合物用空，即将整个装置弃去。
许多可以再次使用的笔式和自动注射器递送装置已应用于皮下递送本发明的医药组合物。实例包括但当然不限于(仅举几个例子)AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Burghdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly andCo.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)。已应用于皮下递送本发明的医药组合物的抛弃式笔式递送装置的实例包括但当然不限于(仅举几个例子)SOLOSTARTM笔(Sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICK TM自动注射器(Amgen，ThousandOaks，CA)、PENLET TM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)和HUMIRA TM笔(Abbott Labs，Abbott Park，IL)。
有利地，用于上文所描述的经口或非经肠用途的医药组合物是制备成呈适合于符合活性成分的剂量的单位剂量形式的剂型。这类呈单位剂量形式的剂型包括例如锭剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。上述所含抗体的量通常是每一呈单位剂量形式的剂型约5到约500mg；尤其在注射剂形式中，优选上述所含抗体是对于其它剂型约5到约100mg和约10到约250mg。本发明包括一种注射装置(例如预填充注射器或预填充自动注射器)或一种小瓶(例如玻璃或塑料小瓶)，其包含本发明的抗体或抗原结合片段或其包括医药学上可接受的载剂的医药组合物。
抗体的治疗用途
在本发明的某些实施例中，本发明抗体适用于治疗金黄色葡萄球菌感染，或至少一种与金黄色葡萄球菌感染相关的症状。在一些实施例中，抗体可以适用于治疗以下病状或症状：皮肤坏死、皮肤和软组织感染(包括脓肿)、手术部位感染、人造关节感染、菌血症、败血症、脓毒性关节炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、中毒性休克综合症、乳房炎或疖病和痈病(疖)。也涵盖本发明的抗体在处于发展金黄色葡萄球菌感染危险的中的患者中用于预防的用途。这些患者包括老年人或因疾病或用免疫抑制治疗剂治疗而免疫受损的患者或处于较大的医院感染风险中的患者，如手术后患者。在上文所讨论的治疗用途的各个实施例中，金黄色葡萄球菌细菌可能对一种或多种类型的抗生素治疗具有抗性。在一个实施例中，细菌是耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)。预期本发明的抗体可以单独或与第二药剂或第三药剂结合使用，用于治疗金黄色葡萄球菌感染，或用于缓解至少一种与金黄色葡萄球菌感染相关的症状或并发症。第二或第三药剂可以与本发明的抗体同时递送，或其可以在本发明的抗体之前或之后分开给予。可以接受本发明的抗体或抗原结合片段或其医药组合物的患者包括例如动物，如哺乳动物，如人类(例如年长人类，例如65岁以上)、兔、小鼠、大鼠、奶牛、猪、狗、灵长类动物、马或绵羊。
在某些实施例中，本发明抗体适用于减少个体或个体的具体组织或器官中的金黄色葡萄球菌细菌的数目。在一些实施例中，金黄色葡萄球菌细菌可能对一种或多种类型的抗生素治疗具抗性。在一个实施例中，细菌是耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)。在某些实施例中，本发明抗体适用于降低个体中由金黄色葡萄球菌细菌产生的溶血素A的毒性活性，从而减轻由感染产生的症状，且容许其它医药药剂和/或患者的免疫系统控制感染。
在本发明的另一实施例中，本发明抗体用于制备用于治疗罹患金黄色葡萄球菌感染或具有与金黄色葡萄球菌感染相关的症状的患者的医药组合物。
组合疗法
组合疗法可以包括本发明的抗溶血素A抗体和可有利地与本发明的抗体或与本发明抗体的生物活性片段组合的任何额外治疗剂。
所述抗体可以与如以下的其它疗法结合使用：抗生素NSAID、抗体LTM14、抗体LC10、皮质类固醇或普赖松。
额外治疗活性组分可以在给予本发明的抗溶血素A抗体之前、与其同时或在其之后给予。出于本发明的目的，考虑抗溶血素A抗体“与一种或多种额外治疗活性组分组合”给予的这类给予方案。
抗体的诊断用途
也可以使用本发明的抗溶血素A抗体来检测和/或测量样品中的溶血素A，例如用于诊断目的。设想本发明的抗体中的任何一种或多种可以用于检测金黄色葡萄球菌感染的存在和严重程度。用于溶血素A的示例性诊断分析可以包括例如使获自患者的样品与本发明的抗溶血素A抗体接触，其中抗溶血素A抗体经可检测标记或报告子分子标记或用作捕获配位体以从患者样品选择性分离溶血素A。或者，未经标记的抗溶血素A抗体可以与本身经可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告子分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明(rhodamine)；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的溶血素A的具体示例性分析包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
可以用于根据本发明的溶血素A诊断分析中的样品包括可以获自患者的任何组织或流体样品，其在正常或病理学条件下含有可检测量的溶血素A或其片段。通常，将测量获自健康患者(例如未患有金黄色葡萄球菌感染的患者)的具体样品中的溶血素A的含量以最初建立溶血素A的基线或标准含量。然后，可以将溶血素A的此基线含量与在从怀疑具有金黄色葡萄球菌感染相关病状或与这类病状相关的症状的个体获得的样品中测量的溶血素A含量相比较。
对溶血素A具有特异性的抗体可不含额外标记或部分，或其可以含有N端或C端标记或部分。在一个实施例中，所述标记或部分是生物素。在结合分析中，标记(如果有)的位置可以确定肽相对于与肽结合的表面的取向。举例来说，如果表面涂有亲和素，那么含有N端生物素的肽将经取向使得肽的C端部分将在所述表面的远程。在一些实施例中，标记可以是可检测标记，如放射性核素、荧光染料或MRI可检测标记。可检测标记可以键联到抗体，其中这类抗体可以用于成像分析。
实例
公布以下实例，以便为所属领域的一般技术人员提供对如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，且不欲限制本发明人视为其发明的内容的范围。除非另有指示，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。
实例1.产生针对溶血素A的人类抗体
使用两种免疫原来免疫小鼠：不含信号序列(氨基27-391)的全长野生型溶血素A(Hla)和全长无毒溶血素A(Hla-H35L)；两种免疫原在大肠杆菌中均是重组His标记蛋白表达的且经纯化。
在某些实施例中，可以使用上文提及的区的片段或从本文所描述的区的N未端或C未端中的任一个或两个延伸超过指定区约5到约20个氨基酸残基的肽来制备特异性结合于溶血素A的抗体。在某些实施例中，上文所提及的区或其片段的任何组合可以用于制备溶血素A特异性抗体。在某些实施例中，可以使用溶血素A的上文所提及的结构域中的任何一种或多种或其片段来制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。通过用无毒溶血素A免疫来制备H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P和H1H15418P2；且通过用野生型溶血素A免疫来制备H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P和H1H15420P2。
将如上文所提及用作免疫原的全长蛋白或其片段与用以刺激免疫反应的佐剂一起直接给予给包含编码人类免疫球蛋白重和κ轻链可变区的DNA的
Figure BDA0002106228890000451
小鼠。通过溶血素A-特异性免疫分析监测抗体免疫反应。当实现所需免疫反应时，如以全文引用的方式具体地并入本文中的U.S.2007/0280945A1中所描述，直接从未融合到骨髓瘤细胞的抗原阳性B细胞分离抗溶血素A抗体。使用这种方法，获得若干完全人类抗溶血素A抗体(即，具有人类可变域和人类恒定域的抗体)；以这种方式产生的示例性抗体命名如下：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2和H1H15420P2。
根据本实例的方法产生的示例性抗体的生物特性详细描述于下文所列的实例中。
实例2.重链和轻链可变区氨基酸序列
表1列出了对溶血素A具特异性的所选抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列配对和其对应抗体标识符。本文中典型地根据以下命名法来提及抗体：Fc前缀(例如“H4H”、“H1M”、“H2M”)，随后是数字标识符(例如如表1中所示的“5375”)，随后是“P”或“N”后缀。因此，根据此命名法，抗体可以称为例如“H1H5375”。本文中所用的抗体名称上的H4H、H1M和H2M前缀指示抗体的具体Fc区。举例来说，“H2M”抗体具有小鼠IgG2 Fc，而“H4H”抗体具有人类IgG4 Fc。如所属领域的一般技术人员将了解，H1M或H2M抗体可以转化成H4H抗体，且反之亦然，但在任何情况下，由表1中所示的数字标识符指示的可变域(包括CDR)将保持相同。具有相同数字抗体名称但字母后缀N、B或P不同的抗体指具有CDR序列相同但在超出CDR序列范围的区中(即，在构架区中)具有序列变化的重链和轻链的抗体。因此，具体抗体的N、B和P变异体在其重链和轻链可变区内具有相同CDR序列，但在其构架区内彼此不同。
表1
Figure BDA0002106228890000471
实例3.人类单克隆抗体与金黄色葡萄球菌溶血素A毒素的结合
为了确定本发明的抗体是否能够结合于溶血素A单体，通过ELISA来测试经纯化抗体(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2和H1H15420P2)。将MaxiSorp微量滴定板用每孔10μg/mL经纯化金黄色葡萄球菌溶血素A涂布过夜。将发明抗体和同型匹配的对照抗体的滴定液(在50μM-1pM范围内，1∶3连续稀释)添加到含毒素的孔中且在25℃下孵育一小时。将孔洗涤三次且然后与每孔100ng/mL抗人类HRP第二抗体一起在25℃下孵育一小时。然后添加100μL的SuperSignal ELISA Pico化学发光受质(ThermoFisher Scientific)到各孔中且检测信号(Victor X3 plate reader，PerkinElmer)。通过三参数逻辑斯谛方程(three-parameter logistic equation)在12-点反应曲线(GraphPad Prism)上分析发光值。
关于结合于金黄色葡萄球菌溶血素A毒素对抗溶血素A抗体的亚奈摩尔EC50结合进行观察(表2和图1)。
表2：抗溶血素A mAb与金黄色葡萄球菌溶血素A的结合
AbPID 关于溶血素A结合的EC<sub>50</sub>[M]
H1H15375P 3.94E-10
H1H15376P 3.13E-10
H1H15377P 2.92E-10
H1H15378P 2.48E-10
H1H15379P 3.24E-10
H1H15380P 3.45E-10
H1H15381P 2.85E-10
H1H15399P 3.12E-10
H1H15404P 3.02E-10
H1H15405P 5.25E-10
H1H15408P 3.56E-10
H1H15410P 3.21E-10
H1H15414P 5.40E-10
H1H15418P2 3.58E-10
H1H15420P2 3.11E-10
同型对照 NB
NB，无结合
实例4.针对金黄色葡萄球菌溶血素A的人类mAb与双组分毒素的结合
金黄色葡萄球菌菌株可以产生额外成孔毒素：杀白细胞素和γ溶血素(Hlg)，其还需要寡聚化以形成功能孔隙。不同于溶血素A，杀白细胞素和Hlg是由2个亚单位组成的双组分毒素：S-亚单位和F-亚单位。当前，已识别出五种S亚单位(LukA、LukE、LukS-PV、HlgA和HlgC)和四种F亚单位(LukB、LukD、LukF-PV和HlgB)，产生五种功能毒素(LukAB、LukED、PVL、HlgAB和HlgCB)。虽然在S-亚单位和F-亚单位与溶血素A之间观察到低序列一致性(Aman MJ和Adhikaari RP，(2014)《毒素》6：950-972)，但所有组分显示与溶血素A的结构同源性。
为了确定本发明的抗溶血素A抗体是否交叉结合于其它毒素，通过ELISA测试了经纯化的抗体(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2和H1H15420P2)对金黄色葡萄球菌双组分毒素的交叉反应性。将MaxiSorp微量滴定板用每孔10μg/mL的金黄色葡萄球菌双组分毒素个别F-组分涂布过夜。重组毒素组分是获自IBT BioServices(Gaithersburg，MD)或由GenScript(Piscataway Township，NJ)生产。将发明抗体和同型匹配的对照抗体的滴定液(在50μM-100 pM范围内，1∶3稀释)添加到含毒素的孔中且在25℃下孵育1小时。将孔洗涤3次且然后与每孔100ng/mL抗人类HRP第二抗体一起在25℃下孵育一小时。添加100μL的SuperSignal ELISA Pico化学发光受质(ThermoFisher Scientific)到各孔中且检测信号(Victor X3 plate reader，PerkinElmer)。通过三参数逻辑斯谛方程在11-点反应曲线(GraphPad Prism)上分析发光值。包括同型匹配的不相关对照抗体和金黄色葡萄球菌δ毒素作为对照。
本发明中对15种抗体对双组分毒素的交叉反应性的测试公开一种mAb(H1H15381P)展示结合于F-组分LukF、LukD和HlgB，不过亲和力比在溶血素A情况下所见到的低2个对数或3个对数(表3和图2a-c)。当测试H1H15381P对S-组分LukS、LukE、HlgA和HlgC的交叉反应性时，结合亲和力与同F-组分的结合相比显著更低(图3a-c)。H1H15381P结合对溶血素A和双组分毒素来说是特异性的，因为其不显示与不展示任何与双组分毒素组分的结合的金黄色葡萄球菌δ毒素同型匹配对照抗体的结合。
表3：抗溶血素A mAb与金黄色葡萄球菌双组分毒素(仅F-组分)的结合
Figure BDA0002106228890000491
Figure BDA0002106228890000501
GS，GenScript；IBT，IBT BioServices；NB，无结合；-，未检出
实例5.在THP-1细胞毒性分析中金黄色葡萄球菌溶血素A的中和
使用人类单核细胞细胞株THP-1测试经纯化的mAb防止溶血素A介导的溶解的能力。将含于RPMI(补充有1％热灭活FBS、L-谷酰胺和非必需氨基酸)中的总共2.5×105个THP-1细胞接种到96-孔透明底-黑色经组织培养物处理的板中且在37℃加5％CO2下孵育1小时。将经纯化的抗体(H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2和H1H15420P2)或同型匹配对照抗体的滴定液(在范围内10-0μM，于培养基中1∶3连续稀释)与10nM经纯化的溶血素A一起在96孔板中在25℃下在振荡器上孵育30分钟，然后添加到涂布的细胞中。还将不含抗体的经纯化溶血素A的滴定液(1.5-0μM，1∶3稀释)单独与细胞一起孵育。
然后将含有毒素：抗体或单独毒素的细胞孵育三小时(37℃，5％CO2)，且使用CytoTox-Glo分析套组(Promega)测量细胞死亡。使用读板仪(Victor X3，Perkin Elmer)检测发光。本发明的所有抗体对溶血素A展示类似中和活性，而同型匹配的抗体不对溶血素A展示任何中和活性。参见表4。
表4：在THP-1细胞毒性分析中金黄色葡萄球菌溶血素A的中和
Figure BDA0002106228890000502
Figure BDA0002106228890000511
实例6.使用兔RBC溶血分析来进行在培养物上清液中金黄色葡萄球菌溶血素A的中和
使用兔红血球(rRBC)评估使用金黄色葡萄球菌培养物上清液的经纯化mAb的溶血素A中和性能。通过在37℃下将金黄色葡萄球菌菌株(American Type CultureCollection，Manassas，VA)在TSB中孵育16h(在振荡下)来获得培养物上清液，通过离心去除细菌且过滤含毒素培养基。将经纯化的抗体H1H15399P或同型匹配对照抗体的滴定液(在10-0μM范围内，于1X PBS中1∶2连续稀释)与经无菌过滤的金黄色葡萄球菌培养物上清液(其将产生≥80％细胞溶解)在96孔板中在25℃下在振荡器上一起孵育30分钟。在30分钟孵育之后，100μl的培养物上清液：mAb混合物在1x PBS中添加到含有100μl的4％rRBC的96孔圆底板中(Colorado Serum Company，Denver，CO)。在37℃下孵育1h之后，将板离心5min，将100μl的上清液轻轻移到新的微量滴定板，且使用读板仪(SpectraMax i3x，MolecularDevices)读取发光。本发明的所有抗体对溶血素A展示类似中和活性，而同型匹配的抗体不对溶血素A展示任何中和活性。参见表5。
表5：用抗溶血素A mAb H1H15399抑制天然金黄色葡萄球菌溶血素A
Figure BDA0002106228890000512
Figure BDA0002106228890000521
*MRSA252在其溶血素A序列中含有终止密码子，从而导致不分泌溶血素A蛋白质。
实例7.人类抗溶血素A单克隆抗体的Biacore结合亲和力和动力学常数
在Biacore T200仪器上使用即时表面等离子共振生物传感器分析测定野生型和突变体(Hla-H35L)溶血素A结合于经纯化抗溶血素A抗体的结合缔合和解离速率常数(分别是ka和kd)、平衡解离常数和解离半衰期(分别是KD和t1/2)。Biacore传感器表面经衍生化具有单克隆选殖小鼠抗人类Fc抗体(BR-1008-39，GE Healthcare)以捕获约150-360RU的经表达具有人类Fc的抗溶血素A单克隆抗体。在Biacore T200上在抗溶血素A单克隆抗体捕获表面上以50μL/min的流速注射在100nM到1.56nM范围内的不同浓度的溶血素A毒素。用HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)作为操作缓冲液监测溶血素A毒素在25℃和37℃下与所捕获的单克隆抗体的结合4分钟且监测自抗体的解离10分钟。
通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件对数据进行处理并拟合到1∶1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。然后由动力学速率常数如下计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka，且t1/2(min)＝[ln2/(60*kd)]。
野生型溶血素A和突变体溶血素A与不同抗溶血素A单克隆抗体在25℃和37℃下的结合的结合动力学参数在表6-9中列出。如表6中所示，在25℃下，本发明的所有抗溶血素A抗体以在171pM至26.2nM范围内的KD值结合于野生型溶血素A。如表7中所示，在37℃下，本发明的所有抗溶血素A抗体以在260pM至76.3nM范围内的KD值结合于溶血素A。如表8中所示，在25℃下，本发明的所有抗溶血素A抗体以在52.3pM至8.89nM范围内的KD值结合于突变体溶血素A。如表9中所示，在37℃下，本发明的所有抗溶血素A抗体以在74.7pM至18.7nM范围内的KD值结合于突变体溶血素A。
表6：抗溶血素A单克隆抗体在25℃下结合于野生型溶血素A的结合动力学参数
Figure BDA0002106228890000531
表7：抗溶血素A单克隆抗体在37℃下结合于野生型溶血素A的结合动力学参数
Figure BDA0002106228890000532
Figure BDA0002106228890000541
表8：抗溶血素A单克隆抗体在25℃下结合于突变体溶血素A的结合动力学参数
Figure BDA0002106228890000542
*NB表明在实验条件下，溶血素A毒素不结合于所捕获的抗溶血素A单克隆抗体。
表9：抗溶血素A单克隆抗体在37℃下结合于突变体溶血素A的结合动力学参数
Figure BDA0002106228890000543
Figure BDA0002106228890000551
*NB表明在实验条件下，溶血素A毒素不结合于所捕获的抗溶血素A单克隆抗体。
实例8.抗溶血素A mAb阻断活性的机制
为了确定溶血素A mAb是否通过阻断毒素与其特异性受体ADAM10的相互作用而发挥其功能，使用与溶血素A一起孵育的A549细胞使用荧光肽受质分析来测量宿主细胞相关金属蛋白酶活性。将溶血素A mAb(H1H15377P、H1H15381P和H1H15399P)的滴定液与3nM经纯化的溶血素A一起在37℃下预孵育15min，然后在汉姆氏F-12K(Ham′s F-12K)(补充有10％热灭活FBS和L-谷酰胺)中添加到含有2.5×104个A549细胞的96孔板中。在37℃下孵育60min之后，添加5μM荧光肽受质(Mca-PLAVQ-Dpa-RSSSR-NH2，R&D Systems，Minneapolis，MN)，在37℃下孵育15min且使用读板仪(激发过滤器是320nm且发射过滤器405nm，SpectraMax i3x，Molecular Devices)读取荧光强度且以相对荧光单位表示。本发明的抗体阻断毒素诱导的ADAM10活性增加，而同型匹配的抗体不展示对毒素诱导的ADAM10活性增加的任何影响(图4a)。这表明本发明的抗体阻断溶血素A与其受体的相互作用。
为了进一步证实溶血素A mAb阻止毒素结合于宿主细胞膜，在存在溶血素A mAb的情况下使用兔RBC(rRBC)进行膜结合实验，且通过蛋白质印记分析(Western blotanalysis)检测毒素与rRBC膜的缔合。为了避免rRBC溶解，在4℃下进行结合实验。将溶血素A mAb(H1H15377P和H1H15399P)的滴定液与10nM溶血素A在37℃下预孵育15min，然后添加到经洗涤的rRBC(10％，于250μl PBS中)中且在4℃下孵育60min。使rRBC形成团块，去除上清液且通过再悬浮于1ml的ddH2O中，在25℃下孵育10min且以16,100×g离心的三次循环来溶解细胞。将膜溶解于10mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1％Triton X-100和1％脱氧胆酸钠中。将溶解的样品还原，煮沸且在转移到PVDF膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)的4-12％SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分离，且用pAb(IBT BioServices，Rockville，MD)检测溶血素A单体。本发明的抗体阻止溶血素A结合于rRBC膜，而同型匹配的抗体不展示任何作用(图4b)。
实例9.在皮肤坏死小鼠模型中预防性给予的人类抗溶血素A mAb的活体内功效
为了确定本发明的抗溶血素A mAb是否能够减轻或预防金黄色葡萄球菌诱导的皮肤病变，使用雌性BALB/c小鼠(n＝3-5)在活体内皮肤坏死模型中对经纯化的抗体进行预防性测试(Bubeck Wardenburg等人，(2008)《传染病杂志(J.Infect.Dis.)》198：1166-1170)。在感染之前两天，通过剃毛和施加毛发去除洗剂从腹部区域将毛去除。在感染之前一天，在腹部左侧向小鼠腹膜内注射5mg/kg或0.5mg/kg的单一剂量的各个别抗体：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2、H1H15420P2或同型匹配对照抗体。在感染当天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(每个小鼠约1-2×108个CFU)在腹部右侧对小鼠进行皮下激发。在感染后第2天用数位卡尺测量小鼠病变。
本发明的所有抗体在两种所测试剂量下均是有效的。当以5mg/kg给予时，所有抗体显示类似功效，当与同型匹配对照抗体相比时使皮肤坏死病变减少80-90％(表10)。类似地，当与用同型匹配抗体治疗的动物相比时，当以0.5mg/kg给予动物时，本发明的所有抗体(除H1H15410P外)显示病变尺寸减小(表10)。然而，病变尺寸减小在40-80％范围内，H1H15410P在此剂量下显示无效。当以0.5mg/kg给予时抗体H1H15380P、H1H15381P、H1H15405P和H1H15414P最有效，病变尺寸减小＞80％。5mg/kg和0.5mg/kg组的比较显示剂量依赖性作用：与以0.5mg/kg剂量接受相同抗体的小鼠相比，以5mg/kg剂量接受抗体的小鼠具有较小病变。
表10：在感染后第2天，在预防性鼠皮肤坏死模型中抗溶血素A单克隆抗体的病变尺寸比较
Figure BDA0002106228890000571
为了进一步考查抗溶血素AmAb减小病变尺寸的能力，以三种不同剂量预防性给予mAb且与两种其它抗溶血素A mAb相比较：LTM14(参见例如美国专利第8715673号-SEQ IDNO：1和2；或Foletti等人，Mechanism ofAction and In Vivo Efficacy of a Human-Derived Antibody against Staphylococcus α-Hemolysin，《分子生物学杂志》425：1641-1654(2013))和LC10(参见例如WO2012/109285-SEQ ID NO：57和58)。在感染之前两天时如上文所描述从雌性BALB/c小鼠将毛去除。在感染之前一天，在腹部左侧向小鼠(n＝每组5个)腹膜内注射5mg/kg、0.5mg/kg或0.125mg/kg的单一剂量的各个别抗体：H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配对照抗体。在感染当天，在腹部右侧用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(MRSA菌株；每个小鼠2.5×108个CFU)或金黄色葡萄球菌Newman(MSSA菌株；每个小鼠2.5×108个CFU)对小鼠进行皮下激发。在感染后第2天用数位卡尺测量小鼠病变。
本发明的所有抗体在使用MRSA与MSSA金黄色葡萄球菌菌株的所有三种所测试剂量下均是有效的。当以5mg/kg给予时，所有抗体(包括LC10和LTM14)对金黄色葡萄球菌CA-127(图5a)与Newman(图6a)显示类似功效，当与同型匹配对照抗体相比时使病变减小≥85％。类似地，当以0.5mg/kg给予小鼠时，当与用同型匹配抗体治疗的小鼠相比时，所有抗体显示50-60％的类似病变尺寸减小(图5b和6b)。然而，与H1H15381P、LC10和LTM14相比在H1H15377P和H1H15399P情况下病变尺寸减小更大，与用同型匹配抗体治疗的小鼠相比，当使用金黄色葡萄球菌CA-127(图5c)与Newman(图6c)以0.125mg/kg给予时在30-40％范围内。对于所有抗体，5mg/kg、0.5mg/kg和0.125mg/kg组的比较显示剂量依赖性作用：以较高浓度接受抗体的小鼠具有较小病变(5mg/kg剂量病变＜0.5mg/kg剂量病变＜0.125mg/kg剂量病变)。
实例10.预防性给予抗溶血素A mAb的小鼠皮肤中的细菌计数
在皮肤坏死模型中测试本发明的三种经纯化抗体H1H15377P、H1H15381P和H1H15399P，以确定是否存在任何在用抗体预防性治疗的小鼠皮肤中观察到的细菌负荷的变化。还将本发明的抗体与两种其它抗溶血素A mAb(LC10和LTM14)相比较。在感染之前两天，通过剃毛和施加毛发去除洗剂从雌性BALB/c小鼠的腹部区域将毛去除。在感染之前一天，在腹部左侧向小鼠腹膜内注射5mg/kg的单一剂量的各个别抗体：H1H15377P、H1H15381P和H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配对照抗体。在感染当天，在腹部右侧用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(MRSA菌株；每个小鼠2.5×108个CFU)或Newman(MSSA菌株；每个小鼠2.9×108个CFU)对小鼠(n＝每组5个)进行皮下激发。在感染后2天时通过麻醉将小鼠安乐死，使用8-mm皮肤活检穿孔器切去病变区域(和周围皮肤)并均质化。将皮肤溶解产物的连续稀释液涂布于TSA板上。将板在37℃下孵育过夜(16-18小时)且在测定细菌负荷的次日对细菌菌落进行计数。
抗体H1H15377P和H1H15399P使感染金黄色葡萄球菌CA-127(图7a)与Newman(图7b)的小鼠皮肤中的细菌负荷降低；具体地说，与关于用同型匹配对照抗体治疗的动物所测定的细菌负荷水平相比，5mg/kg的任一抗体产生1-1.5个对数的皮肤细菌负荷降低。相同剂量的H1H15381P、LTM14或LC10产生0-0.5个对数的皮肤细菌负荷降低。结果表明H1H15377P和H1H15399P在降低感染小鼠皮肤中的细菌负荷方面最有效。
实例11.治疗性给予的抗溶血素A mAb的活体内功效
为了确定如果在感染的后给予本发明中的mAb是否也可以减小病变尺寸，在活体内皮肤坏死模型中使用雌性BALB/c小鼠(n＝5)对经纯化抗体进行治疗性测试。在感染之前两天，通过剃毛和施加毛发去除洗剂从腹部区域将毛去除。在感染当天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(每个小鼠约1-2×108个CFU)在腹部右侧对小鼠进行皮下激发。在感染之后两小时，在腹部左侧向小鼠腹膜内注射0.5mg/kg的单一剂量的各个别抗体：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15404P、H1H15405P、H1H15408P、H1H15410P、H1H15414P、H1H15418P2、H1H15420P2或同型匹配对照抗体。在感染后第2天用数位卡尺测量小鼠病变。
当感染之后两小时时以0.5mg/kg给予动物时，本发明的所有抗体有效减小病变尺寸(表11)。皮肤坏死病变尺寸减小在50-83％范围内。抗体中有八个(H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15399P、H1H15418P2和H1H15420P2)显示＞70％的病变尺寸减小。
表11：在感染后第2天，在治疗性鼠皮肤坏死模型中抗溶血素A单克隆抗体的病变尺寸比较
Figure BDA0002106228890000601
实例12.在使用甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株的急性肺炎模型中抗溶血素A mAb的活体内功效
以5mg/kg预防性给予抗体的小鼠的存活率.为了确定当预防性给予时mAb对MSSA菌株的功效，在使用金黄色葡萄球菌Newman的急性肺炎模型中选择以下抗体进行研究：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P和H1H15414P(自BubeckWardenburg等人，(2007)Infect.Immun.75：1040-1044修改)。向雌性C57BL/6小鼠(n＝5)腹膜内注射5mg/kg的单一剂量的H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配对照抗体。在mAb注射后一天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌Newman(每个小鼠1.7×108个CFU)对小鼠进行气管内激发。在感染后监测小鼠的存活率总共六天。
如表12所示，给予抗体H1H15375P、H1H15376P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P产生100％存活率。给予H1H15377P到第6天时产生80％存活率。当在急性肺炎感染模型中以5mg/kg预防性给予时，本发明的所有抗体均使感染金黄色葡萄球菌MSSA菌株的小鼠的存活率增加。
表12：在使用MSSA菌株的急性肺炎模型中预防性给予5mg/kg抗溶血素A单克隆抗体的小鼠的存活率
Figure BDA0002106228890000611
Figure BDA0002106228890000621
以2.5mg/kg预防性给予抗体的小鼠的存活率.为了确定在针对MSSA菌株的急性肺炎模型中在较低剂量下抗体是否也将有效，向C57BL/6雌性小鼠(n＝5)腹膜内注射2.5mg/kg的单一剂量的H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配抗体。在mAb注射后一天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌Newman(每个小鼠7.5×107个CFU)对小鼠进行气管内激发。在感染后监测小鼠的存活率总共六天。
如表12所示，给予抗体H1H15376P、H1H15377P、H1H15379P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P至第6天时产生100％存活率，而给予抗体H1H15378P或H1H15380P产生80％存活率。抗体H1H15375P当与其它抗体相比时不太有效，仅提供60％保护作用(表13)。
结果表明在使用金黄色葡萄球菌MSSA菌株的鼠急性肺炎模型中，即使当以较低剂量给予mAb时，抗体H1H15375P、H1H15376P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P和H1H15377P也有效降低溶血素A的细胞毒性作用且增加存活率。
表13：在使用MSSA菌株的急性肺炎模型中预防性给予2.5mg/kg抗溶血素A单克隆抗体的小鼠的存活率
Figure BDA0002106228890000622
Figure BDA0002106228890000631
实例13.在使用甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的急性肺炎模型中抗溶血素AmAb的活体内功效
以5mg/kg预防性给予抗体的小鼠的存活率.为了确定mAb对MRSA菌株的功效，在使用金黄色葡萄球菌CA-127的预防性急性肺炎模型中选择以下抗体进行研究：H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P和H1H15414P。向雌性C57BL/6小鼠(n＝5)腹膜内注射5mg/kg的单一剂量的H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配对照抗体。在mAb注射后一天，用50μl含有已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的2.2×108个CFU(低接种体)或4.8×108个CFU(高接种体)的金黄色葡萄球菌CA-127对小鼠进行气管内激发。在感染后监测小鼠的存活率总共六天。
当用低接种体对小鼠进行激发时，九种发明抗体中有八个显示功效。具体地说，抗体H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P和H1H15399P同等有效，到第6天时产生100％存活率(表14)。给予抗体H1H15414P产生80％存活率。H1H15376P不展示保护作用，因为接受这一抗体的小鼠到第6天时不存活。到第6天时用同型匹配抗体治疗的动物无一存活(表13)。
在较高接种体下，在本发明抗体之间的功效中观察到更大的区别。如表13所示，抗体H1H15377P和H1H15399P在所测试的抗体中是最有效的，到第6天时产生100％存活率。给予抗体H1H15414P、H1H15378P、H1H15379P和H1H15381P到第6天时产生60％存活率，而用同型匹配对照抗体治疗的组中的动物到第6天时无一存活。抗体H1H15375P、H1H15376P和H1H15380P与所测试的其它发明抗体相比具有较低功效，到第6天时分别产生20％、0％或40％存活率(表13)。
结果表明当在感染金黄色葡萄球菌MRSA菌株的较低接种体的急性肺炎模型中以5mg/kg预防性给予时，H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P和H1H15414P有效降低溶血素A的细胞毒性作用且增加存活率。当这一模型中使用金黄色葡萄球菌MRSA菌株的较高接种体时，两种抗体H1H15377P和H1H15399P也100％有效。
表14：在使用MRSA菌株的急性肺炎模型中预防性给予5mg/kg抗溶血素A单克隆抗体的小鼠的存活率
Figure BDA0002106228890000641
以2.5mg/kg预防性给予抗体的小鼠的存活率.为了确定在针对MRSA菌株的急性肺炎模型中在较低剂量下抗体是否也将有效，向C57BL/6雌性小鼠(n＝5)腹膜内注射2.5mg/kg的单一剂量的H1H15375P、H1H15376P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P、H1H15414P或同型匹配对照抗体。在mAb注射后一天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(每个小鼠3.0×108个CFU)对小鼠进行气管内激发。在感染后监测小鼠的存活率总共六天。
所测试的所有发明抗体(H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P或H1H15414P)同等有效，到第6天时产生100％存活率，而用同型匹配对照抗体治疗的组中的动物到第6天无一存活(表15)。结果表明当在感染金黄色葡萄球菌MRSA菌株的急性肺炎模型中以2.5mg/kg预防性给予时，H1H15375P、H1H15377P、H1H15378P、H1H15379P、H1H15380P、H1H15381P、H1H15399P和H1H15414P有效降低溶血素A的细胞毒性作用且增加存活率。
表15：在使用MRSA菌株的急性肺炎模型中预防性给予2.5mg/kg抗溶血素A单克隆抗体的小鼠的存活率
Figure BDA0002106228890000651
预防性给予H1H15399P和H1H15376P的小鼠肺脏中的细菌计数.在急性肺炎研究中测试本发明的两种经纯化抗体H1H15399P和H1H15376P，以确定是否存在任何在用抗体预防性治疗的小鼠肺脏中观察到的细菌负荷变化。向各组雌性C57BL/6小鼠(n＝5)腹膜内注射三个剂量中的一个的H1H15399P、单一剂量的H1H15376P或同型匹配对照抗体(5mg/kg)。在mAb注射后一天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(每个小鼠1.6×108个CFU)对小鼠进行气管内激发。在感染后18小时时通过麻醉将小鼠安乐死且提取肺脏并均质化。将肺脏溶解产物的连续稀释液涂布于TSA板上。将板在37℃下孵育过夜(16-18小时)且在测定细菌负荷的次日对细菌菌落进行计数。
抗体H1H15399P降低感染小鼠肺脏中的细菌负荷(表16)；具体地说，与关于用同型匹配对照抗体治疗的动物所测定的细菌负荷水平相比，所测试的所有三个剂量的H1H15399P产生1到1.5个对数的肺脏细菌负荷降低。此外，这种肺脏细菌负荷降低是剂量依赖性的。抗体H1H15376P在这一模型中不展示任何功效，显示肺脏细菌肺脏负荷类似于同型匹配抗体。结果表明H1H15399P能够降低感染小鼠肺脏中的细菌负荷。
表16：在使用MRSA菌株的急性肺炎模型中预防性给予抗溶血素A单克隆抗体H1H15399P和H1H15376P的小鼠的肺脏中的细菌计数
Figure BDA0002106228890000661
为了进一步考查抗溶血素A mAb降低肺脏中的细菌负荷的能力，以两种不同剂量预防性给予已证实增加存活率的三种mAb(H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P)且与两种其它抗溶血素A mAb(LC10和LTM14)相比较。向各组雌性C57BL/6小鼠(n＝5)腹膜内注射1.25mg/kg或0.325mg/kg的单一剂量的各个别抗体：H1H15377P、H1H15381P、H1H15399P、LTM14、LC10或同型匹配对照抗体。在mAb注射后一天，用50μl的已在TSB中在37℃下生长到对数期(OD600≤1)、经洗涤并再悬浮于PBS中的金黄色葡萄球菌CA-127(每个小鼠1.3×108个CFU)对小鼠进行气管内激发。在感染后18小时时通过麻醉将小鼠安乐死且提取肺脏并均质化。将肺脏溶解产物的连续稀释液涂布于TSA板上。将板在37℃下孵育过夜(16-18小时)且在测定细菌负荷的次日对细菌菌落进行计数。
与LTM14、LC10和同型匹配对照抗体相比，当以1.25mg/kg给予时所测试的本发明的所有三种抗体均是有效的，使肺脏中的细菌负荷降低1个对数(图8a)。当以0.325mg/kg给予时H1H15399P也有效降低细菌负荷(图8b)。所测试的所有其它溶血素A mAb在此较低剂量下不显著减少小鼠肺脏中的细菌(图8b)。
实例14.使用预复合方式得到的不同抗溶血素A单克隆抗体之间的Octet交叉竞争
为了评估两种抗体是否彼此竞争结合溶血素A(自金黄色葡萄球菌纯化)上的表位，在Octet RED384生物传感器(Pall ForteBio Corp.)上使用即时、不含标记生物层干涉术分析测定抗溶血素A单克隆抗体之间的结合竞争。在25℃下在0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v吐温-20(Tween-20)、1.0mg/mL BSA(Octet HBS-ET缓冲液)中在以1000rpm的速度振荡板的同时进行整个实验。首先通过将Octet生物传感器端部(Pall ForteBio Corp.，#18-5060)浸入含有抗溶血素A单克隆抗体(mAb-1)的50μg/mL溶液的孔中两分钟来将约1.5-2.5nm的抗溶血素A单克隆抗体捕获到抗hFc抗体涂布的端部上。然后通过浸入含有阻断性mAb的100μg/mL溶液的孔中三分钟来将捕获了抗体的生物传感器端部用阻断性H4H同型对照单克隆抗体(阻断性mAb)饱和。然后，随后将生物传感器端部浸入含有先前与1μM的第二抗溶血素A单克隆抗体(mAb-2)一起孵育2小时的100nM溶血素A的孔中四分钟。在每个实验步骤之间在Octet HBS-ET缓冲液中洗涤生物传感器端部。在实验过程期间监测即时结合反应且在每个步骤结束时记录结合反应。针对背景结合对预复合了mAb-2的溶血素A结合于mAb-1的反应进行校正，比较且确定不同抗溶血素A单克隆抗体的竞争性/非竞争性性质。表17明确定义了在两个方向上竞争的抗体的关系，不管结合顺序如何。
表17：抗溶血素A抗体结合于溶血素A的交叉竞争
Figure BDA0002106228890000681
Figure BDA0002106228890000691
本发明的范围不受本文所描述的具体实施例限制。实际上，除本文所描述的以外，由前述描述和附图，本发明的各种修改型式将对所属领域的技术人员来说变得显而易见。这类修饰旨在属于随附权利要求书的范围内。
Figure IDA0002106228940000011
Figure IDA0002106228940000021
Figure IDA0002106228940000031
Figure IDA0002106228940000041
Figure IDA0002106228940000051
Figure IDA0002106228940000061
Figure IDA0002106228940000071
Figure IDA0002106228940000081
Figure IDA0002106228940000091
Figure IDA0002106228940000101
Figure IDA0002106228940000111
Figure IDA0002106228940000121
Figure IDA0002106228940000131
Figure IDA0002106228940000141
Figure IDA0002106228940000151
Figure IDA0002106228940000161
Figure IDA0002106228940000171
Figure IDA0002106228940000181
Figure IDA0002106228940000191
Figure IDA0002106228940000201
Figure IDA0002106228940000211
Figure IDA0002106228940000221
Figure IDA0002106228940000231
Figure IDA0002106228940000241
Figure IDA0002106228940000251
Figure IDA0002106228940000261
Figure IDA0002106228940000271
Figure IDA0002106228940000281
Figure IDA0002106228940000291
Figure IDA0002106228940000301
Figure IDA0002106228940000311
Figure IDA0002106228940000321
Figure IDA0002106228940000331
Figure IDA0002106228940000341
Figure IDA0002106228940000351
Figure IDA0002106228940000361
Figure IDA0002106228940000371
Figure IDA0002106228940000381
Figure IDA0002106228940000391
Figure IDA0002106228940000401
Figure IDA0002106228940000411
Figure IDA0002106228940000421
Figure IDA0002106228940000431
Figure IDA0002106228940000441
Figure IDA0002106228940000451
Figure IDA0002106228940000461
Figure IDA0002106228940000471
Figure IDA0002106228940000481
Figure IDA0002106228940000491
Figure IDA0002106228940000501
Figure IDA0002106228940000511
Figure IDA0002106228940000521
Figure IDA0002106228940000531
Figure IDA0002106228940000541
Figure IDA0002106228940000551
Figure IDA0002106228940000561
Figure IDA0002106228940000571
Figure IDA0002106228940000581
Figure IDA0002106228940000591
Figure IDA0002106228940000601
Figure IDA0002106228940000611
Figure IDA0002106228940000621
Figure IDA0002106228940000631
Figure IDA0002106228940000641
Figure IDA0002106228940000651
Figure IDA0002106228940000661
Figure IDA0002106228940000671
Figure IDA0002106228940000681
Figure IDA0002106228940000691
Figure IDA0002106228940000701
Figure IDA0002106228940000711
Figure IDA0002106228940000721
Figure IDA0002106228940000731
Figure IDA0002106228940000741
Figure IDA0002106228940000751
Figure IDA0002106228940000761
Figure IDA0002106228940000771
Figure IDA0002106228940000781
Figure IDA0002106228940000791
Figure IDA0002106228940000801
Figure IDA0002106228940000811
Figure IDA0002106228940000821
Figure IDA0002106228940000831
Figure IDA0002106228940000841
Figure IDA0002106228940000851
Figure IDA0002106228940000861
Figure IDA0002106228940000871
Figure IDA0002106228940000881
Figure IDA0002106228940000891
Figure IDA0002106228940000901
Figure IDA0002106228940000911
Figure IDA0002106228940000921
Figure IDA0002106228940000931
Figure IDA0002106228940000941
Figure IDA0002106228940000951
Figure IDA0002106228940000961
Figure IDA0002106228940000971
Figure IDA0002106228940000981
Figure IDA0002106228940000991
Figure IDA0002106228940001001
Figure IDA0002106228940001011
Figure IDA0002106228940001021
Figure IDA0002106228940001031
Figure IDA0002106228940001041
Figure IDA0002106228940001051
Figure IDA0002106228940001061
Figure IDA0002106228940001071

Claims (18)

1.一种经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于溶血素A，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)序列中所含有的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)；和轻链可变区(LCVR)序列中所含有的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别由SEQ ID NO:144、146、148、152、154和156的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR由SEQ ID NO:142的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR由SEQ ID NO:150的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)HCVR，其由SEQ ID NO:142的氨基酸序列组成；和(b)LCVR，其由SEQ IDNO:150的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
免疫球蛋白轻链，其由SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列组成，和
免疫球蛋白重链，其由SEQ ID NO:158中所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段或单链Fv(scFv)分子。
7.一种制备根据权利要求1至6中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(i)将编码所述抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和所述抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链的一个或多个聚核苷酸引入宿主细胞中；和
(ii)在生长培养基中在有利于所述聚核苷酸表达的条件下培养所述宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其还包括：从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞在其中生长的培养基分离出所述抗体或其抗原结合片段。
9.一种经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其是根据权利要求8所述的方法的产物。
10.一种注射装置或容器，其包含根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段。
11.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，和医药学上可接受的载剂或稀释剂。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其还包含一种或多种额外治疗剂。
13.根据权利要求12所述的医药组合物，其中所述一种或多种额外治疗剂是抗生素、NSAID、皮质类固醇和/或LC10抗体。
14.根据权利要求13所述的医药组合物，其中所述皮质类固醇是普赖松。
15.根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其用于治疗患有金黄色葡萄球菌感染的患者。
16.一种包含一种或多种根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段的组合物，其用于治疗金黄色葡萄球菌感染。
17.一种根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用以治疗患有金黄色葡萄球菌感染的患者的药剂。
18.一种根据权利要求1至6和9中任一项所述的经分离的人类抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段展现一种或多种选自由以下组成的组的特性：
(a)通过表面等离子共振所测量，在37℃下以小于80nM的结合解离平衡常数(KD)结合于野生型溶血素A；
(b)通过表面等离子共振所测量，在37℃下以大于0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合于野生型溶血素A；
(c)通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于30nM的KD结合于野生型溶血素A；
(d)通过表面等离子共振所测量，在25℃下以大于1.5分钟的t1/2结合于野生型溶血素A；
(e)通过表面等离子共振所测量，在37℃下以小于20nM的结合解离平衡常数(KD)结合于经修饰的溶血素A；
(f)通过表面等离子共振所测量，在37℃下以大于0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合于经修饰的溶血素A；
(g)通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于10nM的KD结合于经修饰的溶血素A；
(h)通过表面等离子共振所测量，在25℃下以大于1.5分钟的t1/2结合于经修饰的溶血素A；
(i)通过选自由以下组成的组的金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株来抑制溶血素A介导的兔红血球溶血；所述金黄色葡萄球菌菌株名称为：GA201；CA-127；TCH1516；GA229；8-03；27-05；94:1013；和7031；以及
(j)阻断溶血素A与ADAM10之间的相互作用。
CN201880005378.7A 2017-01-03 2018-01-02 针对金黄色葡萄球菌溶血素a毒素的人类抗体 Active CN110167960B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762441786P 2017-01-03 2017-01-03
US62/441,786 2017-01-03
PCT/US2018/012044 WO2018128973A1 (en) 2017-01-03 2018-01-02 Human antibodies to s. aureus hemolysin a toxin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110167960A CN110167960A (zh) 2019-08-23
CN110167960B true CN110167960B (zh) 2023-01-13

Family

ID=61054509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880005378.7A Active CN110167960B (zh) 2017-01-03 2018-01-02 针对金黄色葡萄球菌溶血素a毒素的人类抗体

Country Status (18)

Country Link
US (3) US10463748B2 (zh)
EP (1) EP3565835A1 (zh)
JP (2) JP2020504759A (zh)
KR (1) KR20190101435A (zh)
CN (1) CN110167960B (zh)
AR (1) AR110719A1 (zh)
AU (1) AU2018206531A1 (zh)
BR (1) BR112019013375A2 (zh)
CA (1) CA3048989A1 (zh)
CL (1) CL2019001836A1 (zh)
CO (1) CO2019006902A2 (zh)
EA (1) EA201991643A1 (zh)
IL (1) IL267600A (zh)
MA (1) MA47202A (zh)
MX (1) MX2019007784A (zh)
PH (1) PH12019501425A1 (zh)
TW (2) TW202311284A (zh)
WO (1) WO2018128973A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202311284A (zh) 2017-01-03 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
WO2020106461A2 (en) * 2018-11-08 2020-05-28 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-mertk antibodies and methods of use thereof
CN109400704B (zh) * 2018-11-14 2020-07-21 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
AU2019384790A1 (en) * 2018-11-21 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-staphylococcus antibodies and uses thereof
MA56205A (fr) 2019-06-11 2022-04-20 Regeneron Pharma Anticorps anti-pcrv qui se lient à pcrv, compositions comprenant des anticorps anti-pcrv, et leurs méthodes d'utilisation
CN112538112B (zh) * 2019-09-20 2023-10-27 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗α-溶血素的抗体及其应用
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CN113444172A (zh) 2020-03-25 2021-09-28 兴盟生物医药(苏州)有限公司 金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用
EP4286409A1 (en) * 2021-01-11 2023-12-06 Starmab Biologics (Suzhou) Co., Ltd Antigen-binding protein targeting staphylococcus aureus ?-hemolysis and application thereof
CN117062833A (zh) * 2021-03-22 2023-11-14 星济生物(苏州)有限公司 靶向肺炎链球菌溶血素的抗原结合蛋白及其用途
CN115894674B (zh) * 2022-12-20 2023-07-25 厦门润康源生物科技有限公司 一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用
CN116789814B (zh) * 2023-06-27 2024-03-29 重庆原伦生物科技有限公司 一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103443285A (zh) * 2011-02-08 2013-12-11 米迪缪尼有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2437213A1 (fr) 1978-09-28 1980-04-25 Cm Ind Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation
GB8426463D0 (en) 1984-10-19 1984-11-28 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
JP2003503015A (ja) 1999-05-03 2003-01-28 メダレツクス・インコーポレーテツド スタフィロコッカス・アウレウスに対するヒト抗体
US6573096B1 (en) 2000-04-01 2003-06-03 The Research Foundation At State University Of New York Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US8257740B1 (en) 2011-08-15 2012-09-04 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
US7411046B2 (en) 2005-08-02 2008-08-12 Arius Research Inc Cancerous disease modifying antibodies
US8258256B2 (en) 2006-01-05 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the treatment of cancer
US7420040B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
CN102585002A (zh) 2006-06-02 2012-07-18 瑞泽恩制药公司 人il-6受体的高亲和力抗体
US20180221466A9 (en) 2006-06-12 2018-08-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections
TW200744632A (en) * 2006-06-12 2007-12-16 Nabi Biopharmaceuticals Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections
EP2136788B1 (en) 2007-03-30 2011-10-26 Bind Biosciences, Inc. Cancer cell targeting using nanoparticles
US9181329B2 (en) 2007-08-31 2015-11-10 The University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against Staphylococcal lung diseases and conditions
US8840906B2 (en) 2007-08-31 2014-09-23 The University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against Staphylococcal lung disease and conditions
CN102089005A (zh) 2008-05-12 2011-06-08 斯特罗克斯生物制药有限责任公司 金黄色葡萄球菌特异性抗体制剂
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
EP2445936A1 (en) 2009-06-26 2012-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
EP2284193A1 (en) 2009-08-10 2011-02-16 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody against S. aureus derived apha-toxin and its use in treating or preventing abscess formation
CA2810030A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Excelimmune, Inc. Staphylococcus aureus specific human recombinant polyclonal antibodies and uses thereof
US20140286960A1 (en) 2011-07-28 2014-09-25 Cangene Corporation Staphlococcus aureus alpha-hemolysin antibodies
WO2013093693A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Rinat Neuroscience Corp. Staphylococcus aureus specific antibodies and uses thereof
CA2870223A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Arsanis Biosciences Gmbh Cross-reactive staphylococcus aureus antibody
KR20150092738A (ko) 2012-11-06 2015-08-13 메디뮨 엘엘씨 에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법
CA2925071A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Arsanis Biosciences Gmbh Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
TWI719938B (zh) 2014-06-19 2021-03-01 美商麥迪紐有限責任公司 多重細菌感染之治療
TWI702229B (zh) * 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
MX2017012775A (es) 2015-04-17 2019-04-29 Arsanis Biosciences Gmbh Preparacion combinatoria de anticuerpos anti-staphylococcus aureus.
TW202311284A (zh) 2017-01-03 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103443285A (zh) * 2011-02-08 2013-12-11 米迪缪尼有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mechanism of Action and In Vivo Efficacy of a Human-Derived Antibody against Staphylococcus aureus α-Hemolysin;Davide Foletti等;《Journal of Molecular Biology》;20130527;第425卷(第10期);第1641-1654页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10940211B2 (en) 2021-03-09
CA3048989A1 (en) 2018-07-12
US20200016275A1 (en) 2020-01-16
JP2023011710A (ja) 2023-01-24
PH12019501425A1 (en) 2020-06-15
AU2018206531A1 (en) 2019-07-25
CO2019006902A2 (es) 2019-07-31
EP3565835A1 (en) 2019-11-13
US11571482B2 (en) 2023-02-07
TW202311284A (zh) 2023-03-16
AR110719A1 (es) 2019-04-24
KR20190101435A (ko) 2019-08-30
EA201991643A1 (ru) 2020-01-20
MA47202A (fr) 2019-11-13
CL2019001836A1 (es) 2019-10-04
US10463748B2 (en) 2019-11-05
US20180214569A1 (en) 2018-08-02
US20210162059A1 (en) 2021-06-03
JP2020504759A (ja) 2020-02-13
WO2018128973A1 (en) 2018-07-12
TWI781130B (zh) 2022-10-21
BR112019013375A2 (pt) 2020-02-11
CN110167960A (zh) 2019-08-23
MX2019007784A (es) 2019-09-06
IL267600A (en) 2019-08-29
TW201837054A (zh) 2018-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110167960B (zh) 针对金黄色葡萄球菌溶血素a毒素的人类抗体
US20230192831A1 (en) Human Antibodies to GREM1
US20160264650A1 (en) Human antibodies to clostridium difficile toxins
US11655286B2 (en) Anti-PcrV antibodies that bind PcrV, compositions comprising anti-PcrV antibodies, and methods of use thereof
CN111148758B (zh) 结合葡萄球菌属靶抗原和补体成分的双特异性抗原结合分子及其用途
JP2022512904A (ja) 抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ抗体およびその使用
EP2964670B1 (en) Human antibodies to serum resistance-associated protein from trypanosoma brucei rhodesiense
EA041355B1 (ru) ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ТОКСИНУ ГЕМОЛИЗИНУ А S.aureus
NZ795857A (en) Human antibodies to S. aureus Hemolysin A toxin
AU2013203942B8 (en) Human antibodies to Clostridium difficile toxins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant