CN110167955A - 细菌抑制剂 - Google Patents

细菌抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110167955A
CN110167955A CN201780073956.6A CN201780073956A CN110167955A CN 110167955 A CN110167955 A CN 110167955A CN 201780073956 A CN201780073956 A CN 201780073956A CN 110167955 A CN110167955 A CN 110167955A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
porphyromonas gingivalis
pharmaceutical composition
seq
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780073956.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110167955B (zh
Inventor
H.谢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meharry Medical College
Original Assignee
Meharry Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meharry Medical College filed Critical Meharry Medical College
Publication of CN110167955A publication Critical patent/CN110167955A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110167955B publication Critical patent/CN110167955B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03006—Arginine deiminase (3.5.3.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03015—Protein-arginine deiminase (3.5.3.15)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

提供了与来自细菌嵴链球菌的精氨酸脱亚胺酶的某些部分相关的肽，其破坏含有口腔病原体牙龈卟啉单胞菌的生物膜的形成和组成，并且还调节牙龈卟啉单胞菌的毒力。公开了含有此类肽的药物组合物及其使用方法。

Description

细菌抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请引用2016年9月29日提交的美国临时专利申请号62/401,572(在审)和2016年10月5日提交的美国临时专利申请号62/404,690(在审)的优先权。两件申请的内容通过引用以其整体并入。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在NIDCR授予的拨款号DE022428、DE014699、DE025332、DE012505和DE023193下且在NCRR授予的拨款号RR024975(现在由NCATS作为拨款号TR000445介导)下的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
在该上下文下，“政府”是指美利坚合众国政府。
背景
A. 公开领域
本公开总体涉及微生物介导的疾病的治疗和预防措施。提供了此类治疗和措施以及与其一起使用的方法。
B. 背景
牙周炎是成年期最广泛的传染病之一，其中估计全世界人口的5-20%患有全身性慢性牙周炎。除了对口腔健康的直接影响之外，牙周炎和一些严重的慢性疾病诸如冠心病和糖尿病之间存在关联。慢性牙周炎是牙周组织-微生物内稳态崩溃的结果，其然后导致不受控制的炎症。在口腔中可以检测到一千种细菌物种，并且在任何一个个体中可以存在约200种细菌物种。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)似乎是一种基础病原体，并在激发牙周炎的微生物群的发展中发挥重要作用。牙龈卟啉单胞菌，尽管是低丰度的生物膜物种，但已被视为显著改变小鼠口腔微生物群(包括链球菌属种)中共生细菌的组成。牙龈卟啉单胞菌通过早期的定殖者(例如口腔链球菌)募集至微生物群落中。尽管没有早期的定植者与牙周炎有关的直接证据，但这些生物中的一些可以为牙周病原体提供底层和代谢支持。值得注意的是，已经在体外和体内证明了共聚集或共粘附对于牙菌斑生物膜的发展的重要性。早期和后期牙菌斑定植者的充分研究的相互作用是格氏链球菌和牙龈卟啉单胞菌的共粘附。研究已显示，多组粘附素参与该过程。因此，这些特异性的蛋白-蛋白相互作用可能促进牙龈卟啉单胞菌在由格氏链球菌和相关的口腔链球菌组成的现有生物膜上定殖。
尽管不太理解，但也报道了口服细菌之间的拮抗关系。例如，牙龈卟啉单胞菌既不会在两种物种生物膜中与口腔链球菌一起生长，也不会与变形链球菌共聚集。
牙周炎由生物膜而不是浮游状态的细菌引起；因此，牙菌斑中牙龈卟啉单胞菌的定植是牙周炎起始中的关键步骤。事实上，大多数牙龈卟啉单胞菌临床分离株都是有菌毛的，尤其是当在牙周袋底部分离时。由FimA构成的主要菌毛(长菌毛)是一种充分研究的毒力因子，其有助于定植、生物膜形成、细胞侵袭、骨吸收和逃避宿主防御系统。研究已显示，由牙龈卟啉单胞菌菌毛(FimA)引发的宿主免疫反应通过识别Toll样受体2并与其相互作用、随后活化MyD88依赖性抗微生物途径、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)依赖性亲粘附途径、β2-整联蛋白补体受体3(CR3)和/或TNF-α产生来起始。
牙周炎的治疗通常包括手术和非手术机械疗法，有时通过全身或局部施用抗生素来补充，特别是在严重和难治性牙周炎的治疗中。似乎抗生素的辅助使用可以改善机械疗法的结果。然而，荟萃分析表明抗生素治疗牙周炎的益处必须与其副作用平衡。对使用抗生素的担忧在于打破人类和我们的共生微生物群之间的有益关系以及出现对抗生素的口腔细菌抗性。
因此，需要可以特异性干扰牙周病原体诸如牙龈卟啉单胞菌的定殖而不会促成抗生素抗性或破坏有益细菌群体的疗法。还需要干扰牙龈卟啉单胞菌的致病性和生物膜形成的方法。
概述
已经发现，来自细菌嵴链球菌(Streptococcus cristatus)的精氨酸脱亚胺酶的某些部分(但不是其他部分)可用于对抗牙龈卟啉单胞菌感染。它们发挥功能以防止含有口腔病原体牙龈卟啉单胞菌的生物膜的形成，并减少口腔病原体牙龈卟啉单胞菌中特定毒力相关蛋白(例如，短菌毛的主要蛋白亚基(Mfa1，由mfa1基因控制)，牙龈菌蛋白酶(Gingipain)R1催化结构域(RgpA/B)，牙龈菌蛋白酶R1粘附素结构域(RgpA)和赖氨酸牙龈菌蛋白酶(gingipain)蛋白酶(Kgp，由kgp基因控制))的表达。这些部分中的一些在蛋白的C-末端区域中发现，而负责酶的脱亚胺酶活性的区域在N-末端区域中发现。其他在N-末端区域中发现，尽管发现N-末端区域整体上没有防止生物膜形成的活性。
在第一个方面，提供了用于调节细菌的生物膜形成的肽，所述肽具有与SEQ IDNO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第二个方面，提供了用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物，所述组合物包含化合物，所述化合物包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第三个方面，提供了治疗或预防受试者中的牙菌斑相关病况或症状的方法，所述方法包括向所述受试者的牙齿和/或牙龈表面局部施用治疗有效量的化合物，所述化合物包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第四个方面，提供了化合物在制备用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物中的用途，其中所述化合物包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第五个方面，提供了降低在表面上形成含有牙龈卟啉单胞菌群体的生物膜的可能性的方法，所述方法包括将所述表面暴露于有效浓度的化合物，所述化合物包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第六个方面，提供了降低细菌中生物膜相关基因的表达的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于有效浓度的化合物，所述化合物包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
在第七个方面，提供了核酸，其编码第一个方面的肽，或与编码所述肽的核酸互补。
在第八个方面，提供了降低细菌中毒力相关基因的表达的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于有效浓度的化合物，所述化合物包含具有与SEQ ID NO:3-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列，其中所述毒力相关基因选自短菌毛的主要蛋白亚基(mfa1)、牙龈菌蛋白酶R1催化结构域(rgpA/B)、牙龈菌蛋白酶R1粘附素结构域(rgpA)和赖氨酸牙龈菌蛋白酶(gingipain)蛋白酶(kgp)。
以上呈现简化的概述以便提供对所请求保护的主题的一些方面的基本理解。本概述不是一个广泛的综述。其不旨在鉴定关键或重要要素或描述所请求保护的主题的范围。其唯一目的是以简化形式呈现一些构思，作为稍后呈现的更详细描述的序言。
附图简述
图1A-1B显示与嵴链球菌接触的牙龈卟啉单胞菌中fimA的表达。误差条代表标准偏差。星号表示牙龈卟啉单胞菌中fimA的表达水平的统计学显著性差异(n=3；t检验；p <0.05)。
图2显示牙龈卟啉单胞菌33277或放线共生放线杆菌Y4和ArcA的相互作用的免疫荧光抗体图像。上小图呈现显示细菌位置的微分干涉对比(DIC)图像。下小图中的红色图像是TRITC荧光标记图像，其代表与通过ArcA特异性抗体阳性标记的牙龈卟啉单胞菌33277或放线共生放线杆菌Y4结合的嵴链球菌ArcA。
图3显示ArcA和牙龈卟啉单胞菌表面蛋白的相互作用。SDS-PAGE分析显示三个主要条带被检测为牙龈卟啉单胞菌RagB (PGN_0294)蛋白、嵴链球菌ArcA和MotA/TolQ/ExbB质子通道家族蛋白(PGN_0806)：泳道1，仅牙龈卟啉单胞菌提取物；泳道2，仅CC5A提取物；和泳道3，牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌CC5A提取物。
图4显示各种肽与牙龈卟啉单胞菌33277(顶部迹线)、0782突变体(中间迹线)和ragB突变体(底部迹线)的表面提取物的相对结合。肽阵列信号的强度图显示为具有相应ArcA区域的峰。将五个最高峰编号。
图5显示肽4在牙龈卟啉单胞菌中抑制毒力基因表达的效力。分别在浓度为0、4、16和64 μM的肽4存在的情况下，通过进行三次独立实验以测定fimA、mfa1、rgpA/B和kgp的mRNA水平，来测量半抑制浓度(IC50)。使用具有用于曲线拟合的插件的Microsoft Excel程序建立每种基因的IC50。星号表示当与fimA基因相比时，肽4对特定基因的IC50的统计学显著性(P < 0.05；t检验)。
图6A-6B显示牙龈卟啉单胞菌33277及其突变体中毒力基因表达的比较。使用qRT-PCR测定fimA、mfa1、rgpA/B、rgpA和kgp的表达。在浓度为16μM的肽4存在或不存在的情况下，牙龈卟啉单胞菌菌株在TSB中生长。(A)相对于在没有肽4的培养基中生长的牙龈卟啉单胞菌33277中的表达水平(1单位)，指示在补充有肽4的培养基中生长的33277、pgn_0806和ragB突变体中的基因的mRNA水平。(B)使fimR (ΔfimR)和fimS (ΔfimS)突变体在有或没有肽4的情况下生长。每个条代表在有肽4(16μM)的情况下生长的突变体中fimA或mfa1与在没有肽4的培养基中生长的突变体中的那些(1单位)的相对表达水平。显示的结果是来自三次独立实验的平均值和标准偏差。星号表示在有/没有肽的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株中基因表达水平的统计学显著性(P < 0.05；t检验)。
图7A-7B显示响应于肽4的牙龈卟啉单胞菌中的菌毛蛋白和牙龈菌蛋白酶的产生。(A)使用Western印迹分析来分析暴露于浓度为0、3、12和48μM的肽4的牙龈卟啉单胞菌33277的表面提取物中的牙龈菌蛋白酶的FimA、Mfa1、Hgp44和PGN_0128 (免疫反应性53kDa抗原)的表达水平。(B)用ImageJ软件进行Western印迹的半定量。每个条代表蛋白条带的强度。星号表示暴露于肽4(3、12或48μM)的牙龈卟啉单胞菌中的蛋白条带的相对强度与未暴露的牙龈卟啉单胞菌(0 μM，1单位)中的蛋白条带的相对强度之间的显著性差异(通过t检验，P < 0.05)。
图8A-8B显示牙龈卟啉单胞菌菌毛的透射电子显微镜分析。使用TEM使菌毛结构可视化。使牙龈卟啉单胞菌菌株33277(A)和用肽4处理的33277(B)在TSB板上生长48小时，并通过用钼酸铵负染来制备。条= 0.2μm。
图9A-9B显示在P4存在或不存在的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株的生长曲线的比较。使牙龈卟啉单胞菌33277(A)和W83(B)在P4 (24μM)存在或不存在的情况下在TSB培养基中生长。经30小时的时段测量OD600。曲线是一式三份样品的平均值，其中误差条代表标准偏差。
图10A-10B显示附着于唾液涂覆表面的牙龈卟啉单胞菌的定量。在96孔聚苯乙烯微量滴定板中进行粘附测定。将孔用人全唾液预涂覆，并用在有P4 (24μM)或对照肽的情况下在37℃下厌氧生长的牙龈卟啉单胞菌33277(A)或W83(B)接种。通过结晶紫染色定量牙龈卟啉单胞菌在表面上附着和形成微菌落的能力。每个条代表来自三次独立实验的结合能力的平均值±标准偏差。
图11显示牙龈卟啉单胞菌33277-格氏链球菌DL1异型生物膜的形成。在涂覆有人全唾液的聚苯乙烯表面上建立格氏链球菌DL1生物膜。将在有或没有P4 (24μM)的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌33277与DL1生物膜反应4小时。使用qPCR定量生物膜中的结合的33277。每个条代表在生物膜中检测到的33277细胞的数目。误差条表示标准偏差。
图12A-12D显示P4对来自异型生物膜的牙龈卟啉单胞菌的分散。将在没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌33277引入覆盖有格氏链球菌DL1生物膜的六-板的孔中以形成异型生物膜。然后将P4 (24μM)添加至孔中。使用qPCR定量生长培养基中的牙龈卟啉单胞菌细胞的数目(A)、结合于格氏链球菌生物膜上的数目(B)、孔中的33277的总数(C)和生长培养基中的格氏链球菌的数目(D)。比较在有或没有P4的孔中的细菌细胞的数目，并且星号表示在P4存在或不存在的情况下孔中的牙龈卟啉单胞菌细胞的数目的显著差异(t检验，p <0.05)。
图13A-13B显示P4介导的牙龈卟啉单胞菌对口腔角质形成细胞侵袭的抑制。通过抗生素保护测定法测定牙龈卟啉单胞菌对人口腔角质形成细胞(HOK)的侵袭。使牙龈卟啉单胞菌33277 (A)或W83 (B)分别在有24或48μM P4的情况下生长。内化的牙龈卟啉单胞菌细胞的数目用三次重复的平均值±SD表示。星号表示对于在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌细胞观察到的侵袭水平之间的显著差异(p < 0.05；t检验)。
图14A-14D显示牙龈卟啉单胞菌蛋白酶活性的比较。测试与牙龈卟啉单胞菌细胞相关(A-B)或牙龈卟啉单胞菌的培养基中(C-D)的Rgp或Kgp活性。将牙龈卟啉单胞菌33277或W83在有或没有P4 (48μM)的情况下生长24小时，并通过离心分离细菌细胞和生长培养基。评估KDP128 (rgpA -、rgpB -和kgp -突变体)的牙龈菌蛋白酶活性，其用作阴性对照。星号表示在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株中蛋白酶活性水平的统计学差异(p < 0.05；t检验)。
图15A-B显示HOK的生长培养基中IL-8水平的测定。将HOK以10的MOI暴露于牙龈卟啉单胞菌33277或W83 2小时和18小时，并且分别收集培养物上清液和HOK。使用ELISArray试剂盒测量培养基(a-b)中的IL-8水平。每个条代表IL-8浓度的平均值，并且从三个生物学重复计算标准偏差。星号表示用在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌处理的HOK的培养上清液中IL-8浓度的统计学差异(p < 0.05；t-检验)。
详述
A. 定义
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开领域的普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解，术语，诸如在常用字典中定义的那些，应被解释为具有与其在说明书的上下文中的含义一致的含义，且不应以理想化或过于正式的含义解释，除非本文中明确地如此定义。为了简洁或清楚，可能未详细描述众所周知的功能或结构。
本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制性的。如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
本文使用术语“第一”、“第二”等来描述各种特征或要素，但这些特征或要素不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个特征或要素与另一个特征或要素区分开。因此，在不背离本公开的教导的情况下，下面讨论的第一特征或要素可以被称为第二特征或要素，且类似地，下面讨论的第二特征或要素可以被称为第一特征或要素。
术语“基本上由……组成”意味着，除了所叙述的要素外，所请求保护的内容还可以包含不会不利影响针对如本公开中所述的其预期目的而请求保护的内容的可操作性的其他要素(步骤、结构、成分，组分等)。重要的是，该术语排除不利影响针对如本公开中所述的其预期目的而请求保护的内容的可操作性的其他要素，即使这些其他要素可能增强针对某些其他目的而请求保护的内容的可操作性。
术语“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度的所测量的量的可接受的误差或变化的程度。典型的示例性误差或变化的程度在给定值或值范围的20百分比(%)内，优选在10%内，且更优选在5%内。对于生物系统，术语“约”是指可接受的误差标准偏差，优选不超过给定值的2倍。除非另有说明，否则本说明书中给出的数值是近似值，意味着当未明确说明时可以推断出术语“约”或“大约”。除非另有说明，否则权利要求中的数目是精确的。
如本文所用的术语“预防(prevention)”、“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“抑制(suppression)”、“抑制(suppress)”和“抑制(suppressing)”是指在疾病状态或病况的临床表现发作之前开始的作用过程(例如施用药物组合物)以降低可能性或严重程度。这种可能性或严重程度的降低不一定是绝对有用的。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指在疾病状态或病况的临床表现发作后开始的作用过程(例如施用药物组合物)以消除或减少疾病状态或病况的这种临床表现。这种治疗不一定是绝对有用的。
如本文所用的术语“需要治疗”是指通过护理人员做出的患者需要治疗或将从治疗中获益的判断。该判断基于在护理人员的专业知识领域中，但包括患者由于可通过本公开的方法或设备治疗的病况而生病或将生病的知识的各种因素。
如本文所用的术语“需要预防”是指通过护理人员做出的患者需要治疗或将从预防中受益的判断。该判断基于在护理人员的专业知识领域中，但包括患者由于可通过本公开的方法或设备预防的病况将生病或可变成生病的知识的各种因素。
如本文所用的术语“个体”、“受试者”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，例如小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物和人类。该术语可以指定雄性或雌性或二者，或排除雄性或雌性。
如本文所用的术语“治疗有效量”(或简称“有效量”)是指单独或作为药物组合物的一部分的化合物的量，其能够对疾病状态或病况的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用。这种效果不必是绝对有益的。
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”包括用相对无毒的酸或碱(这取决于本文所述化合物上发现的特定取代基)制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需碱(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足量的所需酸(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸(monohydrogencarbonic)、磷酸、一氢磷酸(monohydrogenphosphoric)、二氢磷酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、一氢硫酸(monohydrogensulfuric)、氢碘酸或亚磷酸等的那些，以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、草酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐诸如精氨酸盐等，和有机酸诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见，例如Berge, S. M.等人, “Pharmaceutical Salts”, Journal of PharmaceuticalScience, 1977, 66, 1-19)。本发明的某些特定化合物含有允许化合物转化成碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团二者。
如本文所用的术语“核苷酸”是指任何天然或合成的核苷酸。其包括常规DNA或RNA碱基(A、G、C、T、U)，碱基类似物，例如肌苷、5-硝基吲唑和其他，咪唑-4-甲酰胺，嘧啶或嘌呤衍生物，例如修饰的嘧啶碱基6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c] [1,2]噁嗪-7-酮(有时称为“P”碱基，其结合A或G)和修饰的嘌呤碱基N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(有时称为“K”碱基，其结合C或T)，次黄嘌呤，N-4-甲基脱氧鸟苷，4-乙基-2'-脱氧胞苷，4,6-二氟苯并咪唑和2,4-二氟苯核苷类似物，芘-官能化LNA核苷类似物，脱氮-或氮杂-修饰的嘌呤和嘧啶，在5或6位具有取代基的嘧啶和在2、6或8位具有取代基的嘌呤，2-氨基腺嘌呤(nA)，2-硫尿嘧啶(sU)，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤，O-6-甲基鸟嘌呤，4-硫代-嘧啶，4-氨基-嘧啶，4-二甲基肼-嘧啶，O-4-烷基-嘧啶和疏水性核碱基(其形成双链DNA而没有氢键结合)。核碱基可以通过各种键或构象(包括磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯键、肽-核酸键)连接在一起。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指包含连接在一起以形成聚合物的核苷酸的多聚化合物，包括常规RNA、DNA、LNA、BNA、任何前述物质的共聚物及其类似物。
如本文所用的术语“核酸”是指单链多核苷酸或两个多核苷酸的双链体。此类双链体不需要在所有位置退火，并且可以含有空位或突出端。
如本文所用，当核酸的一条链中的核苷酸序列由于其核苷酸氢原子的取向而与相对的核酸链上的另一序列氢键键合时，核酸与彼此“互补”(当然，核酸链同样可以是自身互补的)。互补碱基在DNA中通常是A与T，和C与G，并且在RNA中通常是C与G，和U与A。互补性可以是完美的或实质的/足够的。两个核酸之间的完美互补意味着两个核酸可以形成双链体，其中双链体中的每个碱基通过Watson-Crick配对与互补碱基键合。“实质的”或“足够的”互补性意味着一条链中的序列与相对链中的序列不完全互补，但是在两条链上的碱基之间发生足够的键合以在杂交条件(例如，盐浓度和温度)的给定组合下形成稳定的杂合复合物。此类条件可以通过使用预测杂交链的Tm的序列和标准模型，或通过使用建立的方法经验确定Tm来预测。Tm是指在两条核酸链之间形成的杂交复合物群体50%变性的温度。在低于Tm的温度下，杂交复合物的形成是有利的，而在高于Tm的温度下，杂交复合物中的链的解链或分离是有利的。这种严格性基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel (1987,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152, AcademicPress, San Diego CA)中所教导。退火双链体的Tm取决于双链体的碱基组成、碱基错配的频率和反应介质的离子强度。双链体的Tm可以由本领域普通技术人员基于这两个因素使用公认的算法来计算。最大严格性通常发生在Tm下约5℃；高严格性通常发生在Tm下约5-10℃；中间严格性通常发生在Tm下约10-20℃；且低严格性通常发生在Tm下约20-25℃。如本领域技术人员将理解，最大严格性杂交可用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中间(或低)严格性杂交可用于鉴定或检测相似或相关的序列。在该上下文中，术语“严格的”本身是指中间严格性。除非另有说明，否则本公开中对互补性的任何提及均是指在中等严格性的条件下的互补性。术语诸如最大严格、高严格和较差严格分别是指最大严格性、高严格性和低严格性的条件。
术语“肽”是指两个或更多个氨基酸的聚合物。组成氨基酸可以包括20个“标准”氨基酸，但不限于它们，并且可以包括非标准或修饰的氨基酸。
B. 精氨酸脱亚胺酶的活性部分
已经发现，嵴链球菌精氨酸脱亚胺酶的某些部分可用于影响牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成，因此介导由该常见病原体直接或间接引起的许多下游疾病。包含此类肽的化合物可以具有治疗和预防受试者中的牙周炎或牙周炎相关病况或症状的下游效应。具体地，已经发现使用包含具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的肽序列的化合物可以抑制牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成，且其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。此类化合物在本文中称为“活性化合物”。
嵴链球菌精氨酸脱亚胺酶的序列据信为：
。
C-末端结构域加下划线(SEQ ID NO:2)。所述肽的一些实施方案涉及C-末端结构域的部分(即，与其具有至少60%同一性)，当作为208个氨基酸部分存在时，已观察到C-末端结构域影响牙龈卟啉单胞菌的fimA表达。也已观察到C-末端结构域不具有任何脱亚胺酶活性。所述肽的进一步实施方案涉及C-末端结构域的较小部分。所述肽的具体实施方案涉及已经证实结合牙龈卟啉单胞菌表面蛋白的C-末端结构域的以下部分中的至少一个：VYNREEDTRIEGGDEL (SEQ ID NO:5)、NIFKKNVGFKK (SEQ ID NO:6)和ELVRGRGGPRCMSMPF(SEQ ID NO:7)。注意，结构建模表明在天然蛋白中，SEQ ID NO:6在α-螺旋的末端，随后是几个无规卷曲残基，其进而随后是β-折叠。因此，所述肽的一些实施方案包含与SEQ ID NO:6相关的序列，其在N-端末端和C-端末端侧接4-8个残基。
所述肽的一些实施方案涉及N-末端结构域的部分。尽管N-末端结构域整体上似乎不影响牙龈卟啉单胞菌的fimA表达，但已经表明较小部分结合牙龈卟啉单胞菌表面蛋白。此类较小部分的具体实例包括IRGRETKK (SEQ ID NO:3)和NHMFADTRNRE (SEQ ID NO:4)。
所述肽的大小可以根据应用的具体需要而变化。例如，改变所述肽的大小可以调节其溶解度、蛋白酶抗性和等电点(pI)。所述肽的一些实施方案为约5-208个氨基酸长；所述肽的进一步实施方案为不超过200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长。
所述肽序列的同一性水平可以是至少60%。在进一步实施方案中，同一性水平为至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%。
技术人员将能够确定SEQ ID NO:2-7的合适变体。例如，甚至在相对保守的区域中，也可以用化学相似的氨基酸取代天然残基，同时保留活性(保守氨基酸残基取代)。因此，甚至对生物活性或结构可能重要的区域也可以进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不会不利影响肽结构。
对SEQ ID NO:2-7中的任一氨基酸序列的保守修饰(和对编码核苷酸的相应修饰)将产生具有与天然序列的功能和化学特征相似的功能和化学特征的肽衍生物。相反，SEQID NO:2-7的功能和/或化学特征的实质性修饰可以通过选择在其对维持取代区域中的分子主链的结构的作用显著不同的取代来实现。
例如，“保守氨基酸取代”可以涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对在该位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代。
保守氨基酸取代还涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来并入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或倒置形式。本领域技术人员将理解，本文所述的核酸和多肽分子可以化学合成以及通过重组方法产生。
天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分类：1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)碱性：His、Lys、Arg；5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可涉及将这些类别之一的成员交换为来自另一个类别的成员。可以将此类取代的残基引入SEQ ID NO:2-7的与SEQ ID NO:2-7直向同源物同源的区域，或引入分子的非同源区域。
在进行此类改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于它们的疏水性和电荷特征，每种氨基酸都被分配亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物学功能方面的重要性(Kyte等人, J. Mol. Biol., 157:105-131, 1982)。已知某些氨基酸可以取代具有相似的亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍然保留相似的生物活性。
在基于亲水指数进行改变时，可以使用其亲水指数在+/-2之内的氨基酸的取代；在一个替代实施方案中，亲水指数在+/-1之内；在又另一个替代实施方案中，亲水指数在+/-0.5之内。
本领域还应理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。如由其相邻氨基酸的亲水性决定的多肽的最大局部平均亲水性与蛋白的生物学特性相关。
以下亲水性值已被分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于相似亲水性值进行改变时，可以使用其亲水性值在+/-2之内的氨基酸的取代；在一个替代实施方案中，亲水性值在+/-1之内；在又另一个替代实施方案中，亲水性值在+/-0.5之内。
可以进行取代以增加或降低所述肽的溶解度。例如，用带电荷或极性的氨基酸取代非必需疏水性氨基酸将倾向于改善溶解度。还可以进行取代以降低肽的生物降解速率，例如通过用非天然氨基酸取代非必需氨基酸。
在期望此类取代时，本领域技术人员可以确定期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)。例如，氨基酸取代可用于鉴定Angptl4多肽的重要残基，或增加或降低SEQID NO:2-7与特定结合靶标的亲和力，以增加或降低活性。
示例性氨基酸取代列于表1中。
表1：氨基酸取代
原始氨基酸 示例性取代 优选的取代
Ala Val, Leu, Ile Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Glu Glu
Asp Glu Glu
Cys Ser, Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, 正亮氨酸 Leu
Leu Ile, Val, Met, Ala, Phe, 正亮氨酸 Ile
Lys Arg, 1,4-二氨基丁酸, Gln, Asn Arg
Met Leu, Phe, Ile Leu
Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro Ala, Gly Gly
Ser Thr, Ala, Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr, Phe Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 正亮氨酸 Leu
另外，本领域技术人员可以综述鉴定对活性或结构重要的相似多肽中的残基的结构-功能研究。鉴于这种比较，可以预测对应于对相似多肽中的活性或结构重要的氨基酸残基的SEQ ID NO:2-7中的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学相似的氨基酸取代SEQ ID NO:2-7的此类预测的重要氨基酸残基。
本领域技术人员还可以分析与相似多肽中的该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于该信息，本领域技术人员可以预测SEQ ID NO:2-7的氨基酸残基相对于其三维结构的比对。本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白表面上的氨基酸残基进行根本改变，因为此类残基可能参与与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生测试SEQID NO:2-7衍生物，其在每个期望氨基酸残基处含有单个氨基酸取代。然后可以使用本领域技术人员已知和本文公开的活性测定法筛选衍生物。此类衍生物可用于收集关于合适取代的信息。例如，如果发现对特定氨基酸残基的改变导致破坏的、不期望地降低的或不合适的活性，则可以避免具有这种改变的衍生物。换句话说，基于从此类常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定在单独或与其他突变组合的情况下，应该避免进一步取代的氨基酸。
许多科学出版物已致力于从氨基酸序列的分析预测二级结构(参见Chou等人,Biochemistry, 13(2):222-245, 1974; Chou等人, Biochemistry, 113(2):211-222,1974; Chou等人, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148, 1978; Chou等人, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276, 1979; 和Chou等人, Biophys. J., 26:367-384, 1979)。此外，计算机程序目前可用于帮助预测多肽的二级结构。实例包括基于Jameson-Wolf分析的那些程序(Jameson等人, Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186,1998; 和Wolf等人, Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191; 1988)，程序PepPlot.RTM.(Brutlag等人, CABS, 6:237-245, 1990; 和Weinberger等人, Science, 228:740-742,1985)，以及蛋白三级结构预测的其他新程序(Fetrow等人, Biotechnology, 11:479-483,1993)。
此外，计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法基于同源性建模。例如，具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的两种多肽或蛋白通常具有相似的结构拓扑学。蛋白结构数据库(PDB)的最近增长已经提供了二级结构的增强的可预测性，包括多肽或蛋白的结构中的折叠的潜在数目(参见Holm等人, Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247, 1999)。
预测二级结构的额外方法包括“穿线法(threading)”(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87, 1997; Suppl等人, Structure, 4(1):15-9, 1996)，“概况分析”(Bowie等人, Science, 253:164-170, 1991; Gribskov等人, Meth. Enzym.,183:146-159, 1990; 和Gribskov等人, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358,1987)，和“进化连锁”(参见Home, 同上，和Brenner, 同上)。
本文讨论的任何多肽形式也可以含有可用于鉴定或纯化多肽的序列；这种序列的一个实例是C-末端V5标签。前述还包括编码此类多肽(包括如本文所述的多肽衍生物)的核酸序列(诸如，但不限于cDNA序列)。此类核酸的实例包括编码SEQ ID NO:1-7的多肽的核酸。这些可以包括包含SEQ ID NO:8 (编码SEQ ID NO:1)、9 (编码SEQ ID NO:2)、10 (编码SEQ ID NO:3)、11 (编码SEQ ID NO:4)、12 (编码SEQ ID NO:5)、13 (编码SEQ ID NO:6)和14 (编码SEQ ID NO:7)中任一个的序列的核酸。
C. 药物组合物
提供了用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物，所述组合物包含上文提供的任何活性化合物。所公开的组合物可包含一种或多种此类活性化合物，以及药学上可接受的载体。此类载体和配制方法的实例可以在Remington: The Science and Practiceof Pharmacy (第20版，Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer编辑)中找到，并且是本领域技术人员通常充分理解的。为了形成适于施用的药学上可接受的组合物，此类组合物将含有治疗有效量的活性化合物。
本公开的药物组合物可以用于本公开的治疗和预防方法。将这些组合物以足以递送治疗有效量的活性化合物的量施用于受试者，以便在本文公开的治疗和预防方法中有效。治疗有效量可根据多种因素而变化，所述因素例如受试者的状况、体重、性别和年龄。例如，所述组合物的一些实施方案包含最多达中值致死剂量(LD50)的活性化合物。LD50可以使用标准毒理学方法或参考过去的研究来确定。或者，可以配制药物组合物以在受试者的牙齿和/或牙龈表面处获得期望浓度的活性化合物。
其他因素包括施用模式和位点。可以配制药物组合物以便以本领域已知的任何方法提供到受试者。示例性剂型包括皮下、静脉内、局部、表皮、经口、骨内、肌内、鼻内和肺部。本公开的组合物可以配制成仅对受试者施用一次或对受试者施用多于一次。此外，当将组合物不止一次施用于受试者时，可以使用多种方案，例如每天一次、每周一次、每月一次或每年一次。该组合物还可以配制成每天施用至受试者多于一次。可通过试验识别治疗有效量的活性化合物和适当的给药方案，以获得最佳活性，同时使任何潜在的副作用最小化。另外，可能需要用于共同施用或顺序施用其他试剂的制剂。
本公开的组合物可以配制成全身施用，例如通过静脉内施用，或例如通过皮下注射或通过施加凝胶、纤维、糊剂或乳膏局部施用。
本公开的组合物可以进一步包含改善活性化合物的溶解度、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开的组合物可以进一步包含减弱活性化合物的不期望的副作用和/或降低其毒性的试剂。这种试剂的实例描述于各种文本中，例如Remington: The Science andPractice of Pharmacy (第20版, Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer编辑)。
可将本公开的组合物在多种剂型中配制用于施用。例如，组合物可呈片剂、胶囊、小药囊、锭剂、糖锭、丸剂、粉末、颗粒、酏剂、酊剂、溶液、悬浮液、糖浆、软膏、乳膏、糊剂、乳液或静脉内施用或注射的溶液的形式。其他剂型包括用于透皮、经由贴剂机制或软膏施用的剂型。其他剂型包括适于通过喷雾器或计量剂量吸入器递送的制剂。任何前述剂型可以被修改以提供定时释放和/或持续释放制剂。
在本公开中，药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。这些载体可以包括媒介物、助剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体以及辅助剂，例如着色剂和调味剂(在此统称为载体)。通常，药学上可接受的载体对活性化合物是化学惰性的，且在使用条件下没有有害的副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质。药学上可接受的载体的性质可以根据所用的具体剂型和组合物的其他特征而不同。
例如，用于以固体形式例如片剂、胶囊、小药囊、锭剂、糖锭、丸剂、粉末或颗粒口服施用的组合物，活性化合物可与口服无毒的药学上可接受的惰性载体组合，所述惰性载体例如惰性填充剂、合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和辅助剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂形式可包括以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸以及本文所述的其他载体。锭剂形式可在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中包含活性成分，以及糖果锭剂(pastille)在惰性基质(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分，乳液和凝胶除了活性成分外还含有本领域已知的载体的。
药物组合物可以是洁齿剂。洁齿剂具有消费者可广泛获得的优点。因此人们熟悉洁齿剂的使用，且在大多数社会中，每天至少一次应用洁齿剂作为口腔卫生方案的一部分。此外，洁齿剂对于将活性化合物局部递送到牙齿和/或牙龈表面是有效的。
洁齿剂可选自糊剂、凝胶、漱口水、粉末和牙皂。在所述组合物的一些实施方案中，洁齿剂是糊剂或凝胶，其包含研磨剂、表面活性剂、保湿剂和增稠剂中的至少一种。这些研磨剂包括水合二氧化硅、二水合磷酸二钙、碳酸钙、碳酸氢钠、焦磷酸钙和氧化铝。这些表面活性剂包括月桂基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸钠、pluronics、月桂基磺基乙酸钠。这种防龋剂包括氟化物。这种牙垢控制成分包括焦磷酸四钠、Gantrez S-70、三聚磷酸钠和甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物。所述洁齿剂还可包含以下中的一种或多种：水；pH缓冲液；保湿剂(防止干燥并增加令人愉快的口感)，例如甘油、山梨糖醇、聚丙二醇、木糖醇和聚乙二醇；增稠剂，例如二氧化硅增稠剂、硅酸铝钠和粘土；树胶，例如羧甲基纤维素钠、纤维素醚、黄原胶、角叉菜胶、海藻酸钠和卡波姆；抗菌剂；调味剂，例如水不溶性精油；甜味剂，例如糖精、右旋糖、左旋糖、甜蜜素(cyclamate)、天冬氨酸盐；着色剂；和粘合剂，以提供稠度和形状。
对于通过漱口水口服施用，活性化合物可以与以下中的一种或多种组合：水和醇(如乙醇)。漱口剂可进一步包括以下中的一种或多种：如前面部分所述的表面活性剂、牙垢控制成分、防龋剂、缓冲液、保湿剂、抗菌剂、调味剂和着色剂。
在具体的实施方案中，洁齿剂是包含任何上述研磨剂的粉末。所述粉末可以进一步包含上面提供的适合于牙膏的任何干组分。在另一个具体实施方案中，洁齿剂是包含油和水中的一种或多种的牙皂。油可以是已知适用于牙皂的任何油，例如橄榄油、椰子油、精油和薄荷油。
药物组合物可以是口香糖。口香糖可包含活性化合物和树胶，例如基于丁二烯的合成橡胶、桦树皮焦油、糖胶树胶(chicle)、乳香树胶、云杉胶、石蜡、吐鲁树脂(toluresin)、苯乙烯-丁二烯橡胶、异丁烯、异戊二烯共聚物和石油蜡。树胶将以足以赋予口香糖必要的咀嚼性的浓度存在，如可由本领域技术人员配制的。可以加入调味剂，包括上面列出的那些。
所述组合物可以呈口服液体形式，例如酊剂、溶液、悬浮液、酏剂和糖浆；并且本公开的活性化合物可以溶解在稀释剂例如水、盐水或醇中。此外，口服液体形式可包含适当调味的悬浮剂或分散剂，例如合成和天然树胶，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等。此外，当需要或必要时，也可将合适的着色剂或其他辅助剂掺入到混合物中。可以采用的其他分散剂包括甘油等。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与患者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。所述组合物可以包含生理学上可接受的稀释剂，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液、醇如乙醇、异丙醇或十六烷醇、二醇例如丙二醇或聚乙二醇如聚(乙二醇)400、甘油缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或具有或不具有加入的药学上可接受的表面活性剂的乙酰化脂肪酸甘油酯例如皂、油或洗涤剂，悬浮剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其他药物助剂。
可用于胃肠外制剂和洁齿剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物质。用于胃肠外制剂的合适脂肪酸包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物，其通过环氧丙烷与丙二醇、油酸、硬脂酸和异硬脂酸的缩合形成。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。用于胃肠外制剂的合适皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，且合适的洗涤剂包括：(a)阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物；(b)阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐、烷基、烯烃、醚和甘油单酯硫酸盐，和磺基琥珀酸盐；(c)非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性洗涤剂，例如烷基β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季铵盐；和(e)其混合物。
合适的防腐剂和缓冲液可用于这种制剂中。为了最小化或消除注射位点的刺激，这种组合物可含有一种或多种具有约12至约17的亲水-亲油平衡值(HLB)的非离子表面活性剂。
含有活性化合物的局部剂型，例如软膏、乳膏、糊剂和乳液，可以与本领域熟知的各种载体材料例如醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等混合，以形成醇溶液、局部清洁剂、清洁乳膏、皮肤凝胶、润肤洗剂和乳膏或凝胶制剂中的洗发剂。也可以使用包含皮肤去角质剂或皮肤研磨剂制剂。这种局部制剂可以应用于贴剂、绷带或敷料用于透皮递送，或可以应用于绷带或敷料以直接递送到伤口或皮肤损伤的部位。
本公开的活性化合物还可以配制成以脂质体递送系统的形式施用，所述系统例如小单层囊泡、大单层囊泡和抗呕剂(antiemtrics)。脂质体可以由多种磷脂例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。这种脂质体还可含有单克隆抗体，以将脂质体直接递送到特定细胞类型或细胞类型组。
本公开的活性化合物还可以与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚(polyhydroxyethylaspartamidephenol)或被棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的活性化合物可以与一类可用于实现药物控制释放的生物可降解聚合物偶联，所述聚合物例如聚乳酸、聚ε-己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。
D. 治疗和预防的方法
提供了治疗或预防受试者中的牙菌斑相关病况或症状的方法，所述方法包括向受试者的牙齿和/或牙龈表面局部施用治疗有效量的任何上述活性剂。牙龈卟啉单胞菌栖息的牙菌斑生物膜倾向于是高毒性的，导致牙齿和牙龈疾病(诸如牙龈炎和牙周炎)的高比率。与牙龈卟啉单胞菌相关的牙周炎可以进而导致严重的全身性疾病状态，包括动脉粥样硬化、人免疫缺陷病毒(HIV)疾病、牙齿脱落、冠状动脉疾病、中风、早产、低出生体重、糖尿病控制不佳、呼吸系统问题、类风湿性关节炎和哮喘。
治疗和/或预防的方法包括向所述受试者施用足以治疗或预防牙菌斑或牙菌斑相关病况或症状的量(治疗有效量)的活性化合物。所述方法通常将进一步包括鉴定需要这种治疗或预防的受试者。太少的活性化合物将不能提供治疗效果。另一方面，过量的活性化合物可能导致不期望的副作用。
治疗有效量可以根据各种因素(诸如受试者的状况、重量、性别和年龄)而变化。例如，所述方法的一些实施方案包含施用最多达中值致死剂量(LD50)的活性化合物。进一步的实施方案包括施用最高达50%、25%、10%、1%、0.1%或0.01%的LD50。LD50可以使用标准毒理学方法或参考过去的研究来确定。或者，所述方法可以包括将期望浓度的活性化合物递送至受试者的牙齿和/或牙龈表面。
如果在施用活性化合物之后，受试者仍然具有牙周炎或牙周炎相关的病况或症状，或处于其风险中，则所述方法的任选步骤是继续施用活性化合物或药物组合物。
在一个实施方案中，所述方法包括将所述活性化合物递送至受试者的牙齿和/或牙龈表面。期望将活性化合物递送至牙齿和/或牙龈表面，因为这是牙龈卟啉单胞菌形成牙菌斑的部位。牙齿和/或牙龈表面上活性化合物的存在对于防止在那里形成牙菌斑是必要的。向牙齿和/或牙龈表面的靶向递送也可以防止对其他组织或器官的不良影响。在一个替代实施方案中，所述方法包括将活性化合物局部施用于受试者的口腔。由于牙齿和/或牙龈表面在受试者的口中，所以期望将活性化合物施用于受试者的口腔。一个具体实施方案包括将活性化合物局部施用于受试者的口腔，其中活性化合物在洁齿剂或牙胶中施用。含有活性化合物的洁齿剂或牙胶可用于治疗或预防牙菌斑或牙菌斑相关病况或症状，因为这些制剂也可能含有改善总体口腔健康的添加剂(例如，氟化物)。人类受试者可能已经使用类似的制剂用于常规口腔卫生，所以受试者更有可能遵守治疗方案，导致更好的结果。
E. 减少生物膜的方法
提供了降低在表面上形成含有牙龈卟啉单胞菌群体的生物膜的可能性的方法，所述方法包括将所述表面暴露于有效浓度的任何上述活性剂。
F. 减少毒力基因的表达的方法
已经发现，使用包含来自嵴链球菌的ArcA蛋白的特定片段的上面公开的化合物，可以抑制菌毛蛋白基因(mfa1、rgpA/B、rgpA和kgp)的表达。已知这些基因参与牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成和毒力。提供了降低细菌中生物膜或毒力相关基因的表达的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于有效浓度的任何上述活性化合物。接触可以在体外或体内发生。生物膜相关基因的实例是菌毛蛋白基因(例如，主要的菌毛亚基fimA)。牙龈卟啉单胞菌中的毒力基因的实例包括牙龈菌蛋白酶基因，诸如mfa1、rgpA/B、rgpA和kgp。在所述方法的一个具体实施方案中，所述细菌是牙龈卟啉单胞菌。有效浓度可以通过将细菌暴露于不同浓度的活性剂来经验确定。在所述方法的一个具体实施方案中，浓度是15μM。
G. 核酸
提供了编码描述为在活性剂中有用的任何肽的核酸。此类核酸可用于各种应用，诸如肽的表达、基因转移和基因疗法。核酸的一般实施方案包含编码所述肽的编码区。所述核酸的一个替代一般实施方案包含与编码所述肽的序列互补的编码区。互补区可以与编码所述肽的序列完美互补，或者其可以在最大、高、中等或差的严格条件下与编码所述肽的序列杂交。所述核酸可以进一步包含与编码区可操作偶联的一个或多个调节区，诸如启动子、增强子、阻遏物结合区或沉默子。在所述核酸的一些实施方案中，所述启动子在编码区的(5'方向)紧上游。在所述核酸的一个具体实施方案中，所述启动子是组成型启动子。
还提供了包含上文公开的任何核酸的细胞。所述细胞可用于例如产生多肽用于随后的分离或分析。所述细胞也可能是已经历基因疗法的受试者的细胞。
所述细胞可以是单细胞生物或多细胞生物的细胞。许多单细胞生物具有比来自多细胞生物的细胞更容易在体外培养的优点。在一些实施方案中，所述细胞是单细胞真核生物。适合于该方法的单细胞真核生物包括真菌和原生生物。单细胞生物特别可用于克隆、复制和维持目标核酸。通常用于此目的的模型单细胞生物包括酵母、其他真菌、细菌、原生生物和古细菌。特定的模式生物体是本领域中众所周知的，并且包括细菌诸如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium)和各种集胞藻属种(Synechocystis sp.)；原生生物诸如盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)、赫氏圆石藻(Emiliania huxleyi)和假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)；和真菌诸如曲霉属种(Aspergillus sp.)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
在细胞的一些实施方案中，所述细胞是动物细胞。动物细胞培养方法是本领域中已知的，并且本领域技术人员可以开发适合于动物细胞的类型的细胞培养方法而无需过度的实验。动物细胞具有如同动物组织在体内一样密切反应的优点。动物细胞可以是，例如，来自鸟类、哺乳动物、小鼠、挪威大鼠、棉鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、另一种啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、家禽、灵长类动物和人类的细胞。细胞可以在单一培养物中存在，或者与多于一种类型的细胞一起在共培养物中存在。
还提供了载体，其包含上文公开的任何核酸。许多合适的载体是本领域中已知的，诸如病毒、质粒、粘粒、福斯质粒、噬菌粒、人工染色体、酵母人工染色体、人工染色体、植物转化载体和脂质体。
H. 实施例
工作实施例1：鉴定结合牙龈卟啉单胞菌中的表面蛋白的链球菌嵴链球菌肽
已经假设嵴链球菌和牙龈卟啉单胞菌之间的拮抗关系，并且嵴链球菌的精氨酸脱亚胺酶(ArcA)是提出的信号分子，其中牙龈卟啉单胞菌通过抑制FimA蛋白的表达和产生来对其响应。在此证实，牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌之间的直接相互作用对于细胞-细胞通讯是必需的。发现牙龈卟啉单胞菌的两种表面蛋白PGN_0294和PGN_0806与嵴链球菌ArcA相互作用。使用肽阵列分析，鉴定了ArcA的几个牙龈卟啉单胞菌结合位点，其导致发现具有ArcA的天然序列的11-聚体肽，其抑制菌毛和牙龈菌蛋白酶的表达。这些数据表明，ArcA的功能基序足以选择性改变牙龈卟啉单胞菌中的毒力基因表达，并且PGN_0294和PGN_0806可以充当ArcA的受体。这些发现为将来合理设计干扰牙龈卟啉单胞菌诱导的致病性群落的起始和形成的药剂提供了分子基础。
方法
细菌菌株和生长条件。使牙龈卟啉单胞菌菌株和放线共生放线杆菌Y4在胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)中或TSB血琼脂板(其补充有酵母提取物(1 mg/ml)、氯高铁血红素(5 μg/ml)和甲萘醌(1μg/ml))上从冷冻的储备物生长，并在37℃下在厌氧室(85% N2, 10% H2, 5%CO2)中孵育。使嵴链球菌CC5A和同基因ΔarcA16在补充有0.5%葡萄糖的胰蛋白酶蛋白胨液体培养基(TPB)中在37℃在需氧条件下生长。适当时，将红霉素(5μg/ml)或四环素(0.5μg/ml)添加至生长培养基中。
Transwell共培养测定。将牙龈卟啉单胞菌细胞(105)接种在六孔板的每个孔中，并将嵴链球菌CC5A或其arcA突变体(107)添加至具有孔径0.4 μm或8 μm的聚碳酸酯多孔膜的transwell插入物中。生长16小时之后，通过离心收集板的各孔中的细菌细胞。为了测定迁移至较低孔的CC5A的数目，通过离心收获较低孔中的细菌，并通过将样品煮沸20分钟来释放DNA。使用针对CC5A arcA和33277 16s-rRNA的特异性引物(表2)，通过qPCR测定细菌的数目。使用RNeasy微型旋转柱纯化牙龈卟啉单胞菌RNA，所述RNeasy微型旋转柱选择性裂解牙龈卟啉单胞菌细胞而非嵴链球菌细胞。使用实时qRT-PCR测量牙龈卟啉单胞菌中的fimA基因的表达(参见下文)。
RNA分离和qPCR。将牙龈卟啉单胞菌在Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)中均质化，并使用RNeasy微型旋转柱(Qiagen, Valencia, CA)纯化RNA。用无RNA酶的DNA酶在柱上消化RNA样品，并使用Agilent 2100生物分析仪测试总RNA以确保样品的质量。引物列于表2中。扩增反应由以下组成：根据制造商的说明，在TC-3000热循环仪(Techne,Staffordshire, ST15 OSA, UK)上使用Bio-Rad iScript Reverse TranscriptionSupermix进行逆转录，和在iCycler MyiQTM实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories,Inc, Hercules, CA)上使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行实时qRT-PCR分析。牙龈卟啉单胞菌16 S rRNA基因用作归一化基因。分析解链曲线概况以验证每个样品的单峰，其指示引物特异性。通过使用比较循环阈值(ΔCT)方法，相对于未处理的校准物样品测定测试样品的研究基因的表达水平。通过从校准物样品的平均CT值减去测试样品的平均CT值来计算ΔCT，并且通过假设100%扩增效率，将所述值用于计算两者之间的比率的值。通过对任何相当的样品上样相同量的总RNA，ΔCT代表样品之间基因表达的差异。
表2：寡核苷酸引物
共聚焦显微镜。如所述(Teles R, Teles F, Frias-Lopez J, Paster B,Haffajee A. 2013. Lessons learned and unlearned in periodontal microbiology.Periodontal 2000 62: 95-162)，从嵴链球菌CC5A纯化ArcA (50 μg)，与牙龈卟啉单胞菌细胞(108)在PBS中混合，并在室温下孵育1小时。用PBS洗涤三次之后，将细菌-蛋白复合物在含有5% BSA的PBS中封闭1小时。通过用兔抗ArcA多克隆抗体(1:400)和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC，1:500)-缀合的AffiniPure山羊抗兔IgG抗体染色来检测与牙龈卟啉单胞菌结合的ArcA。用具有选定滤光片(543 nm激发和560 nm发射)的LSM 510倒置共聚焦显微镜进行可视化。
下拉测定(Pull-down assay)。为了分离和鉴定与ArcA相互作用的牙龈卟啉单胞菌表面分子，我们进行下拉测定。通过用Sonic Dismembrator (Fisher Scientific；输出控制8，20 s × 3)超声处理来制备牙龈卟啉单胞菌的表面提取物，并通过离心、随后过滤(0.2-μm孔径)来除去细胞碎片。将33277的表面提取物与纯化的ArcA在旋转器上在室温下混合1小时，且然后添加至ArcA抗体偶联的Sepharose 4B柱(Sigma-Aldrich)中。在室温下孵育1小时之后，用含有0.01% Tween的PBS洗涤柱三次，并通过0.1 M甘氨酸pH 2.4洗脱蛋白。SDS-PAGE之后，切下条带并通过液相色谱-质谱法鉴定。
pgn_0294 (ragB)和pgn_0806 (motA/tolQ/exbB)突变体的构建。通过PCR介导的诱变的不依赖于连接的克隆(LIC-PCR) 63–65，产生插入突变体(pgn_0294和pgn_0806)。通过三步PCR将2.1-kb ermF-ermAM盒引入靶基因中以产生如先前64所述的pgn_0294-erm- pgn_0294或pgn_0806-erm-pgn_0806 DNA片段。然后通过电穿孔将最终的PCR产物引入牙龈卟啉单胞菌33277中。在含有红霉素(5 μg/ml)的TSB板上选择突变体。通过PCR分析证实插入突变，并将突变体命名为牙龈卟啉单胞菌Δ0806或ΔragB。
蛋白相互作用筛选。通过超声处理(1分钟，三次)和离心(13000 g持续30分钟)、随后过滤(0.2 μm孔径)来收集牙龈卟啉单胞菌的表面提取物。通过PEPperPRINT(Heidelberg, Germany)进行肽微阵列分析。产生具有ArcA的409种不同的肽的ArcA微阵列，并且各肽含有15个氨基酸，其中肽-肽重叠14个氨基酸。在封闭和洗涤之后，将阵列与分离自牙龈卟啉单胞菌33277、0806突变体或ragB突变体的表面提取物(100 μg/ml)一起孵育。使用抗牙龈卟啉单胞菌抗体和绵羊抗兔IgG (H + L) DyLight680，检测结合在ArcA阵列上的牙龈卟啉单胞菌表面蛋白。用LI-COR Odyssey成像系统分析阵列。
肽合成和活性。通过PEPperPRINT和Biomatik (Delaware)合成肽，并用高效液相色谱(HPLC)以≥90%纯度纯化。将肽重悬浮于不含核酸酶/蛋白酶的PBS中，等分，并储存在-20℃。如所述(Hajishengallis, G., Darveau, R. P. & Curtis, M. A. The keystone-pathogen hypothesis. Nature reviews. Microbiology 10, 717-725, doi:10.1038/nrmicro2873 (2012))且稍微修改，测定肽的抑制活性。将肽与5 × 105个牙龈卟啉单胞菌的细胞混合，点在TSB血琼脂板上，并厌氧培养60小时。使用qRT-PCR或western印迹分析测量菌毛和牙龈菌蛋白酶mRNA或蛋白的表达水平。
Western印迹分析。使用BUGBUSTER®蛋白提取试剂(EMD Millipore, Darmstadt,Germany)裂解牙龈卟啉单胞菌细胞，并使用Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad)测定蛋白浓度。通过12% SDS钠-PAGE分离裂解物(0.5 μg)，并用Mini Transblot电泳转移室(Bio-Rad)以100 V转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen, Carlsbad, CA)，持续1小时。将膜用PBS中的3%BSA封闭1小时，并与1:1,000稀释的多克隆抗-FimA、抗-Mfa1、抗-HGP44 (牙龈菌蛋白酶的C-末端粘附素结构域)或抗PNN-0128抗体孵育1小时。用PBS洗涤之后，将膜与抗兔辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育1小时。使用增强的化学发光(GE Healthcare Bio-Sciences Corp,Pittsburgh, PA)使蛋白可视化，并使用半定量Western印迹技术用ImageJ软件(NIH,Bethesda, Maryland)进行测量。
透射电子显微镜。在有或没有肽4的情况下，使牙龈卟啉单胞菌细胞在TSB血板上生长48小时。收集细菌细胞并重悬浮于PBS中。将20μl细菌悬浮液应用于Formvar涂覆的铜网格(200目，Electron Microscopy Sciences，PA)并空气干燥。然后将细菌细胞用0.5%钼酸铵负染4分钟，并用在80 kV下操作的透射电子显微镜(Philips CM-12, Portland, OR)观察。
统计学分析。Student氏t-检验用于确定牙龈卟啉单胞菌菌株的基因表达概况和生长速率的差异的统计学显著性。p < 0.05被认为是显著的。
结果
牙龈卟啉单胞菌-嵴链球菌通讯需要直接接触。为了测试牙龈卟啉单胞菌-嵴链球菌通讯是否通过直接细胞-细胞接触发生，使用具有孔径为0.4μm或8μm的膜的transwell系统分离牙龈卟啉单胞菌 33277和嵴链球菌CC5A或其arcA突变体。16小时之后，收集每个下部孔中的细菌，并使用qPCR测定牙龈卟啉单胞菌33277和嵴链球菌CC5A的数目。来自1 × 107个CC5A细胞的输入物的7.8 × 104个从Transwell插入物通过8μm孔迁移至下部孔，而当使用具有0.4μm孔的膜时，在下部孔中检测到少于1.5个嵴链球菌细胞(图1A)。然后纯化牙龈卟啉单胞菌RNA，并使用qRT-PCR测量fimA基因的表达。当使用8-μm孔transwell时，fimA表达的水平降低约2.5倍(图1B)。当通过0.4μm孔膜阻断牙龈卟啉单胞菌-嵴链球菌接触时，未观察到嵴链球菌对fimA表达的抑制，表明牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌之间的细胞-细胞通讯需要直接接触。
通过用牙龈卟啉单胞菌细胞和纯化的ArcA蛋白的免疫荧光测定证实了牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌ArcA的直接相互作用。通过共聚焦显微镜检测荧光标记的牙龈卟啉单胞菌-ArcA复合物。如图2中所示，ArcA对牙龈卟啉单胞菌33277具有高亲和力，但对AaY4没有，表明ArcA和牙龈卟啉单胞菌表面分子之间的特异性相互作用。
与嵴链球菌的ArcA相互作用的牙龈卟啉单胞菌表面蛋白的分离。为了分离和鉴定与ArcA相互作用的牙龈卟啉单胞菌表面分子，进行下拉测定。使用ArcA抗体偶联的Sepharose 4B柱从牙龈卟啉单胞菌细胞裂解物和ArcA蛋白的混合物中捕获ArcA-相互作用组分。用SDS-PAGE分析从柱洗脱的蛋白。检测到分子大小为大约55、47和30 kDa的三个条带(图3)。使用ArcA抗体的Western印迹显示47 kDa蛋白是嵴链球菌的ArcA (数据未显示)。另外两个条带通过MS分析鉴定为牙龈卟啉单胞菌RagB (PGN_0294)和MotA/TolQ/ExbB质子通道家族蛋白(PGN_0806)，表明这两种蛋白是ArcA的受体。
ArcA的关键功能基序的鉴定。嵴链球菌ArcA是一种具有409个氨基酸的47 kDa蛋白。我们寻求鉴定ArcA的负责其对fimA表达的抑制活性的关键氨基酸和基序。首先进行肽微阵列以检测ArcA对牙龈卟啉单胞菌的结合位点。将阵列与牙龈卟啉单胞菌33277或ΔragB或Δ0806突变体的表面提取物一起孵育，并用牙龈卟啉单胞菌抗体检测结合。尽管这些菌株的绝对结合能力(荧光强度)显著变化，可能是由于一些菌株中表面提取物的蛋白降解，但总体模式是一致的。在观察到的几个峰中(图4)，发现具有序列NIFKKNVGFKK(峰4)且跨越氨基酸残基249-259的肽对牙龈卟啉单胞菌33277蛋白具有最高的结合亲和力，其作为最高峰是显而易见的。当阵列与从Δ0806或ΔragB突变体分离的表面提取物一起孵育时，该峰不再是最高的，证实牙龈卟啉单胞菌蛋白PGN_0806和RagB参与ArcA的识别。
基于ArcA阵列峰合成五种肽(表1中的1-5)，并且通过在牙龈卟啉单胞菌生长培养基中包括所述肽来确定每种肽对基因表达的影响。如表3中所示，在16 μM的浓度，来自ArcA的C-末端区域的11残基肽4使fimA、mfa1、kgp、rgpA/B (编码rgpA/B的催化区域)和rgpA (编码RgpA的粘附素结构域)基因的表达抑制至少2倍。编码免疫反应性53 kDa抗原的pgn_ 0128的表达未响应于肽4的存在而被调节，表明对毒力相关基因的子集的特异性。在64 μM的浓度，观察到增加的抑制活性(60-70%)(未显示)，表明该区域可能是ArcA的关键活性基序。这些结果还确认，ArcA对牙龈卟啉单胞菌毒力的影响超出fimA的抑制，并且包括牙龈菌蛋白酶和次要菌毛亚基的基因，也如其他人所示。通过构建剂量-反应曲线(0、4、16和64 μM)来测定半抑制浓度(IC50)以测量肽4抑制这些基因的表达的有效性。如图5中所示，肽4的最高效率见于在rgpA (用对应于编码RgpA、HGP44的结合结构域的区域的引物扩增)、rgpA/B (用对应于编码RgpA和B的催化区域的区域的引物扩增)和fimA的抑制中，其中IC50分别为11.2 ± 2.1 μM、11.7 ± 2.3 μM或12.4 ± 3.4 μM。肽4还显示与对kgp (64.3 ± 3.8μM)相比，对mfa1的显著降低的IC50 (19.2 ± 3.3 μM)。应当指出，肽1、2、3和5 (表3)也表现出一些抑制活性，尽管效力较低。这些区域可以与肽4一起参与结构基序的形成，其可以具有比单独的肽4更高的结合能力。这些发现为牙龈卟啉单胞菌的抑制剂的未来设计提供分子基础。
表3
上表3显示在ArcA肽存在的情况下牙龈卟啉单胞菌中毒力基因的差异表达。在浓度为16μM的肽存在或不存在的情况下，牙龈卟啉单胞菌33277在TSB中生长。通过实时PCR测量转录物水平。相对于肽不存在的情况下的表达水平(作为1个单位)指示基因的mRNA水平。显示的结果是来自三次独立实验的平均值和标准偏差。星号表示在有/没有肽的TSB中生长的牙龈卟啉单胞菌中至少两倍的表达水平的统计学显著性(P < 0.05；t检验)。
为了验证PGN_0806和RagB在牙龈卟啉单胞菌-嵴链球菌通讯中作为受体发挥功能，测试在肽4存在或不存在的情况下Δ0806和ΔragB菌株中的基因表达，并将它们与野生型菌株33277中的基因表达进行比较。结果显示PGN_0806的缺失阻止fimA、mfa1、rgp和kgp的肽4依赖性调节(图6A)。尽管ragB突变没有完全阻断肽4活性，但对所有靶基因都观察到显著降低的抑制作用。以前，双组分调节系统(FimS/R)被鉴定为fimA表达的活化子。测试FimS/R在嵴链球菌-牙龈卟啉单胞菌细胞-细胞通讯中的作用。尽管fimA和mfa1的表达水平在fimS和fimR突变体中被抑制大约20和4倍(数据未显示)，但在FimS和FimR不存在的情况下，肽4介导的FimA表达的调节保持完整(图6B)，表明FimS/R不参与这种细菌细胞-细胞通讯。这些结果提供了强有力的证据证明，PGN_0806和RagB(单独或组合)在牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌之间的细菌细胞-细胞通讯中充当受体。
还使用Western印迹分析测定在翻译水平上的菌毛蛋白和牙龈菌蛋白酶的表达。使牙龈卟啉单胞菌33277与浓度为0、3、12和48 μM (fimA表达的0×、¼×、1×和4× IC50)的肽4一起生长48小时。如图7A和7B中所示，在12和48 μM的肽4存在的情况下，FimA、Mfa1和HGP44 (RgpA的结合结构域)的产生显著降低。然而，免疫反应性53 kDa抗原的产生没有改变，与在转录水平观察到的表达模式一致。透射电子显微镜进一步显示，当与没有肽4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌细胞相比时，在补充肽4 (16 μM)的培养基中生长的牙龈卟啉单胞菌表面上的菌毛很少(图8A和8B)。
讨论
已经发现了五个ArcA结合区域。值得注意的是位于C-末端且跨越氨基酸249-259的ArcA的功能性基序，并且源自该区域的肽(肽4)显示对菌毛(FimA和Mfa1)和牙龈菌蛋白酶(RgpA/B和Kgp)的mRNA和蛋白表达两者的抑制活性。因此，该肽是开发针对牙龈卟啉单胞菌的抑制剂的潜在候选物。基于我们观察到ArcA特异性结合牙龈卟啉单胞菌的表面，肽抑制剂可能对该生物体是特异性的，并且对早期生物膜定植物(链球菌和放线菌)没有显著的抑制作用。单独靶向牙龈卟啉单胞菌可能足以阻碍菌群失调(dysbiotic)生物膜的发展，因为牙龈卟啉单胞菌被认为是一种基石病原体。
细胞表面受体是信号转导中的重要元件，并且具有结合(感知)特定信号、随后引发特异性细胞反应的能力。细菌中众所周知的信号转导过程涉及双组分调节系统，其涉及传感器组氨酸激酶和反应调节蛋白。牙龈卟啉单胞菌中的FimS/R双组分信号转导主要调节fimA表达和一些其他基因，包括mfa122。然而，来自当前研究的结果显示FimS/R不参与牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌之间的通讯，因为fimS和fimR突变体中fimA和mfa1的表达水平也响应于肽4而被调节。然而，鉴定了两种牙龈卟啉单胞菌表面蛋白，RagB (PGN_0294) (牙龈卟啉单胞菌的主要免疫显性抗原)，和PGN_0806 (被注释为MotA/TolQ/ExbB质子通道家族蛋白)，其与嵴链球菌的ArcA相互作用，尤其是与ArcA的肽4区域相互作用。有趣地，据报道铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) TonB-ExbB-ExbD蛋白复合物参与信号转导。此外，被认为与牙龈卟啉单胞菌表面上的RagB结合的RagA是TonB-依赖性受体。该工作证实，ragB基因的突变部分阻断ArcA针对fimA的抑制活性，而携带pgn_0806基因中的突变的牙龈卟啉单胞菌菌株完全消除了对肽4的响应。这些数据证实PGN_0806和RagB作为受体在牙龈卟啉单胞菌-嵴链球菌通讯中的作用。虽然鉴定了信号肽和潜在受体，但细胞内信号转导的机制仍未鉴定。先前的研究显示，prtT突变体中的rgpA的表达降低，而kgp的表达未降低，这表明kgp和rgp的表达未被协调地调节。因此，推测独立的细胞内递质参与fimA、mfa1、kgp和rgp的控制。
总之，鉴定了嵴链球菌ArcA的功能结构域，其对牙龈卟啉单胞菌的表面具有高亲和力，并且能够抑制参与菌毛和牙龈菌蛋白酶的产生的几种众所周知的毒力基因的表达。发现牙龈卟啉单胞菌的两种表面蛋白(RagB和PGN_0806)，其与ArcA相互作用并且是牙龈卟啉单胞菌和嵴链球菌之间的细菌细胞-细胞通讯所需的。这些结果功能表征并分子剖析我们更早报道的这些口腔细菌之间的拮抗关系。这些发现的应用应为经设计以减少牙龈卟啉单胞菌在口腔中的定植和抑制牙周炎相关牙菌斑的致病性的治疗策略提供了基础。
预测实施例2：抑制牙龈卟啉单胞菌中fimA和牙龈菌蛋白酶基因的表达的源自 ArcA的功能结构域的小肽的表征和设计。
ArcA是A群链球菌的主要细胞壁相关表面蛋白。ArcA充当牙龈卟啉单胞菌的fimA表达和生物膜形成的有效抑制剂。本预测实施例的目的是设计可以抑制牙龈卟啉单胞菌中毒力基因表达的表达的更有效的抑制剂和优化肽抑制剂的特性。据推测，源自ArcA的短肽可能足以调节牙龈卟啉单胞菌中的毒力基因表达。因此，本部分聚焦于涉及ArcA对牙龈卟啉单胞菌毒力潜力的直接作用的机制。将进行体外功能研究，包括酶促、基因表达和定殖测定，以证实该模型。将测试牙龈卟啉单胞菌菌株，包括有菌毛菌株33277和无菌毛菌株W83，并比较它们对肽抑制剂的反应。
初步数据显示P4在15μM的浓度下使fimA和rgp基因的表达抑制近似50%。为了产生具有更高抑制活性的功能肽，将产生更长的肽以便于二级结构的形成并恢复ArcA功能基序的三维结构。使用软件Jpred4、Psipre和Jufo9D的ArcA的二级结构预测表明P4似乎在α螺旋的末端，其随后为几个无规卷曲残基，且其后是β折叠的开始。因此，基于ArcA的序列，通过在P4的每个末端分别添加4或8个残基来设计19聚体-和27聚体-肽。将测试和比较所述肽抑制fimA和rgp的表达的能力。如果与P4相比在较长的肽中发现增加的抑制活性，则将通过产生在P4的仅一端具有额外残基的两种肽来进一步分析具有最高活性的肽。例如，如果在N-末端具有额外残基的P4显示更高的抑制活性，则α螺旋对功能活性可能是至关重要的。
一旦确定P4的长度，就将使用诱变方法(诸如丙氨酸筛选)确定关键残基。P4中的残基将被丙氨酸系统地取代，这消除侧链相互作用而不改变主链构象。然后将构建肽文库，其将在关键残基处具有氨基酸的系统组合。
肽环化也将用于增强功能肽的抑制活性。环肽可通过修饰侧链的相互作用来提供特定的构象特性。
尽管它们具有抑制活性，但将测试这些肽类似物的溶解度、稳定性和细胞毒性。P4可以溶解在缓冲液(PBS)和TBS(牙龈卟啉单胞菌的生长培养基)中，然而，肽的修饰可以影响其类似物的溶解度。如果是这种情况，则非必需疏水性氨基酸将被带电或极性残基取代。为了测试肽抑制剂的稳定性，将所述肽1)在37℃下；2)在唾液中；3)在牙龈卟啉单胞菌细胞存在的情况下孵育混合24小时。将以正模式获取MS谱，其中数据依赖性MS/MS扫描将来自先前扫描的最丰富的峰片段化。初始研究显示P4在37℃下稳定24小时。如果快速检测到降解，则活性肽的非必需氨基酸将用非天然氨基酸替代。非蛋白原氨基酸可以改善肽稳定性。将检查所述肽对口腔细胞的生物学作用。将人口腔角质形成细胞(HOK)和牙龈成纤维细胞(HGF)(ScienCell Research Laboratories)暴露于60或15 μM肽24或48小时。乳酸脱氢酶(LDH)测定将通过如下来进行：将释放至培养基中的LDH作为死细胞的标记物或进行裂解LDH作为剩余活细胞的标记物。
最终目标是鉴定将通过功能测定选择的有效肽抑制剂，所述功能测定包括测定牙龈卟啉单胞菌的毒力基因的mRNA水平、牙龈菌蛋白酶活性、菌毛形成和生物膜形成。如所述(Wang BY, Wu J, Lamont RJ, Lin X, Xie H. 2009. Negative correlation ofdistributions of Streptococcus cristatus and Porphyromonas gingivalis insubgingival plaque. J Clin Microbiol 47: 3902-6)，将使用RT-qPCR测定所述肽对牙龈卟啉单胞菌中毒力基因的表达的抑制作用。参与菌毛形成(fimA)、蛋白酶活性(rgpA和rgpB)和铁获取系统(hmuX和Y)的毒力基因的表达将充当肽抑制剂的选择标记物。通过构建剂量-反应曲线确定的半数最大抑制浓度(IC50)将是肽抑制这些基因的表达的有效性的量度和功能测定的标准。所有功能测定都将使用包括4×IC50、IC50和1/4×IC50的系列稀释剂量进行。
在鉴定出有效的肽抑制剂的情况下，在用肽抑制剂处理牙龈卟啉单胞菌之后，使用透射电子显微镜检查表面上展示的菌毛(Kadowaki, T. 等人 Arg-gingipain acts asa major processing enzyme for various cell surface proteins in Porphyromonasgingivalis. The Journal of biological chemistry 273, 29072-29076 (1998))。将如所述检查肽抑制剂对牙龈卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌异型生物膜的形成的影响(Eke, P. I. 等人 Update on Prevalence of Periodontitis in Adults in theUnited States: NHANES 2009 to 2012. Journal of periodontology 86, 611-622,doi:10.1902/jop.2015.140520 (2015); Capestany CA, Kuboniwa M, Jung IY, ParkY, Tribble GD, Lamont RJ. 2006. Role of the Porphyromonas gingivalis InlJprotein in homotypic and heterotypic biofilm development. Infect Immun 74:3002-5)。将在六孔板上产生细菌生物膜，并使用qPCR或在玻璃底皿上进行定量，并使用共聚焦显微镜进行分析。还将使用共聚焦和抗生素保护测定来研究肽抑制剂在抑制牙龈卟啉单胞菌侵袭中的作用(Ho MH, Chen CH, Goodwin JS, Wang BY, Xie H. 2015.Functional Advantages of Porphyromonas gingivalis Vesicles. PLoS One 10:e0123448; Chaudhuri S, Pratap S, Paromov V, Li Z, Mantri CK, Xie H. 2014.Identification of a diguanylate cyclase and its role in Porphyromonasgingivalis virulence. Infect Immun 82: 2728-35)。为了进一步测试肽抑制剂的作用，将使用从牙周炎患者收集的牙菌斑样品进行离体实验。受试者人群将由年龄在21和65岁之间的40名男性和女性组成。受试者将从Meharry医学院的牙周病学系招募。基于美国牙周病学会的定义(Wilensky, A., Polak, D., Houri-Haddad, Y. & Shapira, L. The roleof RgpA in the pathogenicity of Porphyromonas gingivalis in the murineperiodontitis model. Journal of clinical periodontology 40, 924-932, doi:10.1111/jcpe.12139 (2013))，牙周炎患者应具有> 16个牙齿，2个或更多的CAL> 4 mm的邻间部位，2个或更多具有> 5 mm的袋深度。纳入标准在过去一年内没有进行针对刮牙术和牙根整平术进行牙周治疗，或者在过去五年没有进行针对牙周手术的牙周治疗。在开始研究之前，所有受试者都将被同意。在任何牙科治疗之前，使用来自第一磨牙、第一前磨牙、犬齿和中切牙的近中颊槽的无菌纸点，从登记的受试者中取出龈上和龈下牙菌斑样品(WangBY等人，同上)。将纸点置于槽中30秒，并将其转移至试管中的5ml TSB中。然后将管立即置于厌氧室中，将细菌培养24小时。然后将每个样品在有/没有肽抑制剂的情况下在6孔板中的两个孔(每个2.5 ml)中亚培养，并继续培养48小时以形成混合物种生物膜。将收集浮游(自由漂浮)或固着(锚定)细菌并重悬浮于Trizol中。使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒用牙龈卟啉单胞菌物种特异性16S rRNA基因引物，用qPCR计数牙龈卟啉单胞菌。将用来自野生型菌株33277的基因组DNA制备用于测定牙龈卟啉单胞菌的数目的标准品。一旦检测到牙龈卟啉单胞菌，将使用PCR分析以fimA基因型特异性引物作为探针来确定菌株的fimA基因型(Zheng C, Wu J, Xie H. 2011. Differential expression and adherenceof Porphyromonas gingivalis FimA genotypes. Mol Oral Microbiol 26: 388-95)。
将分别使用荧光底物，L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(L-Arg-AMC)和L-赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(L-Lys-AMC)测定在肽抑制剂存在的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌的Arg-和Lys-特异性酶促活性(Olsen, I. & Potempa, J. Strategies for theinhibition of gingipains for the potential treatment of periodontitis andassociated systemic diseases. Journal of oral microbiology 6, doi:10.3402/jom.v6.24800 (2014))，并与没有暴露肽抑制剂的牙龈卟啉单胞菌的那些进行比较。
提出的肽设计将导致在抑制毒力基因诸如fimA和rgp的表达的方面更有效的肽抑制剂，其具有IC50 ≤ 1 µM的有效性。预计与P4一样，有效的肽抑制剂将抑制几种众所周知的毒力基因表达(包括编码粘附素和蛋白酶的基因)的表达。作为结果，牙龈卟啉单胞菌的菌毛的产生和形成将减少或异常，并且牙龈卟啉单胞菌的结合活性在肽抑制剂存在的情况下可能显著降低。然而，如果不能鉴定比P4更有效的肽，则一种替代策略是寻找两种或更多种短肽的有效组合以增强抑制活性。我们将基于其他结合峰的天然氨基酸序列设计肽，因为我们已发现其他肽也表现出一些抑制活性，尽管浓度高得多。
工作实施例3：对牙龈卟啉单胞菌的表型毒力特性的影响
上述实施例证实源自嵴链球菌精氨酸脱亚胺酶(ArcA)的11-聚体肽(P4)能够抑制几种众所周知的牙龈卟啉单胞菌毒力因子(包括菌毛蛋白和牙龈菌蛋白酶)的表达和产生。扩展该工作，以确定该肽对牙龈卟啉单胞菌与毒力潜力相关的表型特性的影响。发现尽管牙龈卟啉单胞菌对P4的暴露没有改变生长速率，但单种和异型生物膜形成和口腔上皮细胞的侵袭被抑制。此外，P4能够通过抑制IL8的牙龈菌蛋白酶相关的降解来妨碍牙龈卟啉单胞菌使先天免疫失调的能力。因此，P4具有可用于操纵口腔群体中牙龈卟啉单胞菌水平和防止毒力潜力的实现的特征。
方法
细菌菌株和生长条件。使牙龈卟啉单胞菌菌株在胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)中或TSB血琼脂板(其补充有酵母提取物(1 mg/ml)、氯高铁血红素(5 μg/ml)和甲萘醌(1μg/ml))上从冷冻储备物生长，并在37℃下在厌氧室(85% N2, 10% H2, 5% CO2)中孵育。使格氏链球菌DL1在补充有0.5%葡萄糖的胰蛋白酶蛋白胨液体培养基(TPB)中在37℃在需氧条件下生长。
肽合成和活性。通过Biomatik (Wilmington, DE)合成P4和对照肽(具有位于P4的临近下游的11个氨基酸的肽26)，并用高效液相色谱(HPLC)纯化以达到≥ 95%纯度。将纯化的肽重悬浮于不含核酸酶/蛋白酶的PBS中，等分，并储存在-20℃。
单型生物膜测定。如先前所述评估牙龈卟啉单胞菌与唾液涂覆表面的附着(O'Toole, G. A. & Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonasfluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: agenetic analysis. Molecular microbiology 28, 449-461 (1998))。简而言之，使牙龈卟啉单胞菌菌株生长至对数中期(OD600 = 0.8)并通过离心收集。将细菌细胞(108)重悬浮于TSB中，转移至96孔聚苯乙烯板(Corning Inc., Corning, NY)的孔中，并在37℃孵育，所述96孔聚苯乙烯板的孔已用人全唾液预涂覆，所述人全唾液用PBS稀释2倍。洗涤之后，将生物膜用1%结晶紫染色并用95%乙醇脱色。然后用分光光度计(Ultrospec 2100 Pro;Amersham Pharmacia Biotech)测定乙醇脱色溶液在540 nm处的吸光度。
异型生物膜测定。在聚苯乙烯六孔板上产生牙龈卟啉单胞菌和格氏链球菌的异型生物膜。首先将格氏链球菌DL1细胞(2 × 109)在37℃下在唾液涂覆的孔中有氧孵育3小时，并通过用PBS洗涤三次来除去未结合的细胞。收集在有或没有P4的情况下在TSB中生长的牙龈卟啉单胞菌细胞(2 × 109)，重悬浮于¼ TSB (1:3 TSB和PBS)中，添加至含有链球菌生物膜的孔中，并在37℃下厌氧培养4小时。使用qPCR测定格氏链球菌生物膜中的固着牙龈卟啉单胞菌的数目。用裂解溶液(溶液A；Invitrogen, Waltham, MA)裂解细菌细胞，并使用Easy-DNA试剂盒(Invitrogen)提取DNA。生物膜中的牙龈卟啉单胞菌细胞通过使用QuantiTect SYBR绿PCR试剂盒用牙龈卟啉单胞菌的16S rRNA基因引物进行计数(Wu, J. &Xie, H. Role of arginine deiminase of Streptococcus cristatus inPorphyromonas gingivalis colonization. Antimicrobial agents and chemotherapy54, 4694-4698, doi:10.1128/AAC.00284-10 (2010))。使用来自牙龈卟啉单胞菌 33277的基因组DNA制备用于测定异型生物膜中的牙龈卟啉单胞菌的数目的标准品。将33277的新鲜培养物在PBS中连续稀释并铺板在TSB板上以获得每种稀释物的每毫升的菌落形成单位(CFU)。
为了确定P4是否促进牙龈卟啉单胞菌细胞从异型生物膜的释放和/或抑制它们的再次进入，进行修改的生物膜测定。首先将在没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌添加至含有格氏链球菌DL1的六孔聚苯乙烯板的孔中，并孵育4小时。除去未结合的牙龈卟啉单胞菌之后，然后添加含有P4和庆大霉素(50μg/ml)的新鲜½ TSB (1:1 TSB和PBS)，并将板在厌氧条件下在温和振荡下孵育。以三个24小时间隔收集浮游牙龈卟啉单胞菌，而在72小时时间点收集固着细菌细胞。使用Easy-DNA试剂盒(Invitrogen)纯化细菌DNA，并使用qPCR定量牙龈卟啉单胞菌细胞。
Arg-和Lys-特异性蛋白酶活性。如先前所述，在96孔板中测量牙龈卟啉单胞菌全细胞的牙龈菌蛋白酶活性(Ho MH, Chen CH, Goodwin JS, Wang BY, Xie H. 2015.Functional Advantages of Porphyromonas gingivalis Vesicles. PLoS One 10:e0123448; Dashper, S. G.等人 Lactoferrin inhibits Porphyromonas gingivalisproteinases and has sustained biofilm inhibitory activity. Antimicrobial agents and chemotherapy 56, 1548-1556, doi:10.1128/AAC.05100-11 (2012))。使牙龈卟啉单胞菌33277或W83在2 ml TSB中在有或没有P4的情况下厌氧生长至固定相(OD600 =1.2)。通过离心分离细菌细胞和生长培养基，并将细胞重悬浮于2 ml冰冷的TC150缓冲液(pH 8.0, 5 mM半胱氨酸, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl和5 mM CaCl2)中。将牙龈卟啉单胞菌细胞悬浮液(2.5μl中的2.5 ×106个细胞)或100μl牙龈卟啉单胞菌生长培养基重悬浮于TC150缓冲液中，并与100μl底物溶液(2 mM N-a-苯甲酰基-Arg-对硝基苯胺(BApNA)或N-(对甲苯磺酰基)-Gly-Pro-Lys 4-硝基苯胺乙酸盐(GPK-NA)、30%异丙醇(体积/体积)、400 mM Tris-HCl (pH 8)、100 mM NaCl和2 mM半胱氨酸)(Sigma-Aldrich, St. Louis,MO)混合。将反应溶液在37℃下孵育4小时，并通过微孔板阅读仪(Bio-Rad, Hercules, CA)测量405 nm处的吸光度。
细菌侵袭测定。使用抗生素保护测定法测定牙龈卟啉单胞菌的侵袭能力(Xie,H., Cai, S. & Lamont, R. J. Environmental regulation of fimbrial geneexpression in Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 65, 2265-2271 (1997))。将人口腔角质形成细胞(HOKs, 5 × 105) (ScienCell Research Laboratories,Carlsbad, CA)接种在六孔板中。在与牙龈卟啉单胞菌33277或W83反应1小时之后，用PBS洗涤HOK以除去未结合的细菌，且然后在抗生素庆大霉素(300 μg/ml)和甲硝唑(200 μg/ml)存在的情况下继续培养另外4小时以消除细胞外细菌。然后将HOK用PBS洗涤三次并用无菌蒸馏的dH2O裂解。将内化的细菌铺板在TSB血琼脂板上。将板在37℃下厌氧培养7天，并计算牙龈卟啉单胞菌的CFU。
酶联免疫吸附测定(ELISA)。根据制造商的说明，使用人IL-8单分析物ELISArray试剂盒(Qiagen, Redwood City, CA)进行ELISA。将HOK (1 × 105)暴露于在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌(1 × 106) 2小时和18小时。收集HOK的培养基并通过ELISA分析。使用细胞因子的标准曲线定量L-8。
统计学分析。Student氏t-检验用于确定在P4存在或不存在的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株的功能和生长速率的差异的统计学显著性。p < 0.05被认为是显著的。所有测定均用三次生物学重复进行。
结果
P4对牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成的影响。选择来自ATCC的牙龈卟啉单胞菌菌株33277和W83分别作为有菌毛的、非包囊的和无菌毛的、包囊的谱系的代表，以检查响应于P4的牙龈卟啉单胞菌的表型特性的改变。如图9A和9B中所示，与没有P4的生长相比，在P4 (24μM)存在的情况下，牙龈卟啉单胞菌33277或W83的生长速率没有显著改变。该观察结果表明P4作用的杀死非依赖性机制，与我们早先的发现一致，即P4抑制牙龈卟啉单胞菌中菌毛蛋白和牙龈菌蛋白酶的表达和产生。尽管牙龈卟啉单胞菌的主要生态位是龈下区域，但该生物体也定植于龈上牙菌斑和口腔粘膜表面。实际上，这些暴露于唾液流体相的部位可能代表早期的定植事件。因此，然后测试在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株附着至唾液覆盖表面的能力。在孵育24小时之后，与没有P4的对照相比，用在有P4 (24μM)的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌33277检测到附着减少大约25% (图10A)，而48小时后附着减少达到70%。还测试对照肽(具有位于P4的临近下游的11个氨基酸的肽26)在牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成中的作用，并且它没有显著影响生物膜形成。还用在有24或48 μM P4的情况下生长的细菌细胞测试对W83的单型生物膜形成的影响。W83形成生物膜的能力低于33277的能力，并且在24小时后未观察到P4对W83的生物膜形成的影响。然而，在48小时之后，对于在有24或48 μM P4的情况下生长的细菌，观察到生物膜形成减少33%和54% (图10B)。这些结果表明P4可以抑制33277和W83两者的生物膜形成，其中对33277发生更有效的抑制，这可能是由于菌毛粘附素参与33277的生物膜形成。
牙龈卟啉单胞菌和格氏链球菌双物种群落是协同口腔细菌相互作用的最佳记录实例之一。参与共粘附的表面分子被充分表征，并且包括牙龈卟啉单胞菌的FimA和Mfa1以及链球菌GAPDH和SspA/B。我们推测P4可以通过抑制fimA和mfa1的表达而阻止异型牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌生物膜的形成。为了测试这一点，首先在唾液涂覆的孔上建立格氏链球菌DL1底层，并与在有或没有P4(24μM)的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌反应。用qPCR测定与格氏链球菌DL1生物膜结合的牙龈卟啉单胞菌33277的量。在没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌的数目比在有P4的情况下生长的细菌的数目高2.5倍(图11)。不令人惊讶地，没有观察到牙龈卟啉单胞菌W83(一种无菌毛菌株)与格氏链球菌DL1生物膜的结合(数据未显示)，这进一步证实了FimA和Mfa1菌毛在牙龈卟啉单胞菌和格氏链球菌相互作用中的作用。
然后进行测试以确定P4是否可以减少建立的异型生物膜中的牙龈卟啉单胞菌细胞的数目。为了做到这一点，产生在没有P4存在的情况下生长的格氏链球菌-牙龈卟啉单胞菌的异型生物膜。在除去未结合的细菌之后，添加P4 (24μM)。在24小时间隔内收集浮游牙龈卟啉单胞菌三次，并在72小时后收集生物膜。使用qPCR测定浮游或固着牙龈卟啉单胞菌的数目。浮游牙龈卟啉单胞菌细胞的水平在P4处理后显著增加(图12A)。与此一致，异型生物膜中牙龈卟啉单胞菌的数目与浮游阶段中牙龈卟啉单胞菌的数目负相关，并且将P4引入牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌异型生物膜在72小时后使牙龈卟啉单胞菌的数目减少大约50% (图12B)。在有或没有P4的情况下，牙龈卟啉单胞菌细胞总数没有显著差异(图12C)，并且在P4存在或不存在的情况下，生长培养基中的格氏链球菌的数目没有改变(图12D)。这些数据表明P4不影响细菌活力；相反，其促进异型生物膜中牙龈卟啉单胞菌细胞的分离并抑制它们再次进入生物膜。此外，P4不影响该模型系统中的健康相关的微生物群的定植。
P4对牙龈卟啉单胞菌的细胞内侵袭的影响。牙龈卟啉单胞菌对上皮细胞的粘附主要由FimA和牙龈菌蛋白酶的粘附结构域介导。随后粘附引发宿主细胞的细菌内化。由于P4抑制FimA和牙龈菌蛋白酶产生，推测其也可抑制牙龈卟啉单胞菌侵入人口腔角质形成细胞(HOK)。进行抗生素保护测定以比较有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌33277和W83的侵袭能力。与先前的报道一致，牙龈卟啉单胞菌W83侵袭HOK的效率远低于菌株33277(图13A和13B)。此外，与没有P4的对照相比，在有P4 (24μM)的情况下生长的33277的侵袭效率降低大约4.8倍，而对于在P4 (48 µM)存在或不存在的情况下生长的W83观察到侵袭效率的5.2倍差异。
P4对牙龈菌蛋白酶酶促活性的影响。牙龈卟啉单胞菌牙龈菌蛋白酶是具有粘附和催化结构域的多功能蛋白。测试并比较在有或没有P4的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌菌株中的精氨酸特异性或赖氨酸特异性活性。使用rgpA - 、rgpB - 和kgp - 三重突变体(KDP128)作为阴性对照，并且如所预期，在突变体中未检测到精氨酸或赖氨酸特异性酶活性(图14A-14D)。与没有P4的对照相比，在有P4 (48μM)的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌33277的细胞相关的精氨酸特异性蛋白酶活性降低50%，而在相同实验条件下，在W83中发现46%降低(图14A)。P4在相似程度上抑制牙龈卟啉单胞菌33277和W83的细胞相关的赖氨酸特异性蛋白酶活性(图14B 6b)。还监测33277和W83的生长培养基中的Rgp和Kgp活性以测定分泌的牙龈菌蛋白酶的水平。在暴露于P4 (48μM)之后，牙龈卟啉单胞菌33277表现出Rgp活性的大于2.5倍降低，和Kgp活性的2倍降低(图14C和14D)。在W83暴露于P4 (48μM)之后，培养上清液中的Rgp和Kgp活性也降低50%。可以预测由P4诱导的Rgp和Kgp的显著降低的蛋白酶活性降低牙龈卟啉单胞菌的毒力潜力。
P4对IL-8水平的调节。已知牙龈卟啉单胞菌选择性损害某些细胞因子和趋化因子诸如IL-8的产生。因此，我们使用ELISA比较暴露于在有或没有P4 (48μM)的情况下生长的牙龈卟啉单胞菌的HOK的生长培养基中IL-8的积累。结果显示，牙龈卟啉单胞菌33277或W83减少Il-8积累的能力被P4显著降低(图15)。这些数据表明，P4具有调节牙龈卟啉单胞菌对先天免疫应答的操纵的潜力。
讨论
慢性和其他形式的牙周炎的治疗通常涉及物理去除牙菌斑生物膜，有时通过全身或局部施用抗生素来补充，特别是在疾病的严重和难治性表现的情况下。尽管辅助使用抗生素可以改善机械疗法的效果，但荟萃分析表明，抗生素治疗的益处必须与其副作用相平衡。关于使用抗生素的担忧包括打破宿主和共生微生物群之间的共生或互惠关系，以及出现的对抗生素的口腔细菌抗性。因此，靶向特定致病细菌，而不是非选择性抑制病原体和共生细菌，已成为维持健康口腔微生物群的战略目标。
菌毛蛋白，FimA和Mfa1，以及牙龈菌蛋白酶、RgpA、RgpB和Kgp，是牙龈卟啉单胞菌的充分确立的毒力因子。mfa1和fimA的基因存在于25年时间段内全世界分离的21种牙龈卟啉单胞菌菌株中的20种的基因组中，并且到目前为止，所有测试的牙龈卟啉菌菌株都产生膜结合并以可溶形式分泌的牙龈菌蛋白酶。FimA和Mfa1的主要作用是促进细菌附着于各种口腔表面，这导致生物膜形成和上皮细胞的内化。牙龈菌蛋白酶包括两种精氨酸和一种赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(RgpA、RgpB和Kgp)。牙龈菌蛋白酶是多功能蛋白，在营养物获取和蛋白加工中具有重要作用，并且还可以降解宿主基质蛋白和免疫效应分子。牙龈菌蛋白酶通过RgpA和Kgp的C-末端粘附区域或通过加工菌毛蛋白原(profimbrillin)在生物膜形成中起重要作用。使用牙龈菌蛋白酶突变体对鼠病变模型的动物研究发现，牙龈菌蛋白酶，特别是Kgp，是皮肤脓肿形成的主要贡献者。此外，使用相同的动物模型，用Kgp抑制剂预处理牙龈卟啉单胞菌也降低细菌毒力，这证明牙龈菌蛋白酶在牙龈卟啉单胞菌感染中的重要作用。Wilensky等人的先前研究还显示仅在用表达RgpA的牙龈卟啉单胞菌菌株口腔感染的小鼠中观察到牙槽骨损失。因此，这些牙龈卟啉单胞菌毒力因子的抑制已经成为预防和治疗牙周炎的治疗策略的焦点，并且已经发现了一长串的牙龈菌蛋白酶抑制剂，包括合成化合物、蛋白和肽以及植物提取物。尽管如此，也正在研究破坏牙龈卟啉单胞菌的其他致病过程的治疗潜力。源自海洋天然产物的几种分子被鉴定为通过抑制mfa1和fimA的表达的牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌异型群落形成的抑制剂。其他有希望的生物膜抑制剂是代表格氏链球菌SspB的结合结构域(BAR)的小肽，已显示其在小鼠模型中破坏牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌群落并防止骨损失。这些抑制剂的一个局限性是它们中的每一种仅靶向牙龈卟啉单胞菌的单一毒力因子，菌毛蛋白或牙龈菌蛋白酶。在本报道中，我们显示源自嵴链球菌ArcA的P4具有广泛得多的范围并且能够同时阻止几种毒力因子。这种作用的多重性大大增加了该肽作为能够消除差异表达毒力因子的牙龈卟啉单胞菌菌株的有效抑制剂的价值。
在该研究中，已经证明P4不影响牙龈卟啉单胞菌的生长，但显著降低单型生物膜和牙龈卟啉单胞菌-格氏链球菌异型生物膜中牙龈卟啉单胞菌细胞的数目。可以预测牙龈卟啉单胞菌细胞数目的减少导致竞争优势的丧失和多微生物协同作用的破坏。另一个重要发现是P4不仅抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成，而且还破坏建立的生物膜。尽管机制不清楚，但推测P4破坏附着并抑制分离的细菌再次进入生物膜。由于附着于口腔表面和侵袭宿主细胞的能力降低，可以从口腔中除去分散的牙龈卟啉单胞菌细胞。因此，通过P4直接靶向牙龈卟啉单胞菌附着应当稳定健康的微生物群并维持口腔微生物群和宿主免疫系统之间的内稳态，因此，其可足以预防和治疗牙龈卟啉单胞菌相关的牙周炎。
已报道，IL1α、IL-β、IL6、IL-8、IL-10和NF-κB的表达在感染牙龈卟啉单胞菌的口腔上皮细胞中被调节。与诱导牙龈上皮细胞中IL-8的表达的许多牙周定植者相反，牙龈卟啉单胞菌可以抑制IL-8产生，这表明牙龈卟啉单胞菌在调节上皮细胞趋化因子反应中的独特作用。牙龈卟啉单胞菌调节IL-8水平的能力可以在引发牙周炎中起关键作用，因为该趋化因子通过维持嗜中性粒细胞募集至牙龈缝隙中的梯度来参与维持健康的牙周组织。P4肽减弱牙龈卟啉单胞菌减少上皮细胞培养上清液中IL-8的积累的能力，表明P4能够部分恢复牙龈卟啉单胞菌对宿主免疫的损害，这可能促进维持牙周组织内稳态。
总之，已经评价P4在牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成、侵袭和牙龈菌蛋白酶活性中的抑制作用。证明该肽的独特方面是其有效地降低牙龈卟啉单胞菌的所有这些毒力相关的特性。P4从牙菌斑中选择性分散牙龈卟啉单胞菌并减弱其毒力潜力的能力使其成为控制微生物群落组成和维持健康微生物群的有吸引力的试剂。
工作实施例4：P4的细胞毒性和稳定性
为了检查P4的细胞毒性作用，通过Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒测定HOK的质膜损伤。将HOK以1 × 105/孔的密度接种至6孔板中，并在补充有抗生素(100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)和10%胎牛血清的口腔角质形成细胞培养基中在37℃下在含5% CO2的加湿室中培养24小时。然后将细胞与补充有P4 (50或200μM)的生长培养基一起孵育48小时。收集生长培养基用于根据制造商的说明书(Thermo Scientific)进行LDH细胞毒性测定。为了测量P4对HOK凋亡的影响，收获HOK并用膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒(Invitrogen)染色，所述膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒(Invitrogen)能够染色凋亡细胞和死细胞。进行流式细胞术分析以定量凋亡细胞和死细胞(膜联蛋白V+/PI+)。如图9A和9B中所示，浓度高达200μM (比使fimA和rpg的表达抑制50%所需的浓度高大约200倍，ID50)的P4不诱导HOK的细胞膜损伤和凋亡。
为了测定溶液中的P4稳定性，将P4在H2O、PBS和全唾液中在37℃下孵育24小时。使用LC-MS/MS分析比较每个样品中的P4。简而言之，将2 μM P4注射在C18纳米柱上，并用5-20%的0.1% FA/乙腈中运行30分钟。在Orbitrap LTQ XL (Thermo)上以正模式获取MS谱。如表4中所示，在孵育24小时后，在H2O和PBS中的P4稳定性没有受影响，但是在0、0.5、1、2、4和24小时后，在稀释的全唾液(PBS：唾液，1：1)中孵育P4后，检测到信号的逐渐降低，并且在48小时后信号完全消失至背景噪声。应该注意的是，这些结果仅显示这些溶液中P4的相对水平，并且我们不能得出结论，只有十分之一的P4是未降解的。然而，在孵育24小时后观察到信号，表明P4可以在一定水平上在唾液中维持至少24小时。
表4
用以下处理P4 处理时间(小时) 331.45 m/z峰的信号强度
H<sub>2</sub>O 0 4.8 × 10<sup>6</sup> ± 4.5 × 10<sup>5</sup>
H<sub>2</sub>O 24 2.1 × 10<sup>6</sup> ± 1.3 × 10<sup>5</sup>
PBS 24 4.6 × 10<sup>6</sup> ± 4.2 × 10<sup>5</sup>
唾液 0 3.9 × 10<sup>6</sup> ± 3.1 × 10<sup>5</sup>
唾液 0.5 3.6 × 10<sup>6</sup> ± 4.0 × 10<sup>5</sup>
唾液 1 2.4 × 10<sup>6</sup> ± 2.2 × 10<sup>5</sup>
唾液 2 1.7 × 10<sup>6</sup> ± 4.2 × 10<sup>5</sup>
唾液 4 8.8 × 10<sup>5</sup> ± 2.7 × 10<sup>4</sup>
唾液 24 4.2 × 10<sup>5</sup> ± 3.9 × 10<sup>4</sup>
唾液 48 6.0 × 10<sup>3</sup> ± 4.1 × 10<sup>2</sup>
I. 实施方案
除了上面描述的或当前请求保护的任何内容以外，特别考虑可以请求保护任何以下实施方案。实施方案1：结合牙龈卟啉单胞菌表面蛋白的分离的肽，所述肽具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的序列。实施方案2：用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物，所述组合物包含化合物，所述化合物包含实施方案1的肽。实施方案3：化合物在制备用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物中的用途，其中所述化合物包含实施方案1的肽。实施方案4：实施方案2-3中的任一项，其中配制所述药物组合物用于局部施用。实施方案5：实施方案2-4中的任一项，其中所述药物组合物是洁齿剂、经颊制剂、舌下制剂、经口软膏剂、经口霜剂、经口糊剂、经口乳剂和咀嚼胶中的至少一种。实施方案6：实施方案2-5中的任一项，其中所述肽以治疗或预防有此需要的受试者中的牙菌斑相关病况或症状的治疗有效量存在。实施方案7：实施方案2-6中的任一项，其中所述药物组合物是洁齿剂。实施方案8：实施方案2-7中的任一项，其中所述药物组合物包含防腐剂。实施方案9：实施方案2-8中的任一项，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。实施方案10：实施方案2-9中的任一项，其中所述药物组合物包含选自以下的药学上可接受的载体：媒介物、助剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体、辅助剂、着色剂和调味剂。实施方案11：治疗或预防受试者中的牙菌斑相关病况或症状的方法，所述方法包括向受试者的牙齿和/或牙龈表面局部施用治疗有效量的包含实施方案1的肽的化合物。实施方案12：实施方案11的方法，其中所述受试者需要治疗或预防性治疗牙菌斑相关病况或症状。实施方案13：实施方案2-12中的任一项，其中所述牙菌斑相关病况或症状选自：龋齿、牙龈炎、牙垢、牙周炎、动脉粥样硬化、人免疫缺陷病毒(HIV)疾病、牙齿脱落、冠状动脉疾病、中风、早产、低出生体重、糖尿病控制不佳、呼吸系统问题、类风湿性关节炎和哮喘。实施方案14：降低在表面上形成含有牙龈卟啉单胞菌群体的生物膜的可能性的方法，所述方法包括将所述表面暴露于有效浓度的包含实施方案1的肽的化合物。实施方案15：降低细菌中细菌毒力基因或生物膜相关基因的表达的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于有效浓度的化合物，所述化合物包含具有与SEQID NO:3-7中的至少一个具有至少60%同一性的序列的肽，其中所述细菌基因选自：菌毛蛋白基因、fimA、牙龈菌蛋白酶基因、mfa1、rgpA/B、rgpA和kgp。实施方案16：实施方案15的方法，其中所述细菌基因是fimA。实施方案17：实施方案15的方法，其中所述细菌是牙龈卟啉单胞菌。实施方案18：实施方案15-17中的任一项，其中所述方法在体外进行。实施方案19：实施方案15-18中的任一项，其中所述暴露包括接触。实施方案20：实施方案15-19中的任一项，其中所述暴露包括在有此需要的受试者中暴露细菌。实施方案21：编码实施方案1的肽的核酸。实施方案22：与实施方案23的核酸互补的核酸。实施方案23：包含实施方案22-24中的任一项的核酸的细胞。实施方案24：包含实施方案22-25中的任一项的核酸的载体。实施方案25：实施方案1-26中的任一项，其中所述肽与以下中的至少一种具有至少60%同一性：IRGRETKK、NHMFADTRNRE、VYNREEDTRIEGGDEL、NIFKKNVGFKK和ELVRGRGGPRCMSMPF。实施方案26：实施方案1-25中的任一项，其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。实施方案27：实施方案1-26中的任一项，其中所述肽是SEQ ID NO:1的位置208-409的片段。实施方案28：实施方案1-27中的任一项，其中所述肽长度不超过202个氨基酸。实施方案29：实施方案1-28中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅包含如表1中所示的示例性保守取代。实施方案30：实施方案1-29中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅包含如表1中所示的优选的保守取代。实施方案31：实施方案1-30中的任一项，其中所述肽具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少70、75、80、85、90、95、99或100%同一性的序列。实施方案32：实施方案1-31中的任一项，其中所述肽具有与SEQ IDNO:2-7中的至少一个具有至少90、95、99或100%同一性的序列。实施方案33：实施方案1-32中的任一项，其中所述肽与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性，且其中所述化合物在N-端或C-端末端中的至少一个上包含侧接所述肽的不超过4-8个氨基酸残基。实施方案34：实施方案2-33中的任一项，其中所述化合物由所述肽组成。实施方案35：实施方案1-34中的任一项，其中所述肽长度不超过200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基长。实施方案36：实施方案1-35中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有保守取代。实施方案37：实施方案1-36中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有表1中所示的示例性取代。实施方案38：实施方案1-37中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有表1中所示的优选的取代。实施方案39：实施方案1-38中的任一项，其中所述肽由具有NIFKKNVGFKK的序列的肽组成。
结论
应当理解，本发明的公开的实施方案的任何给定要素可在单一结构、单一步骤、单一物质等中体现。类似地，所公开的实施方案的给定要素可以在多个结构、步骤、物质等中体现。
前面的说明书说明和描述本公开的过程、机器、制造、物质组合物和其他教导。另外，本公开仅显示并描述所公开的过程、机器、制造、物质组合物和其他教导的某些实施方案，但是，如上所述，应当理解，本公开的教导能够用于各种其他组合、修改和环境，且能够在如本文表达的教导的范围内进行改变或修改，其与相关领域普通技术人员的技能和/或知识相称。上文描述的实施方案还旨在解释已知的实践本公开的过程、机器、制造、物质组合物和其他教导的某些最佳模式，并使得本领域其他技术人员能够在这些或其他实施方案中以由特定应用或用途所需的各种修改利用本公开的教导。因此，本公开的过程、机器、制造、物质组合物和其他教导不旨在限制本文公开的确切实施方案和实施例。此处的任何章节标题仅提供用于与37 C.F.R. §1.77的建议一致或以其他方式提供组织队列。这些标题不应限制或表征本文所述的一个或多个发明。

Claims (36)

1.结合牙龈卟啉单胞菌表面蛋白的分离的肽，所述肽具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少60%同一性的序列。
2.用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物，所述组合物包含化合物，所述化合物包含权利要求1的肽。
3.化合物在制备用于治疗或预防牙菌斑相关病况或症状的药物组合物中的用途，其中所述化合物包含权利要求1的肽。
4.权利要求2的药物组合物，其中配制所述药物组合物用于局部施用。
5.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物是洁齿剂、经颊制剂、舌下制剂、经口软膏剂、经口霜剂、经口糊剂、经口乳剂和咀嚼胶中的至少一种。
6.权利要求2的药物组合物，其中所述肽以治疗或预防有此需要的受试者中的牙菌斑相关病况或症状的治疗有效量存在。
7.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物是洁齿剂。
8.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物包含防腐剂。
9.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
10.权利要求2的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自以下的药学上可接受的载体：媒介物、助剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体、辅助剂、着色剂和调味剂。
11.治疗或预防受试者中的牙菌斑相关病况或症状的方法，所述方法包括向所述受试者的牙齿和/或牙龈表面局部施用治疗有效量的包含权利要求1的肽的化合物。
12.权利要求11的方法，其中所述肽已经纯化。
13.权利要求11的方法，其中所述受试者需要治疗或预防性治疗牙菌斑相关病况或症状。
14.权利要求11的方法，其中所述牙菌斑相关病况或症状选自：龋齿、牙龈炎、牙垢、牙周炎、动脉粥样硬化、人免疫缺陷病毒(HIV)疾病、牙齿脱落、冠状动脉疾病、中风、早产、低出生体重、糖尿病控制不佳、呼吸系统问题、类风湿性关节炎和哮喘。
15.降低在表面上形成含有牙龈卟啉单胞菌群体的生物膜的可能性的方法，所述方法包括将所述表面暴露于有效浓度的包含权利要求1的肽的化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述方法在体外进行。
17.权利要求15的方法，其中所述暴露包括接触。
18.权利要求15的方法，其中所述暴露包括在有此需要的受试者中暴露细菌。
19.编码权利要求1的肽的核酸。
20.与权利要求19的核酸互补的核酸。
21.包含权利要求19的核酸的细胞。
22.包含权利要求19的核酸的载体。
23.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽没有显著的精氨酸脱亚胺酶活性。
24.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽是SEQ ID NO:1的位置208-409的片段。
25.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽长度不超过202个氨基酸。
26.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅包含如表1中所示的示例性保守取代。
27.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅包含如表1中所示的优选的保守取代。
28.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少70、75、80、85、90、95、99或100%同一性的序列。
29.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽具有与SEQ ID NO:2-7中的至少一个具有至少90、95、99或100%同一性的序列。
30.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性，且其中所述化合物在N-端或C-端末端中的至少一个上包含侧接所述肽的不超过4-8个氨基酸残基。
31.权利要求2-22中的任一项，其中所述化合物由所述肽组成。
32.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽长度不超过200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基长。
33.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有保守取代。
34.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有表1中所示的示例性取代。
35.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽与所述SEQ ID NO:2-7中的至少一个相比仅具有表1中所示的优选的取代。
36.权利要求1-22中的任一项，其中所述肽由具有SEQ ID NO:6的序列的肽组成。
CN201780073956.6A 2016-09-29 2017-09-13 细菌抑制剂 Active CN110167955B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662401572P 2016-09-29 2016-09-29
US62/401572 2016-09-29
US201662404690P 2016-10-05 2016-10-05
US62/404690 2016-10-05
PCT/US2017/051352 WO2018063801A1 (en) 2016-09-29 2017-09-13 Bacterial inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110167955A true CN110167955A (zh) 2019-08-23
CN110167955B CN110167955B (zh) 2024-04-02

Family

ID=61760819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780073956.6A Active CN110167955B (zh) 2016-09-29 2017-09-13 细菌抑制剂

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11504414B2 (zh)
EP (1) EP3519429B1 (zh)
CN (1) CN110167955B (zh)
BR (1) BR112019005935A2 (zh)
ES (1) ES2905716T3 (zh)
MX (1) MX2019003475A (zh)
WO (1) WO2018063801A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114469863A (zh) * 2021-11-26 2022-05-13 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN116602951A (zh) * 2023-06-20 2023-08-18 华熙生物科技股份有限公司 γ-氨基丁酸在预防和/或减轻口腔炎症中的用途及实现该用途的方法
CN116622548A (zh) * 2023-03-31 2023-08-22 吉林农业大学 一株能够预防和或治疗牙周炎的嵴链球菌及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2463181B (en) 2007-05-14 2013-03-27 Univ New York State Res Found Induction of a physiological dispersion response in bacterial cells in a biofilm
WO2023182185A1 (ja) * 2022-03-25 2023-09-28 メスキュージェナシス株式会社 ジンジパインに対して親和性及び／又は阻害能を有するペプチド及びその使用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029870A1 (en) * 1997-12-10 1999-06-17 Csl Limited Porphorymonas gingivalis polypeptides and nucleotides
US20040005276A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-08 Reynolds Eric Charles Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis associated with porphyromonas gingivalis
CN1518595A (zh) * 2000-11-28 2004-08-04 凤凰药理学公司 修饰的精氨酸脱亚胺酶
WO2009026615A1 (en) * 2007-08-24 2009-03-05 University Of Wollongong Group a streptococcus pharmaceutical compositions and methods thereof
US20150366792A1 (en) * 2013-02-14 2015-12-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Probiotic arginolytic oral compositions and methods of making and using probiotic arginolytic oral compositions
CN110305193A (zh) * 2019-07-18 2019-10-08 河南科技大学 一种抗牙龈卟啉单胞菌多肽及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2915382T3 (es) * 2014-09-16 2022-06-22 Polaris Group Arginina desiminasa con reactividad cruzada reducida hacia anticuerpos ADI - PEG 20 para el tratamiento del cáncer

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040005276A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-08 Reynolds Eric Charles Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis associated with porphyromonas gingivalis
WO1999029870A1 (en) * 1997-12-10 1999-06-17 Csl Limited Porphorymonas gingivalis polypeptides and nucleotides
EP2256205A1 (en) * 1997-12-10 2010-12-01 CSL Limited Porphorymonas gingivalis polypeptides and polynucleotides
CN1518595A (zh) * 2000-11-28 2004-08-04 凤凰药理学公司 修饰的精氨酸脱亚胺酶
WO2009026615A1 (en) * 2007-08-24 2009-03-05 University Of Wollongong Group a streptococcus pharmaceutical compositions and methods thereof
US20110250221A1 (en) * 2007-08-24 2011-10-13 University Of Wollongong Group A Streptococcus Pharmaceutical Compositions and Methods Thereof
US20150366792A1 (en) * 2013-02-14 2015-12-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Probiotic arginolytic oral compositions and methods of making and using probiotic arginolytic oral compositions
CN110305193A (zh) * 2019-07-18 2019-10-08 河南科技大学 一种抗牙龈卟啉单胞菌多肽及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER A. B. ET AL: "A streptococcal effector protein that inhibits Porphyromonas gingivalis biofilm development", 《MICROBIOLOGY》 *
WANG BY ET AL: "Negative correlation of distributions of Streptococcus cristatus and Porphyromonas gingivalis in subgingival plaque", 《J CLIN MICROBIOL》 *
WU J ET AL: "Role of arginine deiminase of Streptococcus cristatus in Porphyromonas gingivalis colonization", 《ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER》 *
XIE H. ET AL: "Identification of a signalling molecule involved in bacterial intergeneric communication", 《MICROBIOLOGY》 *
XIE H. ET AL: "Streptococcus cristatus ArcA Interferes with Porphyromonus gingivalis Pathogenicity in Mice", 《JOURNAL OF PERIODONTAL RESEARCH》 *
韩伶娜，潘亚萍: "牙菌斑链球菌与牙龈卟啉单孢菌相互作用的研究", 《中国微生态学杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114469863A (zh) * 2021-11-26 2022-05-13 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN114469863B (zh) * 2021-11-26 2023-09-26 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN116622548A (zh) * 2023-03-31 2023-08-22 吉林农业大学 一株能够预防和或治疗牙周炎的嵴链球菌及其应用
CN116622548B (zh) * 2023-03-31 2024-02-09 吉林农业大学 一株能够预防和或治疗牙周炎的嵴链球菌及其应用
CN116602951A (zh) * 2023-06-20 2023-08-18 华熙生物科技股份有限公司 γ-氨基丁酸在预防和/或减轻口腔炎症中的用途及实现该用途的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2905716T3 (es) 2022-04-11
BR112019005935A2 (pt) 2019-06-11
US20190209646A1 (en) 2019-07-11
EP3519429A4 (en) 2020-05-20
EP3519429B1 (en) 2021-11-10
CN110167955B (zh) 2024-04-02
WO2018063801A1 (en) 2018-04-05
US11504414B2 (en) 2022-11-22
EP3519429A1 (en) 2019-08-07
MX2019003475A (es) 2019-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110167955A (zh) 细菌抑制剂
US9308227B2 (en) Lactic acid bacteria and compositions containing them against bacterial colds
US7427408B2 (en) Quorum sensing and biofilm formation
CN101163788B (zh) 皮肤治疗组合物
EP3471836B1 (en) Dermatological preparations for maintaining and/or restoring healthy skin microbiota
KR101899552B1 (ko) 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물
RU2650866C2 (ru) Противокариесные композиции и пробиотики/пребиотики
US8057790B2 (en) Treatment of malodour
KR20090023626A (ko) 프로바이오틱 스트레인 및 그로부터 유도된 항균 펩티드
JP4932731B2 (ja) シグナルペプチド、核酸分子及び治療方法
KR20190084097A (ko) 세균의 폴레이트 수송의 약화에 의한 세균 병독성의 약독화
JP2015203030A (ja) プロバイオティクス菌株を用いてヒアルロン酸の分泌を増強する方法
US20150238543A1 (en) Compositions and method for treating neutralizing microorganisms
FR2695392A1 (fr) Peptides possédant notamment des propriétés antibactériennes, leur procédé d&#39;obtention, et leurs applications biologiques.
ES2847273T3 (es) Cepa antimicrobiana
US20210122791A1 (en) Antimicrobial peptide variants and uses thereof
RU2687969C1 (ru) Антимикробное средство
TW202212565A (zh) 新穎貝萊斯芽胞桿菌菌株及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant