CN110157739A - 一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法 - Google Patents

一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，所述方法中使用到淋巴瘤Daudi细胞。本方法提高了标志物表达量，使表达标志物的细胞在混合细胞总数中所占比重高于普通转染方法的2倍左右。

Description

一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞 中所占比例的方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，涉及肿瘤细胞种类的选择，尤其是一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法。
背景技术
在实验中需要用到带标记的肿瘤细胞时，通常会通过慢病毒转染后加以培养以获得能表达标记物的肿瘤细胞，一些没有被转染的细胞和被转染的细胞混合在一起培养，因为没有被转染的细胞分裂增殖比被病毒侵染的细胞分裂增殖快，所以往往很难把握住培养的时间，培养时间过短，达到一定数量的细胞就需要更多的病毒转染，很浪费昂贵的病毒。如果培养时间过长，所得到的细胞里面被转染的细胞所占比重就小，虽整体然数量达到了，但标记物的表达量却不合格。
具体地，现有技术中存在如下缺陷：
1、现有转染方法培养后所得到的细胞中，标记物表达量往往很难达到实验所需标准，
2、现在没有一种方法能够实现一次转染后就能保证转染效率高，并且标记物表达量所占比例大；
3、目前也没有方法能使转染Daudi细胞后仅目标细胞处于越长越多、其他杂细胞越长越少；
4、多次转染意味着需要很久的时间，通常是好几周甚至数月才能完成该实验部分，不仅仅浪费时间，其浪费的试剂耗材和人力是得不偿失的。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，该方法提高了标志物表达量，使表达标志物的细胞在混合细胞总数中所占比重高于普通转染方法的2倍左右。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，所述方法中使用到淋巴瘤Daudi细胞。
而且，所述方法中先在孔板里集中转染，待荧光显现后转移到培养瓶中转染扩增。
而且，所述孔板为24孔板。
而且，所述方法中需要使用筛选目的细胞的操作，筛选目的细胞时用于筛选目的细胞的试剂为嘌呤霉素，使用时其添加的终浓度为0.8ug/ml。
而且，所述方法中需要使用转染操作，转染操作时所选用的慢病毒的TU大于5x108个/ml，设置MOI等于80。
而且，步骤如下：
⑴培养淋巴瘤Daudi细胞，至培养密度为5x105个/ml，使用加入1％双抗的10％胎牛血清的配制培养基，置于CO2浓度5％、温度37℃的培养箱中培养至活率大于95％、细胞总量大于1x106个/ml，备用；
⑵在生物安全柜中转染，取TU大于5x108个/ml的慢病毒进行转染，转染体系设置200ul，使用24孔板进行转染，取6个中央孔区，每孔细胞量为5x105个，转染使用未添加血清的配制培养基200ul，24小时后换液，添加10％胎牛血清的配制培养基，隔天换一次液，培养3天；
⑶取换液培养3天后的淋巴瘤Daudi细胞在荧光显微镜下观察荧光强度，目测转染效率大于30±1％，计数后按照5x105个/ml转入T25培养瓶中，添加嘌呤霉素0.8ug/ml，隔天换液并保持生长密度5x105个/ml；连续培养7-10天；
⑷每次换液前先在荧光显微镜下观察细胞的荧光变化，目测转染效率大于80％、荧光表达的细胞占总细胞量90％以上后，得处理后混合细胞，选择冻存或使用；
其中，所述配制培养基的配方如下：
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法是对没被病毒转染细胞抑制分裂，不让其增殖或杀死，而对被病毒转染的细胞却没有任何影响，以此达到提高被转染细胞在整体数量中的比例，使单位数量的混合细胞内被转染细胞所表达的标记达到实验所需标准。
2、本发明方法实现了一次转染淋巴瘤Daudi细胞后能多次使用，不必再多次转染淋巴瘤Daudi细胞仅够一次实验使用。
3、本发明方法的转染效率能达到60％-80％，高于普通方法20-30％左右。
4、本发明方法能够剔除没被转染到的无关细胞，仅保留目的细胞，使细胞纯度更高。
5、本发明方法提高了标志物表达量，使表达标志物的细胞在混合细胞总数中所占比重高于普通转染方法的2倍左右。
附图说明
图1为本发明中使用本发明方法和普通方法转染淋巴瘤Daudi细胞一周后的荧光显微镜下细胞的荧光变化图；
图2为本发明中普通方法的流式检测结果图，通过流式检测淋巴瘤Daudii细胞的红色荧光发现，在同步转染到第6天时，普通方法的转染效率为0.8％；
图3为本发明中本发明方法的流式检测结果图，通过流式检测淋巴瘤Daudii细胞的红色荧光发现，在同步转染到第6天时，本发明方法为48.3％。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，所述方法中使用到淋巴瘤Daudi细胞。
较优地，所述方法中先在孔板里集中转染，待荧光显现后转移到培养瓶中转染扩增。
较优地，所述孔板为24孔板。
较优地，所述方法中需要使用筛选目的细胞的操作，筛选目的细胞时用于筛选目的细胞的试剂为嘌呤霉素，使用时其添加的终浓度为0.8ug/ml。
较优地，所述方法中需要使用转染操作，转染操作时所选用的慢病毒的TU大于5x108个/ml，设置MOI等于80。
较优地，步骤如下：
⑴培养淋巴瘤Daudi细胞，至培养密度为5x105个/ml，使用加入1％双抗的10％胎牛血清的配制培养基，置于CO2浓度5％、温度37℃的培养箱中培养至活率大于95％、细胞总量大于1x106个/ml，备用；
⑵在生物安全柜中转染，取TU大于5x108个/ml的慢病毒进行转染，转染体系设置200ul，使用24孔板进行转染，取6个中央孔区，每孔细胞量为5x105个，转染使用未添加血清的配制培养基200ul，24小时后换液，添加10％胎牛血清的配制培养基，隔天换一次液，培养3天；
⑶取换液培养3天后的淋巴瘤Daudi细胞在荧光显微镜下观察荧光强度，目测转染效率大于30±1％，计数后按照5x105个/ml转入T25培养瓶中，添加嘌呤霉素0.8ug/ml，隔天换液并保持生长密度5x105个/ml；连续培养7-10天；
⑷每次换液前先在荧光显微镜下观察细胞的荧光变化，目测转染效率大于80％、荧光表达的细胞占总细胞量90％以上后，得处理后混合细胞，选择冻存或使用；
其中，所述配制培养基的配方如下：
本发明的相关检测：
1、使用本发明方法和普通方法转染淋巴瘤Daudi细胞一周后的荧光显微镜下细胞的荧光变化
普通方法的步骤可以如下：
1)培养淋巴瘤Daudi细胞，培养密度度2-10x105个/ml，使用加入1％双抗的10％基础培养基，置于CO2浓度5％，温度37℃的培养箱中培养至活率大于90％备用。
2)在离心机中完成转染，取TU大于1x108个/ml的慢病毒进行转染，转染体系设置100ul，使用96孔板进行转染，每孔细胞量为1-10-x105个，转染使用未添加血清的基础培养基100ul，4小时后补等体积液，添加20％胎牛血清的基础培养基，加入白介素2、白介素15，隔天换一次液，培养2周。
3)每次换液前先在荧光显微镜下观察细胞的荧光变化，目测转染效率大于30％，荧光表达的细胞占总细胞量30％以上后使用。
对比：普通方法需要在离心机中完成转染，本方法只需添加病毒后正常培养即可，没有该繁琐步骤。
普通方法需取TU为1x108个/ml的慢病毒进行转染，本方法可取TU大于5x108个/ml病毒，本方法能保证细胞活率，受病毒伤害小。
普通方法转染体系设置100ul，使用96孔板进行转染，本方法转染体系设置200ul，使用24孔板进行转染，产量更大，更高效。
普通方法转染效率低下，产量低下，即转即用，本方法转染效率高，能冻存备用，可以一次转染数次使用。
结果如图1所示，从图1中可以看出，两种方法同步筛选一个周以后，本发明方法其筛选效果就凸显出来，图中所看到的红色光点是淋巴瘤Daudi细胞的(RFP)红色荧光，红色荧光越多说明其目的细胞越多，表示慢病毒表达得越多，则占细胞总量的比例越大。
2、流式细胞仪检测RFP的方法：
a)1.5毫升离心管取样本细胞1x106个，300G离心5分钟，弃上清；
b)每管加入1mLPBS洗涤，旋涡振荡后300G离心5分钟，弃上清
c)加入鞘液500微升重悬，放入流式细胞仪细胞样品检测位置
d)流式细胞仪选择RFP检测选项，自动打印结果
流式结果图如图2和图3所示，从图2和图3可以看出，通过流式检测淋巴瘤Daudii细胞的红色荧光发现，在同步转染到第6天时，普通方法的转染效率为0.8％，而本发明方法为48.3％。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (6)

1.一种能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：所述方法中使用到淋巴瘤Daudi细胞。
2.根据权利要求1所述的能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：所述方法中先在孔板里集中转染，待荧光显现后转移到培养瓶中转染扩增。
3.根据权利要求2所述的能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：所述孔板为24孔板。
4.根据权利要求1所述的能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：所述方法中需要使用筛选目的细胞的操作，筛选目的细胞时用于筛选目的细胞的试剂为嘌呤霉素，使用时其添加的终浓度为0.8ug/ml。
5.根据权利要求1所述的能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：所述方法中需要使用转染操作，转染操作时所选用的慢病毒的TU大于5x108个/ml，设置MOI等于80。
6.根据权利要求1至5任一项所述的能提高淋巴瘤Daudi细胞转染标记物表达量在混合细胞中所占比例的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴培养淋巴瘤Daudi细胞，至培养密度为5x105个/ml，使用加入1％双抗的10％胎牛血清的配制培养基，置于CO2浓度5％、温度37℃的培养箱中培养至活率大于95％、细胞总量大于1x106个/ml，备用；
⑵在生物安全柜中转染，取TU大于5x108个/ml的慢病毒进行转染，转染体系设置200ul，使用24孔板进行转染，取6个中央孔区，每孔细胞量为5x105个，转染使用未添加血清的配制培养基200ul，24小时后换液，添加10％胎牛血清的配制培养基，隔天换一次液，培养3天；
⑶取换液培养3天后的淋巴瘤Daudi细胞在荧光显微镜下观察荧光强度，目测转染效率大于30±1％，计数后按照5x105个/ml转入T25培养瓶中，添加嘌呤霉素0.8ug/ml，隔天换液并保持生长密度5x105个/ml；连续培养7-10天；
⑷每次换液前先在荧光显微镜下观察细胞的荧光变化，目测转染效率大于80％、荧光表达的细胞占总细胞量90％以上后，得处理后混合细胞，选择冻存或使用；
其中，所述配制培养基的配方如下：
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