CN110157696A

CN110157696A - α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110157696A
Application number: CN201910369472.7A
Authority: CN
Inventors: 韩秀林; 李铭刚; 赵江源; 蒋明星; 包崇卯; 李芮; 刘兴; 艾黎; 文孟良
Original assignee: Yunnan Yunuo Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Yunnan Yunuo Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-05-05
Also published as: CN110157696B

Abstract

本发明涉及基因工程技术及生物医药领域，公开了一种α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用。具体地，本发明提供了一种α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因，含有该基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，及其在制备人参皂苷Rd中的应用。本发明所述的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶能够较高效地催化人参皂苷Rc反应制备人参皂苷Rd，酶活性较高；在较宽的pH和温度范围内均能表现出较高的活性，稳定性强。而且本发明的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖和葡萄糖具有较高的耐受性，有利于和其他的人参皂苷水解酶进行协同作用。

Description

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术及生物医药领域，具体涉及α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用，尤其是在酶转化人参皂苷Rc制备人参皂苷Rd中的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是五加科植物人参属的根，Panax中文意为长寿、包治百病，在中国、韩国、日本以及其他亚洲国家被奉为一种灵丹妙药使用已有两千多年历史。中国现存最早的药学专著《神农本草经》记载人参能强身益智，名目安神，止惊悸，久服延年益寿。现代药理学证明人参中的活性成分包括皂苷类、多糖、多肽、脂肪酸等，其中皂苷类是最主要的活性成分之一。

研究表明人参皂苷生物学与药理学活性受皂苷元上糖基化位点、数量以及种类的影响。一些具有高含量的糖基化皂苷，如人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Re和Rg₁，在小肠内吸收非常微弱，然而去糖基化的稀有人参皂苷，如人参皂苷Rd、F2、Compound O(C-O)、Compound Y(C-Y)、C-Mc和C-K则更容易被吸收到血液系统中发挥其活性作用。由于稀有人参皂苷的高活性作用以及在植物中含量低的原因使得其成为了人参研究领域的热点内容。人参皂苷Rd作为Rb₁、Rb₂和Rc口服后经肠道酶代谢的主要产物之一，除了具有保护心脑血管、保护神经，免疫活性刺激等作用之外，还是转化为高活性稀有人参皂苷C-K的前体化合物之一。因此，增加人参皂苷Rd的得率是稀有人参皂苷在药物制剂研究与应用等方面的基础。

其中人参皂苷Rc是丰度最高的皂苷成分之一，在人参中占总皂苷的3-16％，因此可利用人参皂苷Rc生产稀有皂苷，提高人参皂苷在肠道中的吸收率，对减少用药剂量及皂苷高效利用有重要意义。切掉人参皂苷Rc的C20位α-L-阿拉伯呋喃糖即可得到人参皂苷Rd，如图1所示。此外，人参皂苷Rb₁在人参中的含量高于其他糖基化人参皂苷，所以对β-D-葡萄糖苷酶的研究也多于其他的人参皂苷水解酶。但是根据人参皂苷Rb₁糖基化的特点，β-D-葡萄糖苷酶与其进行反应时有可能发生转化产物不专一的现象，这使得人参皂苷Rd的产率偏低。而且，现有的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖和葡萄糖的耐受性均较差。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的Rd产率低和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对糖的耐受性较差的问题，提供α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用。

相对于β-D-葡萄糖苷酶而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可以特异性地水解人参皂苷Rc的C-20位的α-L-阿拉伯呋喃糖得到人参皂苷Rd，从而减少产物不专一的现象。因此，本发明的发明人致力于开发新的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，经研究得到一种能够较高产率酶解人参皂苷Rc获得人参皂苷Rd、且对阿拉伯糖和葡萄糖的耐受性均较高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。也就是说，为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，其为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

本发明第二方面提供了编码第一方面所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。

第三方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法，该方法包括：将编码所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因插入载体，用所得重组载体转化表达宿主，并诱导表达宿主表达所述基因。

第四方面，本发明提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一项在制备人参皂苷Rd中的应用。

第六方面，本发明提供了一种制备人参皂苷Rd的方法，该方法包括：将含有人参皂苷Rc的原料与酶进行接触，其中，所述酶含有第一方面所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

通过上述技术方案，本发明所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶能够较高效地催化人参皂苷Rc反应制备人参皂苷Rd，酶活性较高；在较宽的pH和温度范围内均能表现出较高的活性，稳定性强。而且本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖和葡萄糖具有较高的耐受性，有利于和其他的人参皂苷水解酶进行协同作用。

附图说明

图1为本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶转化人参皂苷Rc获得人参皂苷Rd的技术图；

图2为本发明的实施例2获得的酶液的SDS-PAGE分析结果；

图3为本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH和在不同pH的缓冲液中的稳定性测定结果；

图4为本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度测定结果；

图5为本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在不同温度下的稳定性测试结果；

图6为本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对不同浓度的阿拉伯糖和葡萄糖耐受性的测定结果图；

图7为人参皂苷Rc与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶混合孵化后生成人参皂苷Rd的TLC检测结果；

图8为人参皂苷Rc与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶混合孵化后生成人参皂苷Rd的HPLC检测结果。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位(U)表示，本发明中酶活力单位的定义是：在最适反应条件(pH5.0，40℃)下，以对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。

第一方面，本发明提供了一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，其中，该α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶为(a)或(b)：

(a)由以下SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。其中，酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质的底物转化率与(a)的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

SEQ ID NO：1：

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

如前所述，本发明提供的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明提供的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

标签	残基数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR(SEQ ID NO：3)
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH(SEQ ID NO：4)
			FLAG	8	DYKDDDDK(SEQ ID NO：5)
Strep-tag II	8	WSHPQFEK(SEQ ID NO：6)
			c-myc	10	EQKLISEEDL(SEQ ID NO：7)

上述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖和葡萄糖具有较高的耐受性，因此，本发明还提供了所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在含有阿拉伯糖和葡萄糖的体系中催化人参皂苷Rc转化为人参皂苷Rd中的应用。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。相应地，所述基因可以为如下的(1)或(2)：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码的酶的酶活性不变的DNA分子。其中，所述严格条件可以为：在6×SCC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SCC，0.1％SDS和1×SCC，0.1％SDS各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(2)编码的蛋白质的底物转化率与(1)编码的蛋白质的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

SEQ ID NO：2：

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本发明公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5′端和/或3′端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了制备所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法，其特征在于，该方法包括：将编码所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因(优选SEQ ID NO：2所示的DNA片段)插入载体，用所得重组载体转化表达宿主，并诱导表达宿主表达所述基因。

第四方面，本发明还提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pET28a(+)质粒。重组载体的构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalI、BamHI、EcoRI等；对于pPICZaA，可用NdeI、NheI、EcoRI、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用EcoRI和HindIII双酶切pET28a(+)及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

在本发明中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明所述基因相连获得。优选地，所述表达盒还包括启动子和/或增强子。

在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。在没有特别说明的情况下，本发明的转基因细胞系不具有全能性。

本发明提供的重组菌可以含有本发明提供的重组载体。本发明提供的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还可以通过以下方法制得：培养本发明提供的重组菌，诱导编码所述酶的基因的表达；分离提纯所表达的酶。

在本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中以获得重组菌，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21。

在本发明中，相对于每毫克的人参皂苷Rc，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的用量优选为2-10U(如2U、3U、3.3U、4U、5U、6U、7U、8U、9U、10U或上述数值之间的任意值)。

在本发明中，所述接触的条件优选包括：温度为25-55℃(如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或上述数值之间的任意值)，pH值为4-9(如pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9或上述数值之间的任意值)，时间为10-60min(如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min或上述数值之间的任意值)。

在本发明中，含有人参皂苷Rc的原料可以为仅含人参皂苷Rc而不含其它类型的人参皂苷的原料，也可以为还含有其它类型的人参皂苷(如Rb₁、Rb₂、Rc和Rb₃中的至少一种)的原料。当含有人参皂苷Rc的原料还含有除人参皂苷Rc以外的其它类型的人参皂苷时，与其接触的酶还可以含有β-D-葡萄糖苷酶，以基于多组分人参皂苷获得稀有人参皂苷。所述β-D-葡萄糖苷酶的用量可以根据人参皂苷的含量确定，在此不再赘述。

在本发明中，所述含有人参皂苷Rc的原料可以由人参、西洋参和三七中的至少一种提供。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，在没有特殊说明的情况下，所使用的原料均为常见的市售品。

实施例1

(1)基因的获得

根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列通过人工化学合成法(委托昆明硕擎生物科技有限公司)获得相应的基因。

(2)表达载体和重组菌株的构建

对由步骤(1)获得的基因以及表达载体pET28a(+)均进行EcoRI/HindIII双酶切，酶切产物通过核酸纯化后，使用DNA连接酶将上述两个经酶切后的产物连接(16℃过夜反应)，获得重组质粒，该重组质粒经酶切和测序验证其序列如SEQ ID NO：2所示。

将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21获得重组菌株(BL21-pET28a-CaAraf51)。

实施例2

将实施例1构建好的重组菌株(BL21-pET28a-CaAraf51)接种于10ml的LB液体培养基中，180rpm、37℃过夜培养约13h；次日按1％体积的转接量接种于100ml新鲜的LB培养基中，待OD₆₀₀为0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，180rpm、25℃培养15h。

粗蛋白液制备：9000rpm、4℃离心5min收集菌体，倾去上清；再用PB缓冲液洗涤菌体两次，最后将菌体重悬于20ml平衡缓冲液中；超声波破碎细胞(工作4s、暂停4s、振幅40％)30min；12000rpm，4℃离心20min收集上清(粗蛋白液)用于SDS-PAGE分析；上清中含有目的基因表达的蛋白，即粗蛋白。

蛋白纯化：用0.45mm微孔滤膜过滤粗蛋白液，用于蛋白纯化；蛋白纯化步骤严格按照以下描述进行，装柱：根据待纯化的蛋白量，将重悬的介质加入层析柱(Ni柱)中，静置；平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；上样：将待纯化的粗蛋白液沿着层析柱壁缓慢加入；洗涤：上样完毕后，用5-10倍的柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱；洗脱：用4倍柱体积的40mM咪唑洗脱非特异性结合的杂蛋白，再用3倍柱体积的80mM咪唑继续洗脱非特异性结合的杂蛋白，最后用160mM咪唑洗脱目的蛋白，按照1ml/管的体积量收集目的蛋白。通过SDS-PAGE检测每管蛋白液中目的蛋白的纯度，用蛋白分子量三分之一大小的超滤管浓缩没有杂蛋白的蛋白液，然后用酶反应缓冲液置换洗脱缓冲液，得到纯化的酶液(15U/mg)。

通过SDS-PAGE分析CaAraf51在经Ni²⁺亲和层析柱后显示单一条带，分子量约为55.07kDa，如图2所示，达到了电泳纯级别。图2中，M为蛋白标记物，1为空载体转化表达宿主的空白对照，2为粗蛋白液，3为纯化的酶液。

实施例3

本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(CaAraf51)的定性测定

1、酶活的测定方法

将底物(对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷)加入100μl反应体系中使其终浓度为5mM，再加入5μl纯化的酶液，pH7.5(磷酸缓冲液)、37℃的反应条件下反应10min，然后立即加入100μl、1M的Na₂CO₃，405nm下测定反应产物对硝基苯酚(pNP)的吸光值。

2、最适pH以及pH稳定性的测定

使用以下缓冲液进行最适pH以及pH稳定性的测定：50mM甘氨酸-HCl(pH 2和3)，50mM乙酸-乙酸钠(pH4和5)，50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH6-8)，50mM甘氨酸-NaOH(pH9和10)。

将底物加入100μl不同pH的缓冲液中使其终浓度为5mM，再加入5μl纯化的酶液，37℃温育10分钟，405nm下检测pNP吸光值，最佳活性被定义为100％，从而确定酶的最适反应pH。

将CaAraf51与上述pH4-9的缓冲液混合，4℃放置24h，按照1的方法加入底物在37℃下检测酶的残留活性(＝4℃放置24h之后的活性/4℃放置24h之前的活性×100％)，从而测定酶在不同pH缓冲液中的稳定性。

测定结果如图3所示，其中，实心圆为最适反应pH测定结果图，可以看出本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH为5.0；空心圆为α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在不同pH(pH4-9)的缓冲液中的稳定性测定结果，可以看出本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4-9下均能表现出较高的活性。

3、最适温度以及温度稳定的测定

将底物加入100μl反应体系(50mM乙酸-乙酸钠(pH5.0))中使其终浓度为5mM，再加入5μl纯化的酶液，分别在25-75℃下反应10min，加入100μl、1M的Na₂CO₃终止反应，405nm下检测pNP吸光值，最佳活性被定义为100％。结果如图4所示，可以看出本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度为40℃。

5μl纯化的酶液与最适pH的缓冲液(50mM乙酸-乙酸钠(pH5.0))混合，30-60℃温浴不同时间后检测酶残留活性(＝温浴后的酶活性/温浴前的酶活性×100％)，从而测定酶在不同温度下的稳定性，结果如图5所示，可以看出本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在35-55℃下均能表现出较高的活性。

4、对阿拉伯糖和葡萄糖的耐受性的测定

按照1的方法在反应体系中进一步加入不同浓度的阿拉伯糖和葡萄糖从而测定本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对糖的耐受性，以相对于不加糖的酶活性表征，结果如图6所示，其中，空心圆表示对L-阿拉伯糖的耐受性测定结果，实心圆表示对D-葡萄糖的耐受性测定结果。从图6可以看出，即使在1000mM的阿拉伯糖或葡萄糖存在下，本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶依然保留了80％以上的酶活力。

从以上实验结果可以看出，本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在较宽的pH和温度范围内活性稳定，而且能够耐受较高浓度的阿拉伯糖和葡萄糖，适应性广，可以和其他人参皂苷水解酶共同用于水解人参皂苷。

实施例4

本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(CaAraf51)在转化人参皂苷Rc制备人参皂苷Rd中的应用。

人参皂苷Rc对照品和人参皂苷Rd对照品由云南与诺生物工程有限责任公司分离纯化得到，纯度为98.88％。

取0.1ml的酶液(96U/ml)与1mg人参皂苷Rc在pH7.5、30℃的条件下混合反应10min，反应后的产物进行TLC检测，结果如图7所示，1和3分别为人参皂苷Rc对照品和人参皂苷Rd对照品的TLC检测结果，2为反应后的产物的TLC检测结果。通过高效液相色谱分析(HPLC分析)测得人参皂苷Rd的产量为0.79mg，转化效率(＝转化产物中人参皂苷Rd的实际质量÷原料转化为人参皂苷Rd的理论质量×100％)为90％，结果如图8所示，图8中，(A)和(B)分别为人参皂苷Rc对照品和人参皂苷Rd对照品的HPLC检测结果，(C)为反应后的产物的HPLC检测结果。从TLC和HPLC的检测结果可以看出，人参皂苷Rc与酶液混合反应后大部分转化为人参皂苷Rd。

HPLC分析中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm粒径为5μm，载碳量11％)；以水为流动相A，乙腈为流动相B。最初用81∶19(v/v)的水和乙腈混合作为流动相洗脱柱子30min，76∶24梯度洗脱5min，然后60∶40梯度洗脱25min，最后再用60∶40洗脱5min，流速为1.3mL/min，柱温为37℃。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南与诺生物工程有限责任公司

<120> α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其编码基因和应用

<130> I56597YNU

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile His Ala Arg Ile Gln Ile Asp Pro Asp Asp Ala Val Gly Arg

1 5 10 15

Val Thr Ala Arg Ser Pro Ala Thr Phe Val Gly His Met Ala Pro Ser

20 25 30

Val Tyr Gly Trp Leu His Asp Pro Pro Thr Pro Ser Arg Gln Ala Thr

35 40 45

Ala Tyr Ala Gly Asp Val Pro Glu Leu Gly Pro Glu Ser Gly Ala Ser

50 55 60

Leu Val Arg Phe Pro Ala Gly Gln Tyr Val Thr Gly Tyr Arg Trp Gly

65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Ala Arg Glu Thr Ala Pro Leu Arg Ser Asp Pro Ala

85 90 95

Trp Thr Ser Ile Gly Thr Gln Thr Leu Arg Leu His Glu Tyr Ala Gly

100 105 110

Trp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Gln Val Met Met Ala Val Gln Leu Gly

115 120 125

Thr Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Gln Leu Leu Glu Tyr Cys Asn His

130 135 140

Pro Gly Gly Thr Ala Leu Ser Asp Glu Arg Arg Ala Asn Gly Ala Pro

145 150 155 160

Asp Pro Phe Arg Phe Arg Leu Trp Tyr Leu Gly Gln Glu Met Gln Gly

165 170 175

Asp Trp Gln Ile Gly His Lys Thr Ala His Glu Tyr Gly Arg Pro Ala

180 185 190

Ala Arg Thr Gly Arg Leu Met Arg Phe Leu Asp Pro Thr Leu Glu Leu

195 200 205

Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ala Asp Gln Ala Thr Phe Gly Asp Trp

210 215 220

Glu Arg Glu Val Val Pro Gln Thr Ala Gly Leu Val Asp His Val Ser

225 230 235 240

Leu His Ala Tyr Tyr Gly Glu Thr Ala Gly Asp Leu Pro Ser Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Gly Val Gly Leu Asp Arg Tyr Ile Ala Thr Val Ala Gly Ile

260 265 270

Leu Asp Glu Glu Glu Gly Ala Leu Gly Asp Arg Met Gln Trp Arg Arg

275 280 285

Leu Gly Ile Ser Leu Asp Glu Trp Asn Phe Trp Tyr Leu Asp Arg Phe

290 295 300

Asn Glu Arg Asp Lys Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ala Trp Asn Val Ala

305 310 315 320

Pro Arg Ile Ile Glu Asp Glu Tyr Ala Val Ala Asp Arg Val Val Leu

325 330 335

Gly Ser Leu Leu Asn Ser Leu Val Arg His Pro Asp Arg Val Ser Met

340 345 350

Ala Asn Gln Ala Gln Leu Leu Gln Val Ile Ala Pro Ile Arg Thr Glu

355 360 365

Pro Asp Ala Glu Ala Trp Arg Gln Thr Ile Phe Trp Pro Phe Ala Ile

370 375 380

Thr Ala Ala Arg Ala Arg Gly Ala Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp Cys

385 390 395 400

Pro Thr Val Pro Thr Ala Ala Tyr Gly Asp Val Pro Val Leu Asp Val

405 410 415

Ser Ala Thr Thr Thr Ala Asp Gly Arg Val Glu Val Phe Cys Val Asn

420 425 430

Arg Asp Pro Glu Arg Pro Val Glu Val Thr Leu Ala Gly Gly Gly Val

435 440 445

Arg Ala Val Arg Asp Ala Val Val Ser Thr Val Pro Glu Gly His Asp

450 455 460

Arg Leu Trp Thr Asn Thr Arg Asp Ala Thr Pro Val Arg Pro Val Pro

465 470 475 480

Ser Gly Ala Arg Val Gly Asp Gln Glu Val Arg Leu Thr Leu Pro Ala

485 490 495

Leu Ser Trp Ala Ala Val Gly Leu Asp Leu Ala

500 505

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatccacg cacgcatcca gattgacccc gacgatgccg taggtcgcgt gacagcccgc 60

tccccggcga cctttgttgg acatatggcg ccgtcggtct atggctggct ccatgatcct 120

cccaccccgt cccgccaggc gacggcgtac gccggggatg tccctgagct ggggccggaa 180

tcgggagcct ctttggtccg gttcccggcg gggcagtacg tgacgggcta caggtgggga 240

gactcggtac gggcccggga aacggccccc ctgaggtcgg atccggcctg gacctcgata 300

ggaactcaga cgctgcggct tcacgagtac gccggctggg cggagcgggc ggggctgcag 360

gtcatgatgg ccgtccaact cggcaccgcc ggcgcggccg aggccgcgca gctcctggag 420

tattgcaacc accctggtgg taccgccctg tccgatgagc gtagggcgaa cggcgccccg 480

gatcccttcc ggttccggct gtggtacctc ggtcaagaga tgcagggcga ctggcagata 540

ggccacaaga ccgcccacga gtacggccgc cctgccgcga ggaccggccg gctgatgaga 600

ttcctggacc ccacgctgga gctcgtcgca gcgggctcgt cgtcggccga ccaggccacg 660

ttcggcgact gggagcgcga ggtggtcccg cagaccgccg ggctggtcga ccatgtgtcg 720

ctccacgcct actacggaga gaccgccggc gacctgccct cgcttctcgc gtccggcgtc 780

gggctcgacc gctacatcgc gaccgtcgcg gggatcctcg acgaggagga gggcgcgctc 840

ggcgaccgga tgcagtggcg acggctcggc atcagcctgg acgagtggaa cttctggtac 900

ctcgaccggt tcaacgagcg ggacaaggag cccctgttgt cgggcgcgtg gaacgtcgcg 960

ccgcgcatca tcgaggacga gtacgcggtg gcggaccgcg tcgtcctggg gagcctgctc 1020

aactcgctgg tccggcaccc ggaccgggtc tcgatggcga accaggcgca gctcctgcaa 1080

gtcatcgcgc ccatccgcac cgagcccgac gccgaggcgt ggcggcagac catcttctgg 1140

cccttcgcga tcacggccgc ccgtgcgcgg ggcgccgcgc tgcgcgtcgc cgcggactgc 1200

ccgaccgtcc cgaccgccgc gtacggcgac gtgcccgtcc tggacgtctc cgcgacgacg 1260

accgccgacg gtcgtgtcga ggtgttctgc gtgaaccgtg acccggagcg ccctgtcgag 1320

gtcacgctcg ccggcggcgg ggtgcgggcg gtgcgcgacg ccgtcgtgtc gacggtcccc 1380

gaggggcacg accggctttg gaccaacacg cgggacgcga cgcccgtccg ccccgtgccg 1440

tccggcgcgc gcgtcggaga ccaggaggtg cggctgacgc tcccggcgct ctcgtgggcg 1500

gcggtcgggc tcgacctggc ctga 1524

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

Claims

1.一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，其特征在于，其为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶；

2.编码权利要求1所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种制备权利要求1所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法，其特征在于，该方法包括：将编码所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因插入载体，用所得重组载体转化表达宿主，并诱导表达宿主表达所述基因。

5.包含权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.权利要求1所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、权利要求2或3所述的基因、以及权利要求5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一项在制备人参皂苷Rd中的应用。

7.一种制备人参皂苷Rd的方法，该方法包括：将含有人参皂苷Rc的原料与酶进行接触，其特征在于，所述酶含有权利要求1所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，相对于每毫克的人参皂苷Rc，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的用量为2-10U。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述接触的条件包括：温度为25-55℃，pH值为4-9，时间为10-60min。

10.根据权利要求7-9中任意一项所述的方法，其中，所述酶还含有β-D-葡萄糖苷酶；所述原料还含有人参皂苷Rb1、Rb₂、Rc和Rb3中的至少一种。