CN110157695A - 一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法，使用具有RNA m5C甲基化修饰功能的重组核酸酶dCas13a‑RsmB、dPspCas13b‑RsmB、dPspCas13b‑NOP2及dPspCas13b‑NSUN2对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰，具有高效性和特异性等特点，是一种高效快速的RNA m5C甲基化修饰系统。

Description

一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法，具体涉及使用具有甲基转移酶活性的重组核酸酶dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰。
背景技术
在遗传学的研究过程中基因编辑工具的作用是非常重要的，近几年发现的CRISPR基因编辑技术以其特异性强、靶向性好、适用性广等特点成为广大科研工作者研究和开发的热点。利用CRISPR系统对基因组DNA进行敲除进而研究基因功能的方法是非常便利和高效的。CRISPR系统不仅能进行基因组DNA的敲除还可以通过融合突变的Cas蛋白序列与有催化功能的蛋白实现各种靶向基因编辑操作，如融合脱氨酶实现A-I和C-U的定点编辑。
以上多种编辑修饰方式都是在DNA水平上进行的，而RNA作为重要的遗传信息传递介质对其的研究一直受到很大的限制，直到张峰在2016年发现沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)中存在一种新型的CRISPR效应蛋白Cas13a(C2c2)。Cas13a具有RNA介导的RNA酶活性，这一发现为在RNA水平改变遗传信息提供了一种新的工具Abudayyeh,O.O.,J.S.Gootenberg,S.Konermann,J.Joung,I.M.Slaymaker,D.B.Cox,S.Shmakov,K.S.Makarova,E.Semenova,L.Minakhin,K.Severinov,A.Regev,E.S.Lander,E.V.Kooninand F.Zhang(2016)."C2c2is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector."Science.)。2017年张峰教授又发现了PspCas13b，PspCas13b是一种比Cas13a更稳定更高效的核酸酶。
PspCas13b不仅能进行RNA的切割还可以通过dPspCas13b(失活的PspCas13b)与不同功能的蛋白融合，实现各种靶向RNA的编辑，如通过融合hADAR在动物细胞中在RNA水平上实现A-I的定点编辑。
在植物体中RNA作为重要的遗传物质，截至目前已有100余种不同的化学修饰形式被发现。RNA甲基化(RNA methylation)作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象，6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、编辑、稳定性及降解等方面扮演重要角色。相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂，种类繁多，且普遍存在于各种高级生物中。迄今为止，还没有能够人为靶向修饰RNA的系统。迄今为止，还没有一种简单高效的RNA靶向修饰系统。因此，开发出一种高效快速的RNA m5C修饰系统，将为RNA的功能研究提供有力的工具。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提出一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统，包括靶向RNA的具有RNA m5C甲基化修饰功能的重组核酸酶及其靶向RNA的gRNA。
进一步的，所述重组核酸酶是将靶向RNA的无切割活性的核酸酶dCas13a(DeadCas13a，Cas13a也称为C2c2)和dPspCas13b分别与甲基转移酶结构域进行融合，形成的具有甲基转移酶活性的重组核酸酶dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2。
一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，应用所述的植物RNA m5C甲基化修饰系统，将相应功能的酶引导到相应RNA上，实现植物RNA的m5C甲基化修饰。
进一步的，利用所述重组核酸酶在靶位点处进行胞嘧啶碱基的甲基化，最终实现植物RNA的m5C甲基化修饰。
进一步的，所述植物RNA的修饰方法包括建立RNA m5C甲基化修饰的体外表达系统；所述体外表达系统利用原核表达系统进行体外蛋白的表达，获得带His和Msb标签的dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2的融合蛋白，并建立体外甲基化反应体系。
进一步的，所述植物RNA的m5C甲基化修饰方法包括建立RNA m5C甲基化修饰的体内表达系统；所述体内表达系统分别利用AtU6启动子驱动gRNA的表达，利用35S启动子驱动dCas13a-RsmB的表达，在植物体内进行定点修饰实验。
本发明的突出效果为：
本发明的一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统及方法，使用具有RNA m5C甲基化修饰功能的重组核酸酶dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2对RNA进行胞嘧啶C甲基化修饰，具有高效性和特异性等特点，是一种高效快速的RNAm5C甲基化修饰系统。
附图说明
图1A为本发明实施例1的dCas13a-RsmB体外甲基化所用蛋白表达及体内甲基化所用载体图谱；
图1B为本发明实施例1的dCas13a-RsmB原核表达纯化所得蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图；
图1C为本发明实施例1的dCas13a-RsmB体外甲基化结果图；
图2A为本发明实施例2的拟南芥甲基转移酶TRM4B蛋白的保守结构域结构示意图；
图2B为本发明实施例2的用于亚细胞定位的载体结构示意图；
图2C为本发明实施例2的TRM4B亚细胞定位结果图；
图3A为本发明实施例3的dPspCas13b-RsmB体外甲基化所用蛋白表达及体内甲基化所用载体图谱；
图3B为本发明实施例3的dPspCas13b-RsmB原核表达纯化所得蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图；
图3C为本发明实施例3的dPspCas13b-RsmB体外甲基化结果图；
图4为本发明实施例2的dCas13a-RsmB体内甲基化所选拟南芥MAG5的靶位点部分序列(成熟mRNA碱基3255到碱基3443，起始密码子所在的地方为碱基1)及gRNA位置；
图5A为本发明实施例4的dPspCas13b-NOP2体外甲基化所用蛋白表达及体内甲基化所用载体图谱过程图；
图5B为本发明实施例4的dPspCas13b-NOP2原核表达纯化所得蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图；
图5C为本发明实施例4的dPspCas13b-NOP2体外甲基化结果图；
图6A为本发明实施例5的dPspCas13b-NSUN2体外甲基化所用蛋白表达及体内甲基化所用载体图谱过程图；
图6B为本发明实施例5的dPspCas13b-NSUN2原核表达纯化所得蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶图；
图6C为本发明实施例5的dPspCas13b-NSUN2体外甲基化结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明的一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，包括以下步骤：
1.改造pET28a原核细胞表达载体，构建具有Msb超酸性水解蛋白(Zou,Z.,L.Cao,P.Zhou,Y.Su,Y.Sun and W.Li(2008)."Hyper-acidic protein fusion partnersimprove solubility and assist correct folding of recombinant proteinsexpressed in Escherichia coli."J Biotechnol 135(4):333-339.)标签的原核细胞表达载体。
从DH5α中用PCR扩增得到Msb的DNA序列并通过PCR将His标签和TEV蛋白酶切位点分别加到Msb的N端和C端，然后用NcoI和BamHI双酶切PCR产物和pET28a载体，最后用T4DNA连接酶连接得到pET28a-Msb原核细胞表达载体。
NcoI-His-Msb-TEV-BamHI的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，具体如下：
2.改造失活核酸酶dCas13a和dPspCas13b(Δ984-1090)，构建具有甲基转移活性的融合蛋白dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2到原核表达载体pET28a-Msb上。
从GENEWIZ公司合成经过植物密码子优化的dCas13a(Komor,A.C.,Y.B.Kim,M.S.Packer,J.A.Zuris and D.R.Liu(2016)."Programmable editing of a target basein genomic DNA without double-stranded DNA cleavage."Nature.)和dPspCas13b(Cox,D.B.T.,J.S.Gootenberg,O.O.Abudayyeh,B.Franklin,M.J.Kellner,J.Joung andF.Zhang(2017)."RNA editing with CRISPR-Cas13."Science 358(6366):1019-1027.)序列。
dCas13a的基因序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
dPspCas13b的基因序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
用PCR扩增得到dCas13a和dPspCas13b的序列，然后通过BamHI和HindIII双酶切连入pET28a-Msb原核表达载体上得到pET28a-Msb-dCas13a和pET28a-Msb-dPspCas13b。
从拟南芥基因组DNA中PCR扩增得到TRM4B的RsmB结构域，用HindIII酶切之后通过同源重组的方法将RsmB连入载体pET28a-Msb-dCas13a和pET28a-Msb-dPspCas13b得到原核表达载体pET28a-Msb-dCas13a-RsmB和pET28a-Msb-dPspCas13b-RsmB。RsmB结构域分别通过XTEN(Komor,A.C.,Y.B.Kim,M.S.Packer,J.A.Zuris and D.R.Liu(2016)."Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage."Nature.)和HIV NEX(Cox,D.B.T.,J.S.Gootenberg,O.O.Abudayyeh,B.Franklin,M.J.Kellner,J.Joung and F.Zhang(2017)."RNA editing with CRISPR-Cas13."Science 358(6366):1019-1027.)连接到dCas13a和dPspCas13b的C端。从酵母中PCR扩增得到NOP2蛋白的保守结构域(简称NOP2)，从人类cDNA中PCR扩增得到NSUN2蛋白的保守结构域(简称NSUN2)，用HindIII酶切之后通过同源重组的方法将NOP2和NSUN2连入载体pET28a-Msb-dPspCas13b得到原核表达载体pET28a-Msb-dPspCas13b-NOP2和pET28a-Msb-dPspCas13b-NSUN2。
XTEN连接序列如下：
tctggatctgagactcctggaacttctgagtctgctactcctgagtct
HIV NEX连接序列如下：
ggatcacttcaattgcctccacttgaaagattgacattgggatct
RsmB结构域的基因序列如SEQ ID NO.4所示。具体如下：
注：加粗标注出来的位置原基因组上HindIII酶切位点AAGCTT，将原序列通过PCR突变成AAACTT消除了HindIII位点但是没有改变蛋白编码序列。
NOP2保守结构域的基因序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：
NSUN2保守结构域的基因序列如SEQ ID NO.6所示，具体如下：
3.原核细胞表达纯化融合蛋白dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2。
将构建好的载体pET28a-Msb-dCas13a-RsmB、pET28a-Msb-dPspCas13b-RsmB、pET28a-Msb-dPspCas13b-NOP2及pET28a-Msb-dPspCas13b-NSUN2。转入Rosetta(DE3)化学感受态细胞中。将12ml过夜培养的菌液接种到6升LB培养基中。在37℃下生长至细胞密度到OD600为0.4，然后温度降至16℃。当细胞密度到OD600为0.8时，加入IPTG至浓度为250μM。培养16小时后，收获菌液并重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,0.5M NaCl，10mM咪唑，5％甘油，1％Trixton X-100，1mM PMSF，7.15mM BME)中，通过超声破碎裂解和超速离心澄清裂解物。使用Ni-NTA His树脂分离可溶性融合蛋白。含有融合蛋白的洗脱液在AKTA系统(GE Health)上应用于5ml HiTrap Q HP(GE Health)。纯化的融合蛋白在存储缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.5,0.5M NaCl，5％甘油，2mM DTT)中浓缩至1mg/ml。dPspCas13b-NOP2和dPspCas13b-NSUN2只经过His树脂纯化。
4.体外合成靶向RNA和crRNA
首先利用PCR获得用于体外转录的靶向RNA和crRNA的DNA序列。靶向RNA的基因序列(来源于(Komor,Kim et al.2016))如SEQ ID NO.7所示。具体如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dCas13a的gRNA17序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dCas13a的gRNA18序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dCas13a的gRNA27序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dCas13a的gRNA31序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dCas13a的gRNA33序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dPspCas13b的gRNA17序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dPspCas13b的gRNA18序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dPspCas13b的gRNA27序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dPspCas13b的gRNA31序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
dPspCas13b的gRNA33序列如下：
注：加粗标注的序列为T7启动子序列，用于T7RNA聚合酶的体外转录。
靶向RNA和crRNA用HiScribeTMT7Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成，然后用RNA Clean&Concentrator(ZYMO RESEARCH)纯化。
5.体外甲基化
用1XCutsmart缓冲液，80μM SAM，8pM ssRNA，5pM crRNA，20pM的融合蛋白进行甲基化反应1小时，通过RNA Clean&Concentrator(ZYMO RESEARCH)纯化RNA。
6.亚硫酸氢盐处理RNA(David,R.,A.Burgess,B.Parker,J.Li,K.Pulsford,T.Sibbritt,T.Preiss and I.R.Searle(2017)."Transcriptome-wide Mapping of RNA5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and non-coding RNAs."Plant Cell.)
配置亚硫酸氢盐溶液：40％亚硫酸氢钠，0.6mM对苯二酚，pH5.1。添加100μL亚硫酸氢盐溶液到需要处理的RNA中，75℃处理4小时，用Micro Bio-Spin 6chromatographycolumns脱盐2次。在脱盐处理之后的RNA中加入100μL的1MHCl，pH9.0℃75处理1小时。最后用RNA Clean&Concentrator(ZYMO RESEARCH)纯化RNA。
7.用Trizol提取RNA
加入1ml的Trizol到样品中，静置5分钟，加入200μl氯仿，剧烈震荡15s。室温静置5分钟，12000g，4℃离心15分钟。取上清加入500μl异丙醇，室温静置5分钟，离心10分钟。用75％乙醇洗一遍，超净台吹干乙醇，加入适量的水溶解RNA。
8.RT-PCR和Sanger测序检测甲基化效率
将RNA用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录得到cRNA，再用高保真酶扩增得到DNA序列。将扩增得到的DNA用Gel Extraction Kit纯化，然后通过pEASY-Blunt Zero Cloning Kit构建到载体上用Sanger测序检测30个克隆。
用于RT-PCR和扩增的引物序列BS-FP的序列如下：
ttagtgaatttgagtttggt
用于RT-PCR和扩增的引物序列BS-RP的序列如下：
ctttatacttccaactcata
用于体内RNA反转录的引物BSMAG5FP1的序列如下：
ttggtattggtatattgaag
用于体内RNA反转录的引物BSMAG5FP2的序列如下：
ttgatggggtgatataggtg
用于体内RNA反转录的引物BSMAG5RP1的序列如下：
cactactccaactcccacta
用于体内RNA反转录的引物BSMAG5RP2的序列如下：
acacacacccatacatccac
用于RT-PCR和扩增的引物序列BS-S3FP的序列如下：
attttgattatttaatgagg
用于RT-PCR和扩增的引物序列BS-S3FP的序列如下：
tcattctttatctcaaactt
9.构建用于拟南芥稳定转化的pCambia1300AtU6-35S-dCas13a-RsmB载体
将用于转录gRNA的启动子终止子和dCas13a gRNA骨架序列插入pCambia1300的HindIII和XmaI位点之间。
AtU6的基因序列如SEQ ID NO.8所示，具体如下：
dCas13a gRNA骨架序列如下：
注：加粗标注的为含有两个BsaI位点的序列，用于插入spacer。
终止子序列如下：
tttttttgttttttatgtct
将用于表达dCas13a-RsmB的35S启动子和NOS终止子插入XmaI和EcoRI之间，35S启动子和NOS终止子之间插入了NcoI和BamHI位点。
35S启动子序列的基因序列如SEQ ID NO.9所示，具体如下：
NOS终止子的基因序列如SEQ ID NO.10所示，具体如下：
用NcoI和BamHI双酶切后插入从pET28a-Msb-dCas13a-RsmB扩增到的dCas13a-RsmB序列，并且在dCas13a-RsmB的N端和C端分别加上NLS核定位信号。
NLS-dCas13a-RsmB-NLS的基因序列如SEQ ID NO.11所示。具体如下：
注：加粗标注出来的为N端和C端的NLS核定位信号序列。
10.构建用于拟南芥稳定转化的pCambia1300AtU6-35S-dPspCas13b-RsmB载体
用PCR扩增得到dPspCas13b的gRNA骨架序列，并通过HindIII和XmaI双酶切的方法替换dCas13a的gRNA骨架序列。
dPspCas13b骨架序列如下：
注：加粗标注的为含有两个BsaI位点的序列，用于插入spacer。
用NcoI和BamHI双酶切后插入从pET28a-Msb-dPspCas13b-RsmB扩增到的dPspCas13b-RsmB序列，并且在dPspCas13b-RsmB的N端加上Flag-NLS核定位信号在C端加上NLS核定位信号。
Flag-NLS-dPspCas13b-RsmB-NLS的基因序列如SEQ ID NO.12所示。具体如下：
注：加粗标注出来的为N端的Flag-NLS核定位序列和C端的NLS核定位信号序列。
11.用于TRM4B蛋白亚细胞定位的载体构建
将35S启动子和NOS终止子插入pCambia1300的HindIII和EcoRI酶切位点之间，35S启动子和NOS终止子中间有NcoI和SpeI酶切位点。用SpeI切割之后将GFP序列通过同源重组的方法插入，用NcoI切割之后用同源重组的方法将从拟南芥基因组DNA获得的TRM4B的序列插入。
GFP的基因序列如SEQ ID NO.13所示，具体如下：
TRM4B的基因序列如SEQ ID NO.14所示，具体如下：
12.在骨架载体中插入spacer序列
在目的RNA上选取相应的序列后合成互补的引物(正反向引物分别加上相应的接头序列)，退火之后用T4DNA连接酶连接到BsaI酶切之后的骨架载体上。
dCas13a gRNA-S1序列如下：
ttccacacctctttccacccatctcttt
dCas13a gRNA-S2序列如下：
cttcctcagctgggggttccacacctct
dCas13a gRNA-S3序列如下：
aggaggtagtgcagcttcctcagctggg
dPspCas13b gRNA-S1序列如下：
tcagctgggggttccacacctctttccacccatctctttaggttatcgtc
dPspCas13b gRNA-S2序列如下：
aggtagtgcagcttcctcagctgggggttccacacctctttccacccatc
dPspCas13b gRNA-S3序列如下：
gacgttggaggaggaggtagtgcagcttcctcagctgggggttccacacc
dPspCas13b gRNA10序列如下：
gcactgcacgccgtaggtgaaggtggtcacgagggtgggccagggcacgg
dPspCas13b gRNA15序列如下：
gcacgccgtaggtgaaggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagc
dPspCas13b gRNA20序列如下：
ccgtaggtgaaggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgcc
dPspCas13b gRNA25序列如下：
ggtgaaggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtgg
dPspCas13b gRNA30序列如下：
aggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcag
dPspCas13b gRNA35序列如下：
gtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaa
dPspCas13b gRNA40序列如下：
gagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttca
dPspCas13b gRNA45序列如下：
tgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtc
13.烟草瞬时表达
将相应的载体转入农杆菌GV3101，28℃黑暗培养两天，挑取单克隆于5ml LB抗性培养基(50mg/L卡那霉素，25mg/L利福平)中，28℃，240rpm培养16小时，以1：100的比例转接到新的200ml LB抗性培养基中，28℃，240rpm培养过夜到OD600＝3。4000rpm，10min收集菌体，用10mM MES pH 5.6，10mM MgCl2,10μM乙酰丁香酮溶液将菌体悬起，调OD600 20到1。温静置2-3小时后，用不带针头的1ml医用注射器将农杆菌注射到4周左右生长状态良好烟草叶片背面。培养36-48小时后取样观察荧光信号的。
14.拟南芥转化及阳性苗筛选
将相应的载体转入农杆菌GV3101中，选取健壮的开了花的拟南芥用浸花法进行遗传转化。正常生长一个月后收集T1代种子，然后在含50mg/L潮霉素的1/2MS平板上筛选阳性苗，移栽到土里。
实施例1dCas13a-RsmB体外甲基化
首先，构建了dCas13a-RsmB的体外表达载体并在原核细胞中进行表达，经纯化后得到融合蛋白dCas13a-RsmB(图1A和图1B)。利用纯化后的融合蛋白dCas13a-RsmB进行RNA的体外甲基化实验，并用亚硫酸氢钠测序法对RNA的甲基化进行检测(图1C)。结果表明，在体外dCas13a-RsmB可以介导RNA上胞嘧啶的甲基化，但其效率较低为3.33％到6.67％之间，另外甲基化的位点不止限制在gRNA结合位点内部的胞嘧啶碱基，同样也存在于gRNA结合位点周围的胞嘧啶上，这类似于CRISPR介导的DNA甲基化(Liu,Wu et al.2016)。dCas13a-RsmB的甲基化具有一定的位点倾向性，例如，除了gRNA27之外另外的四个gRNA都可以介导dCas13a-RsmB对C79、C83、C87和C91的甲基化，而C96可以同时被gRNA17、gRNA18和gRNA31甲基化。gRNA介导的dCas13a-RsmB甲基化具有位点特异性，这同已有的研究相吻合(David,Burgess et al.2017)，而且gRNA的结合位点对甲基化效率有很大的影响，如gRNA27只有一个位点的胞嘧啶发现有甲基化。
实施例2dCas13a-RsmB体内甲基化
在体外成功实现RNA胞嘧啶甲基化的基础上，进行了RNA的体内甲基化修饰。首先，对拟南芥甲基转移酶TRM4B进行亚细胞定位，发现其定位在细胞核中(图2)，所以在体内甲基化实验中利用核定位信号将dCas13a-RsmB导入细胞核内。分别利用AtU6驱动gRNA和35S驱动dCas13a-RsmB的表达(图1A)。在拟南芥中MAG5的mRNA作为TRM4B的靶RNA，其mRNA的特定位点能被TRM4B甲基化(David,Burgess et al.2017)，基于此构建了靶定MAG5mRNA的载体并将其转化入TRM4B的突变体trm4b-1中。对T1代转基因植株进行MAG5mRNA的甲基化水平检测。结果表明，在体内dCas13a-RsmB能使靶RNA的特定位点甲基化，在选取的3个gRNA序列中，其中gRNA_S3的一个转基因株系可以将10％的C111甲基化(表1)。dCas13a-RsmB的体内结果表明在体内进行靶位点的甲基化是可行的但效率有待提高。
表1
实施例3dPspCas13b-RsmB体外甲基化
dCas13a-RsmB虽然可以甲基化靶RNA上的胞嘧啶，但是甲基化的效率较低(图1C和表1)。为了提高甲基化效率，于是利用新报道的dPspCas13b构建了dPspCas13b-RsmB融合蛋白的载体并且纯化得到融合蛋白(图3A和图3B)，再进行同样的体外甲基化实验。dPspCas13b-RsmB的体外甲基化效率明显比dCas13a-RsmB高，大部分的甲基化效率达到了6.67％以上，最高的甲基化效率为23.3％。同dCas13a-RsmB的一样，甲基化的效率具有一定的位点偏好性，但有些位点在多个gRNA的介导下都可以发生甲基化(图3C)。在dCas13a-RsmB中大部分的甲基化发生在靶RNA的中间位置，而在dPspCas13b-RsmB中大部分的甲基化发生在靶RNA的N端。这表明靶RNA的甲基化效率主要与gRNA结合位点有关而某一特定的靶RNA的甲基化模式则与gRNA关系不大。
实施例4dPspCas13b-NOP2体外甲基化
dPspCas13b-RsmB虽然在一定程度上提高了甲基化效率(图3C)，但效率仍然较低。为了进一步提高甲基化效率，利用酵母NOP2的保守结构域(简称NOP2)替换拟南芥TRM4B蛋白的保守结构域RsmB，构建了载体并且纯化得到融合蛋白dPspCas13b-NOP2(图5A和图5B)，再进行体外甲基化实验。结果表明，dPspCas13b-NOP2能够产生较高比例的甲基化，而甲基化的分布也同dPspCas13b-RsmB一样有一定的规律(图5C)。
实施例5dPspCas13b-NSUN2体外甲基化
另外也尝试了用人类NSUN2的保守结构域(简称NSUN2)替换拟南芥TRM4B蛋白的保守结构域RsmB，构建了载体并且纯化得到融合蛋白dPspCas13b-NSUN2(图6A和图6B)，再进行体外甲基化实验。结果表明，dPspCas13b-NSUN2能够产生较高比例的甲基化，而甲基化的分布也是同dPspCas13b-RsmB一样有一定的规律(图6C)。

Claims (6)

1.一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统，其特征在于：包括靶向RNA的具有RNA m5C甲基化修饰功能的重组核酸酶及其靶向RNA的gRNA。
2.根据权利要求1所述的一种植物RNA m5C甲基化修饰的系统，其特征在于：所述重组核酸酶是将靶向RNA的无切割活性的核酸酶dCas13a和dPspCas13b分别与甲基转移酶结构域进行融合，形成的具有甲基转移酶活性的重组核酸酶dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2。
3.一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，其特征在于：应用权利要求1或2所述的植物RNA m5C甲基化修饰系统，将相应功能的酶引导到相应RNA上，实现植物RNA的m5C甲基化修饰。
4.如权利要求3所述的一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，其特征在于：利用所述重组核酸酶在靶位点处进行胞嘧啶碱基的甲基化，最终实现植物RNA的m5C甲基化修饰。
5.如权利要求4所述的一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，其特征在于：所述植物RNA的m5C甲基化修饰方法包括建立RNA m5C甲基化修饰的体外表达系统；所述体外表达系统利用原核表达系统进行体外蛋白的表达，获得带His和Msb标签的dCas13a-RsmB、dPspCas13b-RsmB、dPspCas13b-NOP2及dPspCas13b-NSUN2的融合蛋白，并建立体外甲基化反应体系。
6.如权利要求4所述的一种植物RNA m5C甲基化修饰的方法，其特征在于：所述植物RNA的m5C甲基化修饰方法包括建立RNA m5C甲基化修饰的体内表达系统；所述体内表达系统分别利用AtU6启动子驱动gRNA的表达，利用35S启动子驱动dCas13a-RsmB的表达，在植物体内进行定点m5C甲基化修饰实验。
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