CN110156885B

CN110156885B - 松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1及其应用

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Publication number: CN110156885B
Application number: CN201910437852.XA
Authority: CN
Inventors: 吴小芹; 胡龙娇; 叶建仁; 黄鑫; 李煜
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110156885A

Abstract

本发明公开了一种松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1及其应用，该病原相关模式分子(Pathogen‑associated molecular patterns，PAMPs)蛋白BxCDP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从松材线虫分泌的效应子和PAMP出发，研究寄主松树对松材线虫侵染的防御反应，从松材线虫中获得病原相关模式分子蛋白BxCDP1，经试验证实其能触发包括寄主植物在内的多种植物的细胞坏死，即这种触发细胞坏死具有一定的广谱性，并且能够激发寄主的防御反应；BxCDP1触发的细胞坏死，依赖于模式识别受体的共受体BAK1，BxCDP1能激发本氏烟ROS的积累及PTI Marker基因的上调表达，激活了本氏烟的免疫反应；可见BxCDP1是松材线虫分泌的一个PAMP，这对于揭示松材线虫的致病机理及有针对性地提高松树对松材线虫的抗性具有重要的理论和实践意义。

Description

松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种松材线虫的病原相关模式(PAMP)分子蛋白BxCDP1及其应用。

背景技术

在自然界中，植物会受到许多病原微生物(包括真菌、细菌、线虫等)以及昆虫的侵袭，然而由于植物具有的先天免疫使得它们对于大部分的微生物具有抗性。植物的免疫系统包括2个层面，即一个“Z”字形模式：第一道防卫反应是植物细胞膜上的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)可识别病原物或微生物相关模式分子(Pathogen-or microbial-associated molecular patterns，PAMPs or MAMPs)，从而激发植物的基础防卫反应，诱导一些信号通路的激活，阻碍病原物的进一步扩展，即PAMP-triggered immunity(PTI)。此时，一些病原物为了进一步侵染植物，会分泌一些效应子(Effector)抑制寄主的反应，提升病原物的毒性，最终迫使寄主感病(Effector-triggered susceptibility，ETS)。在这个过程中，病原物的一些效应子会被植物的抗性蛋白(Resistance，R蛋白)所特异性的识别，从而激活植物第二层防卫反应，即效应子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI)。在强大的自然选择压力下，病原物会不断变化，产生一些新的效应子来抑制植物产生的PTI和 ETI，或者逃避寄主的ETI。同样地，植物在进化中也会产生新的抗病基因来识别病原物，这种植物与病原物之间的相互作用在共同进化的过程中会不断地延续下去。

病原物分泌的PAMP在被植物模式识别受体识别时，能够诱导植物一系列信号的转导和基础防卫反应的激活，这种反应包括乙稀的产生、活性氧的积累、胼胝质的沉积、防卫相关基因的表达和过敏性防卫反应，对微生物的适应性和生存过程中具有重要作用。目前，已有多种病原物的PAMP被鉴定。例如，细菌PAMP有鞭毛蛋白(flg22)，elongationfactor Tu和冷激蛋白(cold shock proteins)等；真菌中已鉴定的PAMP有几丁质(chitin)，喙孢属真菌(Rhynchosporium commune)的PAMP RcCDI1和苹果腐烂病菌(Valsamali)的PAMP VmE02等；致病疫霉(Phytophthora infestans)的PAMP有INF1及大豆疫霉(P.sojae)的PAMP PsXEG1等。而目前包括松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在内的植物寄生线虫尚未有PAMP报道， PAMP在病原线虫侵染寄主过程中发挥的具体作用也未见阐明。

松材线虫病又称松树萎蔫病(pine wilt disease，PWD)是一种重大的森林病害，对我国乃至世界生态环境和森林资源造成了严重破坏和威胁。该病可危害包括日本黑松(Pinus thunbergii)、马尾松(P.massoniana)、日本赤松(P.densiflora)、黄山松(P.taiwanensis)、云南松(P.yunnanensis)及湿地松(P.elliottii)等在内的 58种松属树种和13种非松属针叶树。目前该病主要分布在日本、中国、韩国、美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙和西班牙等国，其中日本、中国及韩国危害最为严重。1982年，该病在我国南京中山陵首次被发现，截至2019年1月，疫情已扩展到江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、天津、云南、陕西和辽宁等18个省区(国家林业与草原局2019年第4号公告)。相关研究发现，该病的发生能显著改变我国三峡地区马尾松林的群落组成和土壤特性，严重影响了我国森林生态的平衡和林业产业的可持续发展。在对该病研究的几十年中，国内外的研究主要偏向于对病原相关科学问题的探究，如病原种类、病原致病机理、病原线虫生态学特性、病原传播媒介、病害诊断及防治等。以往有关松材线虫病的致病机理研究大部分是围绕松材线虫的植物细胞降解酶(如纤维素酶、果胶裂解酶、扩展蛋白及β-1，3葡聚糖酶等)和一些寄生基因的功能以及松材线虫伴生细菌对松材线虫致病的影响等方面。由于该病发生发展的复杂性，病原的致病机理一直不很清楚。而从松材线虫分泌的效应子及PAMP的角度去探究松材线虫的致病机理以及寄主松树一系列的抵抗反应更是鲜见报道。

目前在其他病原物中鉴定到的效应子和PAMP被证明在其致病过程中发挥了关键作用。因此，研究松材线虫分泌的效应子及PAMP将是深入研究松材线虫致病机理的一个重要方向。松材线虫作为一种移动的植物寄生线虫，目前对其在侵染过程中分泌的PAMP还未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1，满足PAMP的使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述蛋白BxCDP1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

松材线虫病的病原相关模式分子蛋白BxCDP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1 所示。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1，来源于松材线虫。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1作为PAMP的应用。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在触发本氏烟细胞坏死中的应用。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在触发多种植物细胞坏死中的应用。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在检测松树基础防御反应中的应用。

所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在提高松树抗松材线虫病中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明从松材线虫分泌的效应子和PAMP出发，研究寄主松树对松材线虫侵染的防御反应，获得病原相关模式分子蛋白BxCDP1，经试验证实其能触发包括寄主植物在内的多种植物的细胞坏死，即这种触发细胞坏死具有广谱性，并且能够激发寄主松树的防御反应；BxCDP1触发的细胞坏死，依赖于模式识别受体的共受体BAK1，BxCDP1能激发本氏烟ROS的积累及PTI Marker 基因的上调表达，激活了本氏烟的免疫反应；可见BxCDP1是松材线虫分泌的一个PAMP。这对于揭示松材线虫的致病机理及有针对性地提高松树对松材线虫的抗性具有重要的理论和实践意义，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是松材线虫候选效应子BxCDP1触发本氏烟细胞坏死结果图；

图2是BxCDP1触发的细胞坏死依赖于BAK1，不依赖SOBIR1的结果图；

图3是BxCDP1在毕赤酵母中被成功诱导表达及纯化结果图；

图4是不同浓度BxCDP1纯蛋白触发本氏烟细胞坏死结果图；

图5是BxCDP1纯蛋白触发拟南芥、番茄、辣椒及生菜细胞坏死结果图；

图6是BxCDP1触发本氏烟的免疫反应结果图；

图7是BxCDP1在松材线虫侵染早期的表达模式结果图；

图8是BxCDP1诱导松树病程相关基因的表达并触发寄主松树细胞坏死结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

1.1松材线虫侵染早期转录组测序

选择松材线虫强毒虫株AMA3(分离自安徽省马鞍山市自然感病的马尾松)侵染3年生日本黑松，分别在松材线虫侵染6h、12h及24h时将树体剪成小段，用贝尔曼漏斗法分离线虫。后将松材线虫样品送诺禾致源进行转录组测序。试验结果：3个早期侵染阶段(6h、12h及24h)及在灰葡萄孢上(0h)收集的松材线虫被成功进行转录组测序及后续分析。

1.2筛选松材线虫侵染早期上调表达的基因进行候选效应子的筛选

选择在松材线虫侵染早期中上调倍数大于2的基因，并且对其进行信号肽及跨膜结构的预测。选择具有信号肽没有跨膜结构的上调基因作为候选效应子。

试验结果：在松材线虫早期转录组中共筛选到867个差异表达的基因，其中有 247个在侵染阶段上调表达的基因。经过有信号肽无跨膜结构的条件筛选，共有69个候选效应子被预测。

1.3候选效应子在本氏烟中的瞬时表达

载体构建：随机选择松材线虫侵染早期的15个上调表达明显的候选效应子，以松材线虫的DNA为模板，设计特异性引物，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞，南京，中国)试剂盒进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增这15个上调表达的基因。PCR扩增体系为：2×Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(25μL)，2×Phanta Max Buffer(1μL)，dNTP Mix (1μL)，正反向引物分别2μL(见表1)，DNA模板(1-5μL)，用双蒸水 (Distillation-distillation H₂O，ddH₂O)补足至50μL。PCR反应条件为：98℃5min； 98℃30s，55℃30s，72℃1min/kb，33个循环后，72℃10min。后利用同源重组试剂盒 Clone Express II One Step Cloning Kit(诺唯赞，南京，中国)的方法将其完整的编码区连接到病毒表达载体PVX(pGR107-3*HA)上。同源重组体系为：5*CELL Buffer (2μL)，ExnaseII(1μL)，克隆载体(25-100ng)，PCR产物(10-100ng)用ddH₂O补足至10μL。连接体系配好后，用枪头轻轻吸打混匀，37℃孵育30min后，立即放入冰上5min。吸取5μL连接产物到50μL大肠杆菌JM109感受态中，冰上静置30min 后，42℃热激90s，立刻放到冰上放置2min后，加入750μL不含有抗生素的液体 Luria-Bertani(LB)培养基，220rpm，37℃摇培1h，后5000rpm，离心1min，弃上清，留100μL菌液，枪头吸打混匀，然后将其涂布到含有卡那霉素的LB固体平板上，放置到37℃培养箱中过夜培养。挑取长出来的转化子进行PCR验证，验证后挑取单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，220rpm，37℃摇培过夜。按TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒步骤提取质粒(TaKaRa，Japan)，送公司测序。正确后取2μL质粒，加入到50μL农杆菌感受态GV3101，冰上静置 2min，用枪头全部吸取至电击杯中，电击(电压2.5kv)转化，后加入750μL不含有抗生素的LB液体培养基，200rpm，30℃摇培1h，后5000rpm，离心1min，弃上清，留100μL菌液，枪头吸打混匀，然后将其涂布到含有卡那霉素和利福平的LB固体平板上，放置到30℃培养箱中过夜培养。

表1 15个松材线虫候选效应子的PCR引物序列

试验结果：15个松材线虫候选效应子被成功克隆并转化到农杆菌GV3101中。

1.4农杆菌注射本氏烟

在含有卡那霉素和利福平的LB固体平板上挑取携带有目标基因的农杆菌单菌落加入到含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，220rpm，30℃过夜摇培。5000 rpm，3min离心2次后收集菌体，用洗菌缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES and 100μM AS，pH 5.6)悬浮菌体3次，用分光光度计将菌悬液的OD₆₀₀值调成0.4。最后用1mL注射器将菌液注射进本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中。注射试验分别用致病疫霉(P.infestan)PAMP INF1和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein， GFP)作为阳性和阴性对照。

试验结果：15个候选效应子通过农杆菌注射成功表达于本氏烟中，结果发现有一个基因编码(该基因编码区序列如SEQ ID NO.1所示)的蛋白(命名为BxCDP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)可以使本氏烟叶片发生坏死。而将其信号肽序列去除(BxCDP1nsp，编码BxCDP1nsp蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示)，同样表达于本氏烟却不能引起坏死；在紫外灯照射下，BxCDP1及致病疫霉(P. infestans)激发子INF1(Heese et al.，2007)引起的细胞坏死能明显观察到(图1a)。为进一步确定BxCDP1必须分泌到细胞质外体才能引起细胞坏死，通过将本氏烟病程相关蛋白1(PR-1)的信号肽(编码该信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.4所示)替代BxCDP1的信号肽(PR1SP-BxCDPInsp)并构建到pvx载体上(图1b)，注射本氏烟，同样发现，PR1 SP-BxCDPlnsp也能引起细胞坏死(图1c)。Western blot检测发现供测的基因编码的蛋白均能正常表达(图1d)。离子渗透试验用来量化供测基因触发烟草细胞坏死的程度。结果表明，BxCDP1，PR1 SP-BxCDP1nsp及INF1引起的细胞坏死程度明显高于BxCDP1nsp及绿色荧光蛋白GFP的处理(图1e)。

实施例2BxCDP1在沉默BAK1，SOBIR1及GFP的本氏烟中的表达

在实施例1农杆菌瞬时表达本氏烟的试验中，发现BxCDP1蛋白可以使本氏烟叶片发生坏死。用病毒介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技术，将本氏烟中模式识别受体的共受体brassinosteroidinsensitive 1-associated kinase 1(BAK1)和suppressor of BIR1-1(SOBIR1)相继沉默，并以沉默GFP的本氏烟作为对照。将病毒表达体pTRV1，pTRV2：BAK1，pTRV2：SOBIR1 and pTRV2：GFP质粒按实施例1中的1.3方法电转至农杆菌感受态GV3101中。将携带有上述载体的农杆菌按实施例1中的1.3方法用分光光度计调OD₆₀₀值为2。将携带有pTRV2：BAK1，pTRV2： SOBIR1，pTRV2：GFP的农杆菌与携带有pTRV1载体的农杆菌以1∶1混匀，分别注射到4叶期的本氏烟小苗的所有叶片上。过4-5周后，将携带有BxCDP1的农杆菌分别注射到沉默了BAK1，SOBIR1和GFP的本氏烟叶片上。结果发现，致病疫霉(P. infestan)的PAMP INF1引起的细胞坏死依赖于BAK1和SOBIR1，而疫霉属坏死诱导蛋白(Necrosis-inducing Phytophthora protein 1，NPP1)诱导的细胞坏死不依赖于这两者。因此，分别以INF1和NPP1分别作为对照。注射7天后观察本氏烟叶片细胞坏死情况。

试验结果：将BxCDP1、INF1及NPP1分别注射到沉默了BAK1、SOBIR1和 GFP的本氏烟叶片上，7天后发现，BxCDP1在沉默了SOBIR1和GFP的本氏烟上仍能引起坏死，但在沉默BAK1的本氏烟上则不再坏死(图2a)。用qRT-PCR检测 BAK1和SOBIR1的沉默效率，发现BAK1和SOBIR1被成功沉默(图2b)。离子渗透检测发现，BxCDP1在沉默了SOBIR1和GFP的本氏烟上引起的细胞坏死程度明显高于在沉默BAK1上的程度(图2c)。Western blot进一步证实供测基因编码的蛋白均正常表达(图2d)。

实施例3BxCDP1纯蛋白的表达与纯化

将BxCDP1的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)通过PCR扩增后，其纯化产物连接到酵母表达载体pPICZαA上，按实施例1中的1.3方法将携带有BxCDP1 的pPICZaA载体热激转化到大肠杆菌感受态Top10中，按实施例1中的1.3方法提质粒，并送公司测序。测序正确后将质粒线性化再将其按实施例1中的1.3方法电转到酵母感受态KM71H中，电转完成后立即加入500μL山梨醇到感受态中。成功转化的转化子放入含有100μg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast extract peptone dextrose medium，YPD)固体平板上30℃生长3天。含有甘油的缓冲性复杂培养(Buffered glycerol-complex medium，BMGY)和含有甲醇的缓冲性复杂培养基 (Buffered Methanol-complex Medium，BMMY)分别用来培养和诱导BxCDP1在酵母中表达。取电转成功的酵母转化子加入到含有博来霉素的YPD液体培养基中，220 rpm，30℃过夜摇培。后取500μL菌液加入到40mL的BMGY培养基中，并加入5mL酵母氮源培养基(Yeast nitrogen base，YNB)，200rpm，30℃摇培1天后，摇瓶静置至菌体完全沉淀，后倒掉上清液，将BMMY培养基倒入摇瓶中，并加入300μL甲醇继续摇培4天，期间每隔24小时向摇瓶中添加300μL甲醇。将培养后的菌体倒入50mL 离心管，6500rpm，离心10min，收集上清。吸取20μL酵母上清进行SDS-PAGE电泳，确认BxCDP1已被诱导出来。之后将剩余上清进行抽滤处理，然后过镍柱回收。收集完成后用酶标仪测试蛋白浓度。另外，将过过镍柱的蛋白加入到透析袋中，将透析袋放入1L 1x PBS缓冲液中，用保鲜膜封口并放4℃过夜。之后将透析袋中的纯蛋白用离心管收集分装，于-80℃保存备用。

试验结果：BxCDP1被成功诱导，并且最终诱导出的浓度为1995μg/mL(图3)。

实施例4BxCDP1纯蛋白在烟草、拟南芥、番茄、辣椒及生菜叶片中的表达

用1x PBS缓冲液将纯化达到的BxCDP1纯蛋白稀释至300nM，后按实施例1中的 1.4方法将其分别注射烟草、拟南芥、番茄、辣椒及生菜叶片，注射方法按实施例1中的1.4所述。

试验结果：为检测BxCDP1纯蛋白的活性，首先将BxCDP1纯蛋白用1x PBS稀释到不同浓度，分别注射本氏烟。结果表明，BxCDP1纯蛋白诱导本氏烟细胞坏死的最低浓度为100pM(图4)。烟草叶片经台盼蓝染色再脱色后，能明显观察到本氏烟的细胞坏死情况(图4)。用BxCDP1纯蛋白瞬时表达于多种植物，结果发现，除能引起本氏烟细胞坏死外，300nMBxCDP1纯蛋白还能够引起拟南芥、番茄、辣椒及生菜的细胞坏死(图5)。说明BxCDP1引起多种植物防御反应的能力具有一定的广谱性。

实施例5BxCDP1纯蛋白在沉默BAK1、SOBIR1及GFP的本氏烟中的表达

用1x磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)缓冲液将纯化达到的BxCDP1纯蛋白稀释至300nM，后将其分别注射到沉默了BAK1、SOBIR1及GFP的本氏烟中。按实施例1中的1.4方法所述。

试验结果：300nM BxCDP1纯蛋白分别注射到沉默了BAK1、SOBIR1及GFP的本氏烟中，结果发现，结果与用农杆菌携带BxCDP1瞬时表达于沉默了BAK1、 SOBIR1及GFP的本氏烟中的结果一致(图6a)。

实施例6BxCDP1纯蛋白诱导沉默BAK1、SOBIR1及GFP的本氏烟的活性氧产物的检测

从生长4-5周的以上三种沉默的本氏烟叶片上打直径为0.5cm的叶牒，放入96孔微型板中，用200μL ddH₂O浸泡过夜。后将ddH₂O吸去，加入200μL反应液(其中含有鲁米诺(35.4μg/mL)和过氧化物酶(10μg/mL)，分别加入1x PBS，100nM flg22 和1μM纯化的BxCDP1蛋白)浸泡相应的本氏烟的叶牒，立刻将96孔微型板放入 GLOMAX96微型板光度计上进行读数。

试验结果：BxCDP1纯蛋白在分别沉默了BAK1，SOBIR1及GFP的本氏烟中激发的活性氧(Reactive oxy gen species，ROS)产物存在明显差异。BxCDP1纯蛋白在沉默了SOBIR1及GFP的本氏烟中激发的ROS产物要明显高于其在沉默了BAK1的烟草中激发的ROS产物，且也明显高于对照1x PBS在三种本氏烟中激发的ROS产物的量(图6b)。这一结果说明，BxCDP1能够明显提高ROS的积累，激活本氏烟的免疫反应。

实施例7BxCDP1纯蛋白诱导本氏烟病程相关模式分子诱导的免疫(PTI)的检测

用1x PBS缓冲液将纯化得到的BxCDP1纯蛋白稀释至300nM，后将其分别注射到沉默了BAK1、SOBIR1及GFP的本氏烟中。注射3h后，分别取以上三种沉默的本氏烟叶片，液氮速冻后研钵研磨，按Plant Total RNA Kit(Zoman，Beijing，China)试剂盒说明书提取本氏烟叶片RNA。后用

II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)(诺唯赞，南京，中国)试剂盒反转录本氏烟RNA成cDNA，采用相对定量PCR(Quantitativereverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR) 检测本氏烟病程相关分子模式诱导的免疫(PTI)的标志性(Marker)基因的表达。

试验结果：用300nM BxCDP1纯蛋白分别注射到沉默了BAK1、SOBIR1及GFP 的本氏烟中，3h后取本氏烟叶片样品，提取中RNA及反转录，qRT-PCR检测结果表明，3个本氏烟PTImaker基因表达显著上升，进一步说明本氏烟的免疫反应被激活(图6c-e)。

实施例8 BxCDP1在松材线虫侵染松树早期的表达模式

以松材线虫侵染松树早期(6h、12h和24h)及0h的cDNA为模板，设计 BxCDP1的特异性引物(F：CCGAATTGGGAGTTGAAG，R：AATGGAGATGGTGGAAGG)，采用qRT-PCR对4个时间段中BxCDP1的相对表达量进行检测。

试验结果：qRT-PCR结果表明，BxCDP1在松材线虫3个侵染早期均明显上调表达，且在12h表达量达到最高(图7)。该结果表明，BxCDP1参与松材线虫与松树的互作，并且在侵染早期发挥重要作用。

实施例9 BxCDP1纯蛋白接种黑松后松树病程相关基因的表达检测

用1x PBS缓冲液将纯化达到的BxCDP1纯蛋白稀释至50μg/mL，采用皮接法接种到3年生黑松上，接种6h后取接种点以下1cm处的茎段约2cm，液氮速冻后研钵研磨，按实施例7中的方法提取松树茎段RNA，并反转录成cDNA，采用qRT-PCR检测松树病程相关基因(Pathogenesis related genes，PR genes)的表达。

试验结果：50μ扣L的BxCDP1纯蛋白接种到松树茎段6h后，取松树茎段提取总RNA并反转录成cDNA，qRT-PCR检测结果表明，松树病程相关基因PR-3及PR- 4相比于在对照中有明显上调表达(图8a)。说明BxCDP1能够有效激活寄主松树的防御反应。这为今后在寄主松树上寻找与其互作的靶标，并通过过表达靶标的方式来增强松树抗松材线虫病的能力提供了科学应用依据。

实施例10透射电镜观察BxCDP1纯蛋白接种的黑松细胞

用1x PBS缓冲液将纯化达到的BxCDP1纯蛋白稀释至50μg/mL，采用皮接法接种到3年生黑松上，接种10天后取接种点以下1cm的松树茎段，以形成层为中心，用刀片切去1x3mm的小木条，后用2.5％的戊二醛固定，后用1％的锇酸固定，然后用系列梯度酒精脱水，经过环氧丙烷过渡，Epon812树脂浸透包埋，用瑞典LKB-II型超薄切片机切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，最后用JEM-1400型透射电镜观察松树细胞内部结构。用1xPBS处理的松树作为对照。

试验结果：50μg/mL的BxCDP1纯蛋白接种到松树茎段10天后，在透射电镜下观察发现，1x PBS处理下，松树薄壁细胞完整，细胞无异常(图8b-d)，厚壁细胞的细胞壁光滑(图8e)。而经BxCDP1纯蛋白处理的松树薄壁细胞破裂，没有完整的细胞结构(图8f-h)，厚壁细胞的细胞壁皱缩明显(图8i)。这表明，BxCDP1能够引起寄主细胞的坏死。说明BxCDP1可能被寄主松树中的特异性互作靶标所识别而引起了寄主细胞坏死。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1及其应用

<130> 100

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> Bursaphelenchus xylophilus

<400> 1

atgaagtgtg ttgtggtcct ctgcgtcttg gccttctcca tggcccaagg cttcccaggc 60

attccatccc ttccaaaact ttcacctgta accctaccgg acatcccatc ccttccaaat 120

gttctacctg taactttgcc ggagccacaa gagccacttt tggaggcttt ggttcaaatt 180

ctcaaccaaa ttctggagga tctccacctt ccaaccgtcg atcccgaagc cgttactttc 240

cccgaattgg gagttgaagg agaccgagtc aagagagata tcttctctgg agtcactggc 300

cttccaccat ctccattggt cgtaatcatc gagcttctga acaagatcct cgaatctctg 360

aacctcccca ccgtcaaccc cgaagccgtc accatccctt ctgatgctgg ccgtgtcaag 420

agagatgcct tcgagccagt caccgctgag cccattttcg acgttctgct cgacatcctg 480

aaccagatct tggaatgtct gcacctgccc accatcaacc ctgaggaagt gaccgtccct 540

tcggaagagg gcggccgtgc caagagagat attcccttcg gaatcaccct tccttccgaa 600

aaccccctcg ctgaattgat cgccaagctc ttggagatca ttgccaaatt ggagagcttc 660

gaattcggaa ctggagcccc tctcccagtc accttcccat cattgtaa 708

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> Bursaphelenchus xylophilus

<400> 2

Met Lys Cys Val Val Val Leu Cys Val Leu Ala Phe Ser Met Ala Gln

1 5 10 15

Gly Phe Pro Gly Ile Pro Ser Leu Pro Lys Leu Ser Pro Val Thr Leu

20 25 30

Pro Asp Ile Pro Ser Leu Pro Asn Val Leu Pro Val Thr Leu Pro Glu

35 40 45

Pro Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Val Gln Ile Leu Asn Gln Ile

50 55 60

Leu Glu Asp Leu His Leu Pro Thr Val Asp Pro Glu Ala Val Thr Phe

65 70 75 80

Pro Glu Leu Gly Val Glu Gly Asp Arg Val Lys Arg Asp Ile Phe Ser

85 90 95

Gly Val Thr Gly Leu Pro Pro Ser Pro Leu Val Val Ile Ile Glu Leu

100 105 110

Leu Asn Lys Ile Leu Glu Ser Leu Asn Leu Pro Thr Val Asn Pro Glu

115 120 125

Ala Val Thr Ile Pro Ser Asp Ala Gly Arg Val Lys Arg Asp Ala Phe

130 135 140

Glu Pro Val Thr Ala Glu Pro Ile Phe Asp Val Leu Leu Asp Ile Leu

145 150 155 160

Asn Gln Ile Leu Glu Cys Leu His Leu Pro Thr Ile Asn Pro Glu Glu

165 170 175

Val Thr Val Pro Ser Glu Glu Gly Gly Arg Ala Lys Arg Asp Ile Pro

180 185 190

Phe Gly Ile Thr Leu Pro Ser Glu Asn Pro Leu Ala Glu Leu Ile Ala

195 200 205

Lys Leu Leu Glu Ile Ile Ala Lys Leu Glu Ser Phe Glu Phe Gly Thr

210 215 220

Gly Ala Pro Leu Pro Val Thr Phe Pro Ser Leu

225 230 235

<210> 3

<211> 657

<212> DNA

<213> Bursaphelenchus xylophilus

<400> 3

ttcccaggca ttccatccct tccaaaactt tcacctgtaa ccctaccgga catcccatcc 60

cttccaaatg ttctacctgt aactttgccg gagccacaag agccactttt ggaggctttg 120

gttcaaattc tcaaccaaat tctggaggat ctccaccttc caaccgtcga tcccgaagcc 180

gttactttcc ccgaattggg agttgaagga gaccgagtca agagagatat cttctctgga 240

gtcactggcc ttccaccatc tccattggtc gtaatcatcg agcttctgaa caagatcctc 300

gaatctctga acctccccac cgtcaacccc gaagccgtca ccatcccttc tgatgctggc 360

cgtgtcaaga gagatgcctt cgagccagtc accgctgagc ccattttcga cgttctgctc 420

gacatcctga accagatctt ggaatgtctg cacctgccca ccatcaaccc tgaggaagtg 480

accgtccctt cggaagaggg cggccgtgcc aagagagata ttcccttcgg aatcaccctt 540

ccttccgaaa accccctcgc tgaattgatc gccaagctct tggagatcat tgccaaattg 600

gagagcttcg aattcggaac tggagcccct ctcccagtca ccttcccatc attgtaa 657

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> Bursaphelenchus xylophilus

<400> 4

atgggatttg ttctcttttc acaattgcct tcatttcttc ttgtctctac acttctctta 60

ttcctagtaa tatcccactc ttgccgtgcc aggtca 96

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> BxCDP1的特异性引物F(Artificial)

<400> 5

ccgaattggg agttgaag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> BxCDP1的特异性引物R(Artificial)

<400> 6

aatggagatg gtggaagg 18

Claims

1.松材线虫的病原相关模式分子蛋白BxCDP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1的基因，其碱基序列如SEQ IDNO.1所示。

3.权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1作为PAMP的应用。

4.权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在触发本氏烟细胞坏死中的应用。

5.权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在触发植物细胞坏死中的应用。

6.权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在检测松树基础防御反应中的应用。

7.权利要求1所述的病原相关模式分子蛋白BxCDP1在提高松树抗松材线虫病中的应用。