CN110156781A

CN110156781A - 苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用

Info

Publication number: CN110156781A
Application number: CN201910543156.7A
Authority: CN
Inventors: 卫文强; 黄永伟; 王优; 杨育育; 李文博
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2019-08-23

Abstract

本发明提供了一种苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用，该化合物制备简单，以苝四甲酸二酐化合物和N,N‑二甲基乙二胺为原料，中间经过多个步骤，该化合物能抑制金黄色葡萄球的生长，K‑B法测得其抑菌圈达10 mm左右。将该化合物进行2倍梯度稀释，测得其抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）达6.25 mg/ml。生长曲线抑制试验显示，当非药物处理组细菌的生长曲线进入对数期后，化合物处理组的细菌的生长曲线仍处于迟缓期，表明该化合物能抑制金黄色葡萄球菌的分裂。该化合物的发现，未来不仅可以用于对金黄色葡萄球感染的控制，还可应用于抗菌生物材料的制备，具有一定的应用价值。

Description

苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌的特征、致病性、耐药性。金黄色葡萄球球菌属于葡萄球菌属，为革兰氏阴阳性菌，对人类具有致病性。该类菌营养要求不高，普通培养基可满足其需要，在固体培养基上菌落呈金黄色。在液体培养基，菌液浑浊。多数金黄色葡萄球菌的表面存在荚膜多糖，有助于细菌吸附到人体细胞或生物材料表面 (如生物瓣膜、导管、关节等)。葡萄球菌对外界环境的抵抗力比较强。金黄色葡萄球菌能引起皮肤或内脏多种器官的化脓性感染，感染皮肤，引起毛囊炎、痈、疖及伤口化脓，还可感染各种器官，引起肺炎、心包炎、中耳炎、骨髓炎气管炎。产肠毒素的金黄色葡萄球菌污染食物也可引起食物中毒。

目前，抗金黄色葡萄球菌的化合物包括beta-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类等各种抗生素，还有一些中成药。青霉素作为第一代beta-内酰胺类抗生素，对金黄色葡萄球菌及某些革兰氏阴性菌有很好的抑制作用。beta-内酰胺类抗生素主要通过抑制肽聚糖的合成，导致细菌细胞壁形成受阻。但细菌可以产生钝化酶，破坏了beta-内酰胺类抗生素的beta-内酰胺环，或者通过改变细胞壁成分和含量，降低青霉素的药效，从而产生了耐药性。随着青霉素的大量长期使用，约90%的菌株成为青霉素的耐药菌株。于是，出现了第二代、第三代等新型的beta-内酰胺类抗生素。尽管如此，新药的研发速度，仍然赶不上细菌的变异速度。特别是，最近几年，出现了对多种抗生素都具有耐药性的超级细菌，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌就是其中最著名的一种，该菌能引起皮肤、肺部、血液、关节感染。超级细菌的出现，严重威胁人类的健康。因此，不断开发新型的抗菌化合物势在必行。

生物材料在医学领域的应用越来越广泛，但一些致病菌可以通过荚膜或生物膜粘附到生物材料表面，导致人感染某些传染病。因此，研发具有抗菌性能的材料具有重要的应用价值。目前抗菌生物材料，包括光催化型和载银的纳米复合型抗菌材料、针对细菌酶或膜受体的抗菌材料、天然抗菌材料（如壳聚糖）。无机抗菌材料种类多，抗菌效果稳定、持久。有机抗菌材料应用需考虑其安全性与稳定性。天然抗菌材料来自天然植物，生物可容性好，但抗菌效果有限。目前，以纳米银为代表的抗菌剂具有制备简单、相对安全、抗菌效果稳定等优点，有广阔的应用前景。

发明内容

本发明提出了一种苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用，该化合物制备简单，由苝四甲酸二酐改造而来，即将苝四甲酸二酐两端的O原子酰胺化后得的，改造后的新化合物具有良好的水溶性、稳定性，可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，具有明显的抗菌效果。更重要的是，苝四甲酸二酐的酰胺化基团对抗菌作用是必须的，因为没有酰胺化的苝四甲酸二酐没有抑制金黄色葡萄球菌的作用，但是，带有酰胺化基团而无氯离子的PTCDI-1却具有抗菌作用。

实现本发明的技术方案是：

苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用，苝四甲酸二酐酰胺化化合物能够抑制金黄色葡萄球菌的生长，所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物的结构式如下：

或。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物分子式为C₃₄H₃₀Cl₄N₄O₄ ²⁺，命名为PDI-ACI，结构式如下：

。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物分子式为C₃₄H₃₄N₄O₄ ²⁺, 命名为PDI-I，结构式如下：

。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物分子式为C₃₄H₃₂Br₂N₄O₄ ²⁺，命名为PDI-2Br，结构式如下：。

对照药物苝四甲酸二酐化学式如下：。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物能够抑制金黄色葡萄球的生长，抑菌圈达10-12mm。

所述PDI-ACI能够抑制金黄色葡萄球的生长，抑菌圈达10 mm；而对照药物苝四甲酸二酐则无抗菌作用；而且，去掉氯离子后的衍生物PDI-I和PDI-2Br则有抗菌作用。这些结果说明，PDI-ACI或PDI-I或PDI-2Br两端的季铵盐结构直接发挥抗菌作用。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度达到6.25-12.5 mg/ml。

本发明所述化合物应用于在抗菌实验中：在固体和液体培养基中均能抑制金黄色葡萄球菌的生长。细菌培养温度为37℃，细菌与化合物的孵育作用时间为18 h。

所述抗菌实验方法，具体步骤如下：

（1）准备菌种；将金黄色葡萄球菌菌种分别在固体、液体培养基培养，并计数；

（2）稀释化合物：将苝四甲酸二酐酰胺化化合物原液用MH培养基稀释；

（3）化合物和细菌共同孵育：分别通过在固体培养基和液体培养基上加入金黄色葡萄球菌，然后加稀释后的苝四甲酸二酐酰胺化化合物，在37℃培养箱作用18 h，检测化合物的抑菌圈直径，利用酶标仪测菌液的OD600值。

纸片法测定抑菌圈：所述步骤（3）中将金黄色葡萄球菌涂布到MH固体平板上，然后放置直径为6mm的药敏纸片，在药敏纸片上滴加苝四甲酸二酐酰胺化化合物溶液；然后放入37℃培养箱培养18 h，测定抑菌圈直径。

测定化合物的最小抑菌浓度（MIC）：所述步骤（3）中将苝四甲酸二酐酰胺化化合物溶液进行梯度稀释，加入96孔板，然后加入金黄色葡萄球菌，将96孔板置于37℃培养箱培养18 h，用酶标仪测定OD600的值。

化合物对细菌生长曲线的影响：将化合物和细菌加入96孔板，置于37℃培养箱培养。在0，2，4，6，8，10 h用酶标仪测定OD600的值。以时间点为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制生长曲线。

所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物的制备方法如下：

（1）取苝四甲酸二酐化合物和N,N-二甲基乙二胺溶于有机溶剂中，通入氩气10min，之后120℃加热反应24h，反应后洗涤、干燥得到干燥产物；

（2）将步骤（1）中干燥产物和碘甲烷加入到甲苯中，通入氩气10min，85℃加热回流反应9-12h，反应后冷却洗涤、抽滤，真空干燥得到苝四甲酸二酐酰胺化化合物。

所述步骤（1）中苝四甲酸二酐化合物的结构式如下：，苝四甲酸二酐化合物和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为1：（10-16），有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮和冰乙酸的混合溶剂；步骤（2）中干燥产物和碘甲烷的摩尔比为（0.1-0.2）：（1.2-1.5）。

所述步骤（1）中苝四甲酸二酐化合物的结构式如下：，苝四甲酸二酐化合物和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为1：16，有机溶剂为喹啉，步骤（2）中干燥产物和碘甲烷的摩尔比为1:8。

37℃培养时，当非药物处理组金黄色葡萄球菌的生长曲线进入对数期后，苝四甲酸二酐酰胺化化合物处理的金黄色葡萄球菌的生长曲线仍处于迟缓期。

所述PDI-ACI的制备方法如下：

（1）取1 mmol四氯苝酐和16 mmol N,N-二甲基乙二胺溶于30 ml N-甲基吡咯烷酮和15ml冰乙酸中，先通氩气10 min，加热120 ℃反应24 h；结束后加入60 ml 2 mol/L的盐酸和60 ml无水乙醇，搅拌均匀，放入冰箱静置24 h，之后抽滤、乙醇洗涤，真空干燥；

（2）取0.15 mmol步骤（1）干燥产物与1.2 mmol碘甲烷溶于8 ml甲苯，通氩气10 min，85℃加热回流12 h，反应完毕后，冷却、抽滤，再用乙醚洗涤三次，真空干燥即得到PDI-ACI。

PDI-2Br制备方法如下：

取二溴酸酐1 mmol和N,N-二甲基乙二胺1.8ml溶于喹啉（10ml）中，160 ℃反应，先通氩气10 min，加热24 h。冷却抽滤，甲醇洗涤，真空干燥，得产物N,N-二甲基-二溴苝酰亚胺。取N,N-二甲基-二溴苝酰亚胺与碘甲烷以1:8比例（例如前者0.1mmol、后者0.8 mmol）溶于40ml甲苯，先通氩气10 min,后85℃加热回流12 h，反应完毕后，冷却，抽滤，再用乙醚洗涤三次，真空干燥即得到PDI-2Br。

PTI-I制备方法如下：

将3,4,9,10-苝四羧酸二酐（1 mmol；和四氯苝酐相比，后者在烷基位多了4个氯原子）、N,N-二甲基乙二胺（10 mmol））和冰醋酸（10 ml）依次加入到N，N—二甲基吡咯烷酮（NMP，20ml）中，在120 ℃的氩气保护下反应24 h。将反应后的混合物冷却到室温，加入无水乙醇和2M HCl 各50 ml，玻璃棒搅拌，静置，过滤，真空干燥，经柱层析精制（流动相：三氯甲烷（CHCl₃）），得到红色固体PICDI。.然后将PTCDI (0.188 mmol) 和碘甲烷（CH₃I，1.502 mmol)加入到甲苯（8 ml）中，85 ℃加热回流9h。然后加入乙醚沉淀抽滤，真空干燥。得到红色固体PTI-I。

本发明的有益效果是：

1）本发明使用PDI-ACI具有良好的水溶性，所用溶剂对人或其他动物细胞没有毒性。其次，化合物稳定，可在4℃长期放置，仍有抗菌效果。

2）本发明使用PDI-ACI可以明显抑制金黄色葡萄球菌的生长。同时，类似结构的苝四甲酸二酐酰胺化化合物PDI-I和PDI-2Br也具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。

3）将PDI-ACI进行2倍梯度稀释，测得其抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）达 6.25 mg/ml。生长曲线抑制试验显示，当非药物处理组细菌的生长曲线进入对数期后，化合物处理组的细菌的生长曲线仍处于迟缓期，表明该化合物能抑制金黄色葡萄球菌的分裂。该化合物的发现，未来不仅可以用于对金黄色葡萄球感染的控制，还可应用于抗菌生物材料的制备，具有一定的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为K-B法测定苝四甲酸二酐(A)、PDI-I(B)和PDI-2Br(C)对对金黄色葡萄球菌的抑制作用（抑菌圈），每个纸片的化合物的质量分别为：#1-20 μg；#2-40 μg；#3-80 μg ；#4、#5和#6为DMSO。

图2为K-B法测定PDI-ACI的抑菌圈，（A）K-B法测定化合物的抑菌作用，（B）柱状图显示抑菌圈的直径（mm）；每个纸片的化合物的质量分别为：1-20 μg；2-40 μg；3-80 μg；4-H₂O。

图3为不同浓度PDI-ACI化合物作用后，金黄色葡萄球菌的数量的变化。

图4为测定PDI-ACI抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）。

图5为PDI-ACI化合物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

主要材料：

金黄色葡萄球菌：购自中国食品药品检定研究院下属的中国医学细菌保藏管理中心（CMCC），菌号26001，批号26。

常用培养基和溶液：

MH液体和固体培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；超纯水，实验室自制；青霉素（100 mg/ml），购自索莱宝公司。

主要仪器：

酶标仪，型号Multiskan FC，购自赛默飞公司；

普通生化培养箱，购买自上海一恒仪器公司。

实施例1

本实施例提出一种抗金黄色葡萄球菌的化合物：PDI-ACI，具有以下分子结构式：

该化合物的制备方法如下：

取四氯苝酐和N,N-二甲基乙二胺以1:16的比例（四氯苝酐1 mmol、N,N-二甲基乙二胺16 mmol）溶于N-甲基吡咯烷酮（30 ml）和冰乙酸（15 ml）中,120 ℃反应，先通氩气10 min，加热24 h。结束后加入60 ml 2 mol/L的盐酸和60 ml无水乙醇，用力搅拌，放入冰箱静置，24 h后抽滤，乙醇洗涤，真空干燥，得产物与碘甲烷以1:8比例（前者0.15 mmol、后者1.2mmol）溶于8 ml甲苯，85℃ 先通氩气10 min,后加热回流12 h，反应完毕后，冷却，抽滤，再用乙醚洗涤三次，真空干燥即得到PDI-ACI。

该化合物的波谱如下：

N, N’-双（2-（季铵基乙撑））- 1，6，7，12-四氯-3, 4 : 9, 10-苝二酰亚胺碘盐（PDI-ACI，产率：76 %）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.69 (s, 4 H), 4.48-4.52 (m, 4H), 3.67-3.70 (m, 4 H), 3.28-3.33 ppm (m, 18 H)。

实施例2

本实施例提出一种抗金黄色葡萄球菌的化合物：PDI-I，具有以下分子结构式：

。

PDI-I制备方法如下：

将3,4,9,10-苝四羧酸二酐（1 mmol；和四氯苝酐相比，后者在烷基位多了4个氯原子）、N,N-二甲基乙二胺（10 mmol））和冰醋酸（10 ml）依次加入到N，N—二甲基吡咯烷酮（NMP，20ml）中，在120 ℃的氩气保护下反应24 h。将反应后的混合物冷却到室温，加入无水乙醇和2M HCl 各50 ml，玻璃棒搅拌，静置，过滤，真空干燥，经柱层析精制（流动相：三氯甲烷（CHCl₃）），得到红色固体PDI-I。然后将PDI-I (0.188 mmol) 和碘甲烷（CH₃I，1.502 mmol)加入到甲苯（8 ml）中，85 ℃加热回流9h。然后加入乙醚沉淀抽滤，真空干燥。得到红色固体PDI-I。

实施例3

本实施例提出一种抗金黄色葡萄球菌的化合物：PDI-2Br，具有以下分子结构式：，

PDI-2Br制备方法如下：

应用

基于实施例1中所述化合物的抗金黄色葡萄球菌的应用：

1）准备菌种；将金黄色葡萄球菌菌种分别在固体、液体培养基培养，并计数。

2）稀释化合物：将实施例1中所述化合物原液用MH培养基稀释，供后续实验使用。

3）化合物和细菌共同孵育：分别通过在固体培养基和液体培养基加入细菌，然后加入化合物，在37℃培养箱作用18 h。检测化合物的抗菌作用。

在测试了上述苝四甲酸二酐酰胺化化合物的抑菌圈的基础上，重点以PDI-ACI为例，还测试了其最小抑菌浓度及其对细菌生长曲线的影响。

具体步骤如下：

一、准备菌种和化合物：

1. 准备菌种

（1）将金黄色葡萄球菌菌种同接种环划线于MH固体平板，37℃培养18 h。

从平板挑5个菌落到3 ml MH 培养基，37℃细菌培养箱过夜培养18 h。

（2）将菌液分别10⁴，10⁵稀释，取100 μl菌液涂布到MH固体平板，对菌落进行计数，计算原始菌液中细菌浓度；

2. 准备化合物

取一定质量的 PDI-ACI，加入灭菌水，使其浓度为20 mg/ml。

取一定质量的苝四甲酸二酐或PDI-I或PDI-2Br，加入DMSO，使其浓度为10 mg/ml。

二、K-B法测定不同浓度化合物抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

1. 取出MH平板，取100 μl 菌液（5×10 ⁵ CFU/ml）加入到9 cm的平板琼脂表面。用无菌的涂布棒涂布均匀。

2. 用灭菌的镊子取药敏纸片（直径6 mm），轻轻放入平板中，并轻压纸片使其紧贴琼脂。

3. 加入药液。在一个药敏纸片上加入不同浓度的待测药液10 μl（每个纸片上化合物量分别为20，40, 80μg），溶剂对照加10 μl 水或对应体积的DMSO。

4．将平板置于37℃培养箱培养18 h，观察结果。

5. 用直尺测量抑菌圈的直径，记录结果。

三．不同浓度化合物PDI-ACI对金黄色葡萄球菌的抑制作用

1. 稀释细菌，使其浓度为5×10 ⁵ CFU/ml。

2. 准备化合物：用MH肉汤稀释化合物，使其终浓度分别为100, 150, 200 μg/ml。

3. 在96孔板：阴性对照孔加入100 μl MH培养基；其余：每孔加入第2步稀释过的化合物100 μl。

4. 在96孔板，每孔加入100 μl细菌，此时化合物的终浓度分别为100, 150, 200μg/ml。

5. 37℃恒温培养箱培养18h。

6. 酶标仪测OD600值。

四、最小抑菌浓度的测定

1. 稀释细菌，使其浓度为5×10 ⁵ CFU/ml。

2. 准备化合物：用MH肉汤稀释待测化合物PDI-ACI，使其浓度为200 μg/ml。

然后依次对化合物进行2倍梯度稀释。

3. 96孔板，每孔加入100 μl化合物。每个浓度重复3次。阳性对照：青霉素（Amp）：100 μl（100 μg/ml）。另设，细菌对照和培养基空白对照。

4. 96孔板，每孔加入100 μl细菌。

5. 在18h测OD600的值。

以OD600值比MH低的最大稀释度对应的浓度作为该化合物的最小抑菌浓度。

五、化合物对细菌生长曲线的影响

1. 稀释金黄色葡萄球细菌，使其浓度为5×10 ⁵ CFU/ml。

2. 用MH肉汤稀释待测化合物PDI-ACI，使其浓度为200 μg/ml。

3. 在96孔板，每孔加入100 μl化合物。对照孔分别加入100 μl MH培养基、100 μl青霉素（50 mg/ml）。每个样品设3个平行重复。

4. 在96孔板，每孔加入100 μl细菌。此时化合物的终浓度为100 μg/ml。

5. 分别在0、2、4、6、8、12、24 h测OD600的值。

6. 以时间为横坐标，以细菌OD600值为纵坐标绘制生长曲线图。

本发明成功设计和合成了PDI-ACI，其水溶性好，便于操作，通过药敏实验，证实该化合物具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.苝四甲酸二酐酰胺化化合物在抗金黄色葡萄球菌中的应用，其特征在于：苝四甲酸二酐酰胺化化合物抑制金黄色葡萄球菌的生长，所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物的结构式如下：

或。

2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物能够抑制金黄色葡萄球的生长，抑菌圈达10-12mm。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度达到6.25-12.5 mg/ml。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于具体步骤如下：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中将金黄色葡萄球菌涂布到MH固体平板上，然后放置直径为6mm的药敏纸片，在药敏纸片上滴加苝四甲酸二酐酰胺化化合物溶液；然后放入37℃培养箱培养18 h，测定抑菌圈直径。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中将苝四甲酸二酐酰胺化化合物溶液进行梯度稀释，加入96孔板，然后加入金黄色葡萄球菌，将96孔板置于37℃培养箱培养18 h，用酶标仪测定OD600的值。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述苝四甲酸二酐酰胺化化合物的制备方法如下：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中苝四甲酸二酐化合物的结构式如下：

，苝四甲酸二酐化合物和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为1：（10-16），有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮和冰乙酸的混合溶剂；步骤（2）中干燥产物和碘甲烷的摩尔比为（0.1-0.2）：（1.2-1.5）。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中苝四甲酸二酐化合物的结构式如下：，苝四甲酸二酐化合物和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为1：16，有机溶剂为喹啉，步骤（2）中干燥产物和碘甲烷的摩尔比为1:8。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：37℃培养时，当非药物处理组金黄色葡萄球菌的生长曲线进入对数期后，苝四甲酸二酐酰胺化化合物处理的金黄色葡萄球菌的生长曲线仍处于迟缓期。