CN110151813B - 一种党参提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，涉及一种中药提取物及其制备方法和应用，具体涉及一种党参提取物及其制备方法和应用。在制备党参提取物时，在党参水提体系中加入β‑葡萄糖苷酶和活化剂，活化剂含有赖氨酸和海藻酸钠两种成分。本技术方案使用酶解法对党参细胞壁进行降解，并使用酶的活化剂加强酶解作用，增加了党参细胞内的活性物质的释放量，从而增加了党参提取物制备效率。本方案可应用于党参活性成分提取，党参保健品、化妆品和药品的制备和研发等实践中。

Description

一种党参提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及一种中药提取物及其制备方法和应用，具体涉及一种党参提取物及其制备方法和应用。
背景技术
党参(radix codonopsis)是我国传统名贵中药材,《中国药典》记载党参性味甘平，归脾、肺经，具有补中益气、健脾益肺等功效。党参的功效成分主要为多糖类、皂苷类。党参多糖的功能主要是增强免疫力、辅助改善记忆、缓解体力疲劳、改善营养性贫血功能、对胃黏膜损伤有辅助保护功能等。党参皂苷的功能主要是辅助降血脂功能、辅助降血压功能、提高缺氧耐受力、改善营养性贫血等。党参作为中医传统的补虚药，广泛应用于药食同源的保健食品中。党参提取物具有广泛的应用前景，在药品和保健品领域具有很高的开发价值。
中国专利CN102525901B兽用党参多糖口服液及其制备方法公布了一种党参多糖的制备方法：将党参粉碎，经脱酯脱色，加8-12倍水提取1-3次，每次1-3h，经淀粉酶酶解，浓缩醇沉后加入18-48g木瓜蛋白酶，酶解2h，经离心过滤后得党参多糖溶液。上述方案存在淀粉酶酶解效率不高，党参细胞壁不能充分酶解，党参细胞中多糖等活性物质不能充分释放等的问题。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种党参提取物的制备方法，该方法使用酶解法对党参细胞壁进行降解，并使用酶的活化剂加强酶解作用，增加了党参细胞内的活性物质的释放量，从而增加了党参提取物制备效率。
为达到上述目的，本发明提出了以下技术方案：
一种党参提取物的制备方法，包括以下步骤：
预处理步骤：对党参药材进行匀浆处理，过滤取固相部分，得党参药渣；
党参多糖提取步骤：在党参药渣中分别加入水、β-葡萄糖苷酶和活化剂，得水提体系,使水提体系进行酶促反应；过滤酶促反应后的水提体系，得水提液和滤渣；所述活化剂含有赖氨酸和海藻酸钠两种成分。
采用上述技术方案，技术原理为：β-葡萄糖苷酶降解党参细胞壁内的纤维素，使细胞壁结构产生局部的坍塌、溶解，使胞内有效成分充分渗透到提取液中，达到提取党参活性成分目的。赖氨酸和海藻酸钠联合使用具有促进β-葡萄糖苷酶活性的功能，进一步增加β-葡萄糖苷酶对党参细胞壁的降解作用，提高党参活性物质提取率。采用本技术方案提取的得到的水提液中含有大量党参多糖，而滤渣部分可以继续用于党参其他活性成分的提取。
其中，党参药材在本发明中是指桔梗科植物党参(Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.)、素花党参(西党参)(Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen)或川党参(Codonopsis tangshen Oliv.)的新鲜的根。
本技术方案的有益效果具体如下：
提取党参水溶性有效成分主要的方式包括熬煮法、超声法、酶解法和热回流提取法。其中，酶解反应具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、副产物少等优点，而且因其专属性和高效性，能更好的保留提取物中的活性物质。植物的细胞壁主要成分是纤维素，由于很多细胞产物都被包裹在胞内，所以需要将细胞壁破碎，让胞内的活性成分进入提取溶剂中。酶解法提取党参水溶性有效成分一直是热门研究领域。但是因为酶的专一性和敏感性，如何选用正确的酶系和有效的催化方法一直是研究的重难点。现有技术的方案采用淀粉酶酶解细胞壁的方法，但发明人研究发现淀粉酶对党参细胞壁纤维素的专一性和敏感性不佳，并不能较为高效的破坏党参细胞壁以达到提取活性成分的目的。本技术方案中选用的β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的重要一员，主要作用于纤维素。β-葡萄糖苷酶能够高效、温和地分解植物细胞壁纤维素，从而破坏细胞壁结构，产生局部的坍塌、溶解，使胞内有效成分充分渗透到提取液中。
为进一步加大酶活性，现有技术的技术方案通常会使用一些酶活化剂，β-葡萄糖苷酶的酶活化剂主要为含ca2+，zn2+等离子的试剂。但现有技术的做法存在如下缺点：选择合适的离子激活剂浓度对酶的激活是必要的，但过量的离子会抑制酶反应速度，而量不够又起不到激活作用，具有激活效果的离子浓度范围较窄，这就对选择适当离子浓度范围造成了困难。并且利用ca2+，zn2+等金属离子对β-葡萄糖苷酶进行活化，离子残留在后续的操作步骤中较难除去，会影响最终提取物产品的品质，限制提取物产品在保健品以及药品中的应用。本技术方案采用赖氨酸和海藻酸钠联合使用的方式，在加强β-葡萄糖苷酶的活性并提高酶对纤维素的水解效率的同时，克服了现有技术中的问题。
大部分研究指出，离子型表面活性剂对β-葡萄糖苷酶有抑制作用，从而限制了人们将离子型表面活性剂应用到纤维素酶类的活化剂中。发明人开始在提取体系中利用海藻酸钠和赖氨酸作为表面活性剂来促进党参提取物不同成分的融合。在研发过程中，发现在提取体系中加入海藻酸钠和赖氨酸可以提高提取效率，进而研究发现提取效率的提高是由于酶活被加强。作为离子型表面活性剂家族一员的海藻酸钠却表现出了恰恰相反的酶促作用。在赖氨酸的修饰作用下，海藻酸钠能够促进β-葡萄糖苷酶的活性。关于赖氨酸和海藻酸钠联合使用增强β-葡萄糖苷酶活性的原理，发明人根据实验现象分析如下：在水溶液环境中，赖氨酸除有α-氨基外，在侧链上还有一个携带正电荷的-NH2而β-葡萄糖苷酶的催化中心含有天冬氨酸和谷氨酸基团，带负电荷，因此两者在电荷的作用下相互吸引，紧密结合。由于赖氨酸和海藻酸钠分子交联，从而增加了海藻酸钠和酶的结合，海藻酸钠和赖氨酸在水溶液中形成的空间网状结构，包裹住酶的催化域，稳定了酶的结构，从而提高了酶的稳定性，避免酶的失活，并增加了酶的催化活性。由此可见，海藻酸钠和赖氨酸联合使用不但具有表面活性剂的作用，还达到了促进β-葡萄糖苷酶酶活的作用，具有预料不到的技术效果。
海藻酸钠是一种无毒，无味，生物相容性良好，可降解的，广泛应用于食品领域的优良表面活性剂，赖氨酸也属于人体必需氨基酸，确保了提取物的食用安全性。
另外，采用本技术方案提取得到的水提液中党参多糖含量高，党参多糖为党参的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血脂和抗衰老等作用。本技术方案提高了党参多糖在水提液中的含量，增加了活性成分的提取效率。本技术方案中得到的滤渣可以继续用于党参其他活性成分的提取，因为滤渣经过酶促反应处理，党参细胞壁已经被降解，易化了后续提取步骤。
综上所述，有益效果为：
(1)β-葡萄糖苷酶能够高效、温和的分解植物细胞壁纤维素，提高党参活性物质提取效率。
(2)赖氨酸和海藻酸钠联合使用具有促进β-葡萄糖苷酶活性的功能，克服了离子型表面活性剂抑制β-葡萄糖苷酶活性的技术偏见。
(3)提取过程中使用到的试剂安全无毒，确保了提取物的食用安全性。
(4)采用本技术方案提取得到的水提液中党参多糖含量高。
进一步，所述活化剂由如下方法制备：将1-3重量份的赖氨酸和3-5重量份的海藻酸钠混合并研磨，得固体分散体；将所述固体分散体溶于水，搅拌后静置，得活化剂。
采用上述技术方案，充分研磨混合后形成的固体分散体，固体分散体在水溶液中分散性更均匀，交联度更好，更能提高β-葡萄糖苷酶的酶活。
赖氨酸和海藻酸钠水溶性均很高，海藻酸钠分子空间结构呈网状，在水溶液中能够与赖氨酸相互交联，使赖氨酸与其紧密的结合在一起，形成致密的网状空间结构。先将赖氨酸和海藻酸钠组成的混合物溶于水，混合均匀，形成交联结构后，再将水溶液加入水提体系。如果将固体的成分直接加入水提体系，需要多余的时间和操作使赖氨酸和海藻酸钠溶解并形成交联。在上述过程中，可能会出现酶失活等影响最终提取效果的现象，本技术方案可以避免失活情况的产生。
进一步，在所述活化剂中，赖氨酸的浓度为0.2-0.6重量％，海藻酸钠的浓度为0.4-0.8重量％；所述活化剂的使用量为所述党参药材的重量的10-100％。
采用上述技术方案，使用0.4-0.8重量％的海藻酸钠和0.2-0.6重量％的赖氨酸，可以使海藻酸钠和赖氨酸高效且充分的形成交联，并对β-葡萄糖苷酶的活性有较好的促进作用，是优选的浓度范围。上述活化剂用量对β-葡萄糖苷酶的活性有较好的促进作用。
进一步，使水提体系进行酶促反应的方法如下：调整所述水提体系的pH值为6.0，并将水提体系置于温度为45-55℃的条件下，使水提体系进行酶促反应4-6h。
采用上述技术方案，上述pH值和温度可保证β-葡萄糖苷酶处于活性状态。酶促反应时间过长会导致酶失活，时间过短会导致细胞壁纤维素未被充分降解，达不到提高提取率的效果，本技术方案采用酶促反应4-6h的方式，可保证酶促反应的充分进行。
进一步，所述β-葡萄糖苷酶的使用量为所述党参药材的重量的1-10％；所述水的使用量为所述党参药材的重量的2-5倍。
采用上述技术方案，上述用量的β-葡萄糖苷酶和水有助于对党参的多糖成分充分提取，是优选的用量范围。
进一步，在党参多糖提取步骤之后还包括醇溶性物质提取步骤：使用无水乙醇为溶剂对党参多糖提取步骤中的所述滤渣进行热回流提取，然后过滤取液相部分，经减压浓缩后得醇提液。
采用上述技术方案，通过醇提步骤可以将党参中醇溶性物质提取出来(如部分皂苷、甾醇等)，可对多糖提取后的滤渣进行充分利用，对党参各种溶解性的活性物质充分提取。
进一步，在醇溶性物质提取步骤中，热回流提取的温度条件为75℃，提取时间为1-1.5h。
采用上述技术方案，上述热回流条件可以保证药渣中的皂苷等有效成分充分提取，且不会破坏有效成分。
进一步，所述党参提取物包括党参多糖提取步骤中的所述水提液和醇溶性物质提取步骤中的所述醇提液。
采用上述技术方案，单独的水提和醇提的操作仅能分别提取出党参的水溶性成分(主要为多糖)和醇溶性成分。如果单独使用水溶性成分或醇溶性成分到保健品、食品或化妆品的制备当中，存在营养成分不全的问题。本技术方案将水提液和醇提液混合制得党参提取物，使得党参提取物的营养成分全面，具有更高的营养价值。
进一步，党参提取物由如下方法制备而成：将党参多糖提取步骤中的所述水提液和醇溶性物质提取步骤中的所述醇提液混合，得混合提取液，在混合提取液中同时加入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠，混匀后于4℃静置过夜，然后过滤取液相部分，得党参提取物。
采用上述技术方案，水提液和醇提液相容性欠佳，需要加入表面活性剂羧甲基纤维素钠和海藻酸钠，使得水提液和醇提液两部分能够充分混合，形成稳定的混合物。另外，党参多糖提取步骤中加入的海藻酸钠也可起到促进水提液和醇提液混合的作用。在此步骤中，额外加入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠，进一步促进了水提液和醇提液的混合。
进一步，党参提取物在保健品、化妆品或药品中的应用。
采用上述技术方案，党参是一种药食同源的中药材，本方案制备的党参提取物包括了水溶成分和醇溶成分，活性成分全面，可应用到保健品、化妆品和药品的制备中。
附图说明
图1为实验例2中的多糖标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明，其中：
实施例1-3为使用本发明技术方案制备党参提取物的制备实例；
对比例1为使用传统水提法制备党参提取物的制备实例；
对比例2为单独使用酶解法制备党参提取物的制备实例；
实验例1为通过滤纸酶活性(FPA)测定法，检测赖氨酸和海藻酸钠对β-葡萄糖苷酶活性的影响；
实验例2为测定赖氨酸、海藻酸钠和β-葡萄糖苷酶协同作用下的酶解效率。
实施例1：利用本发明技术方案制备党参提取物
(1)活化剂的制备：赖氨酸(纯度99％,上海生工)和海藻酸钠(纯度99％,上海生工)按质量比1:4混合并研磨10min使充分混匀，过80目筛，得固体分散体。加去离子水溶解赖氨酸-海藻酸钠的固体分散体，并使海藻酸钠的终浓度为0.8重量％，赖氨酸终浓度为0.2重量％，室温搅拌15min，使其呈均匀体系，静置脱泡处理2h,即得活化剂。该活化剂的保存条件为4℃避光保存，并在配置完成后24h之内使用。
(2)党参药材的预处理：取新鲜党参50g(即党参药材)洗净，沥干，切为1-2cm大小，放入搅拌机，加入3倍重量的纯水(150g纯水)，以10000rpm的转速搅拌10min。将搅拌机内的液体倒出，过滤，得初滤液和党参药渣。清洗党参药材可以避免附着在党参表面的泥土、病原菌等对提取过程和最终产品品质的影响，切段为1-2cm大小可以使党参药材和水提体系的接触面积更大，更有利于酶与药材的接触和附着，增大提取效率，可获得更多的提取产物。
(3)党参多糖的提取：党参药渣加入新鲜党参重量3倍的纯水(150g纯水)，加入β-葡萄糖苷酶(纯度99％,上海生工)，β-葡萄糖苷酶的加入量为新鲜党参的质量的5％(即2.5g)，同时加入步骤(1)中的活化剂25g，得水提体系。用1mol/L柠檬酸溶液调整水提体系的pH至6.0，50℃酶促反应5h，然后95℃灭活10min，过滤，得水提液和滤渣。取10ml水提液，75℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算即得水提物干重。
(4)醇溶性物质的提取：取(3)中的滤渣，向滤渣中加入鲜党参重量3倍的无水乙醇(150g无水乙醇)，75℃热回流提取1.5h，过滤。取10ml滤液，70℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算即得醇提物干重。将剩余滤液减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得醇提液。
(5)将初滤液，水提液和醇提液混合，在上述初滤液，水提液和醇提液组成的混合液中分别加入羧甲基纤维素钠(纯度99％,上海生工)和海藻酸钠，使得羧甲基纤维素钠终浓度为0.1重量％，海藻酸钠终浓度为0.1重量％，混匀后于4℃静置过夜，过滤，得党参提取物。
(6)计算投料和产出比率，如表1所示：
表1：采用实施例1的方案制备党参提取物的投料和产出比率
鲜党参投料总重 水提物干重 醇提物干重
重量(g) 50 4.5 3.54
投料产出比 16.0％ 9.0％ 7.0％
实施例2：利用本发明技术方案制备党参提取物
本实施例制备方法基本同实施例1，不同点在于步骤(1)和(3)。
在本实施例中，步骤(1)如下：
活化剂的制备：赖氨酸和海藻酸钠按质量比2:3混合并研磨10min使充分混匀，过80目筛，得固体分散体。加去离子水溶解赖氨酸-海藻酸钠的固体分散体，并使海藻酸钠的终浓度为0.6重量％，赖氨酸终浓度为0.4重量％，室温搅拌15min，使其呈均匀体系，静置脱泡处理2h,即得活化剂。该活化剂的保存条件为4℃避光保存，并在配置完成后24h之内使用。
在本实施例中，步骤(3)如下：
党参多糖的提取：党参药渣加入新鲜党参重量3倍的纯水(150g纯水)，加入β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的加入量为新鲜党参的质量的10％(即5g)，同时加入活化剂50g，得水提体系。用1mol/L柠檬酸溶液调整水提体系的pH至6.0，55℃酶促反应4h，然后95℃灭活10min，过滤，得水提液和滤渣。提取完成后计算投料和产出比率，如表2所示：
表2：采用实施例2的方案制备党参提取物的投料和产出比率
鲜党参投料总重 水提物干重 醇提物干重
重量(g) 50 4.0 3.2
投料产出比 14.4％ 8％ 6.4％
实施例3：利用本发明技术方案制备党参提取物
本实施例制备方法基本同实施例1，不同点在于步骤(1)和(3)。
在本实施例中，步骤(1)如下：
活化剂的制备：赖氨酸和海藻酸钠按质量比1:1混合并研磨10min使充分混匀，过80目筛，得固体分散体。加去离子水溶解赖氨酸-海藻酸钠的固体分散体，并保证海藻酸钠的终浓度为0.5重量％，赖氨酸终浓度为0.5重量％，室温搅拌15min，使其呈均匀体系，静置脱泡处理2h,即得活化剂。该活化剂的保存条件为4℃避光保存，并在配置完成后24h之内使用。
在本实施例中，步骤(3)如下：
党参多糖的提取：党参药渣加入新鲜党参重量3倍的纯水(150g纯水)，加入β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的加入量为新鲜党参的质量的1％(即0.5g)，同时加入活化剂5g，得水提体系。用1mol/L柠檬酸溶液调整水提体系的pH至6.0，45℃酶促反应6h，然后95℃灭活10min，过滤，得水提液和滤渣。提取完成后计算投料和产出比率，如表3所示：
表3：采用实施例3的方案制备党参提取物的投料和产出比率
鲜党参投料总重 水提物干重 醇提物干重
重量(g) 50 4.1 3.0
投料产出比 14.2％ 8.2％ 6％
对比例1：传统水提法制备党参提取物
(1)新鲜党参50g洗净，沥干，切为1-2cm大小，放入搅拌机，加入3倍重量的纯水(150g)，以10000转/分钟搅拌10min。将搅拌机内的液体倒出，过滤，得滤液1和滤渣2。
(2)滤渣2加入新鲜党参重量2倍的纯水(100g)，105℃热回流提取，提取2h，提取液放凉后，过滤，在滤渣中再加入鲜党参重量2倍的纯水(100g)，105℃热回流提取，提取1h，再次过滤，得到滤渣4，同时将两次水提的滤液合并，得滤液3。取10ml滤液3，75℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算后即得水提物干重。
(3)滤渣4加入新鲜党参重量3倍的无水乙醇(150g)，75℃热回流提取1.5h，过滤得滤液。取10ml上述滤液，70℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算后即得醇提物干重。将剩余滤液减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得醇提液5。
(4)计算投料和产出比率，如表4所示：
表4：采用对比例1的方案制备党参提取物的投料和产出比率
鲜党参投料总重 水提物干重 醇提物干重
重量(g) 50 3.25 3.57
投料产出比 13.6％ 6.5％ 7.1％
对比例2：酶解法制备党参提取物
(1)新鲜党参50g洗净，沥干，切为1-2cm大小，放入搅拌机，加入3倍重量的纯水(150g)，以10000rpm搅拌10min。将搅拌机内的液体倒出，过滤，得滤液1和滤渣2。
(2)滤渣2加入新鲜党参重量3倍的纯水(150g)，按新鲜党参质量的5％加入β-葡萄糖苷酶(2.5g)，用1mol/L柠檬酸溶液调整pH至5.5，45℃反应6h，95℃灭活10min，过滤，得滤液3和滤渣4。取10ml滤液3，75℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算后即得水提物干重。
(3)滤渣4加入鲜党参重量3倍的无水乙醇(150g)，75℃热回流提取1.5h，过滤得滤液。取10ml上述滤液，70℃减压浓缩至干燥，称量提取物重量，经换算后即得醇提物干重。将剩余滤液减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得醇提液5。
(4)计算投料和产出比率，如表5所示：
表5：采用对比例2的方案制备党参提取物的投料和产出比率
鲜党参投放总重 水提物干重 醇提物干重
重量(g) 50 3.45 3.49
投料产出比 13.9％ 6.9％ 7.0％
对比实施例1-3和对比例1-2，可知采用实施例1-3的提取方法，可以获得较高的投料产出比，即实施例1-3的提取方法提取效率更高。特别是在水提物(主要为党参多糖)的制备效率上，实施例1-3的提取方法较对比例1和2中的提取方法具有较大优势，其中实施例1的技术方案以及参数选择可实现最佳提取效果。
实验例1：过滤纸酶活性(FPA)检测
(1)主要仪器及试剂
β-葡萄糖苷酶，赖氨酸，海藻酸钠，柠檬酸，柠檬酸三钠，定性滤纸，上述试剂均购自上海生工；新鲜党参(药材市场采购，并经专家鉴定)，DNS试剂(自配)；紫外分光光度计(Evolution，赛默飞)。
(2)主要试剂配制方法
DNS试剂：称取3，5-二硝基水杨酸10g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中磁力搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并溶液澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7天后使用。
柠檬酸缓冲液：称取一水柠檬酸4.83g，溶于约750mL水中，溶解后，一边搅拌一边加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000mL。调节溶液的pH到4.8备用。
(3)待测酶液的制备
实验共设四组，添加β-葡萄糖苷酶和活化剂组(实验组)，添加β-葡萄糖苷酶组(对照组1)，添加β-葡萄糖苷酶和吐温-80组(对照组2：体现表面活性剂对酶的抑制作用)和不添加酶组(空白对照组)。每组实验设置三个重复，具体操作过程如下：
将50g党参药材置于纯水中，使用搅拌机10000rpm搅拌10min后过滤取滤渣，得党参滤渣。该操作重复12次，共制得12份党参滤渣。取3份党参滤渣，在3份党参滤渣中均加入新鲜党参重量3倍的纯水(150g)和β-葡萄糖苷酶2.5g，作为对照组1；取3份党参滤渣，在3份党参滤渣中均加入125g纯水，β-葡萄糖苷酶2.5g和实施例1中配置的活化剂25g，作为实验组；取3份党参滤渣，在3份党参滤渣中均加入鲜党参重量3倍的纯水(150g)，β-葡萄糖苷酶2.5g和0.25g的吐温80，作为对照组2；取3份党参滤渣，在3份党参滤渣中均加入鲜党参重量3倍的纯水(150g)，不添加任何酶和其他试剂，作为空白对照组。在12份不同组中，均用1mol/L的柠檬酸溶液调整pH至6.0，50℃反应5h，取各组的反应液各1ml，作为待测酶液备用。
(4)滤纸酶活性(FPA)测定：
将待用滤纸放入干燥器中平衡24h，将水分平衡后的滤纸制成1cmx6cm的滤纸条，折成M型备用。取具塞试管，将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部。在试管中加入(3)中制备的待测酶液1ml，同时加入pH4.8的柠檬酸缓冲液1ml。将试管置于50℃水浴锅中，准确计时，反应60min，取出，再将试管置于沸水中，沸水浴灭活10min，冷却至室温，在试管中加入3ml DNS试剂，显色后将试管内液体稀释3倍，于520nm处测定OD值，值越高说明该酶活力越强。
(5)实验结果
表6：滤纸酶活性(FPA)测定
Figure BDA0002071980260000101
从上表6中能看出，除开空白对照组，其余三组中酶都有活性，但是实验组的酶活性最高，而对照组1和对照组2相比，酶活性相差不大。
实验例2：测定酶解效率
(1)主要仪器及试剂
β-葡萄糖苷酶，赖氨酸、海藻酸钠，5％苯酚溶液，葡萄糖，上述试剂均购自上海生工；新鲜党参(药材市场采购，并经专家鉴定)；Thermo Varioskan Flash(赛默飞全波长多功能酶标仪)。
(2)党参多糖制备
实验共设三组，添加β-葡萄糖苷酶和活化剂组(实验组)，添加β-葡萄糖苷酶组(对照组1)和添加β-葡萄糖苷酶和吐温-80组(对照组2)。每组实验设置三个重复，具体操作过程如下：
将新鲜党参50g置于纯水中，使用搅拌机10000rpm搅拌10min后过滤取滤渣，在滤渣中加入鲜党参重量3倍的纯水(150g)。上述操作重复9次，共制得9份含党参滤渣的纯水浸泡体系。取3份含党参滤渣的纯水浸泡体系，在3份体系中均加入β-葡萄糖苷酶2.5g，作为对照组1；取3份含党参滤渣的纯水浸泡体系，在3份体系中均加入β-葡萄糖苷酶2.5g和实施例1中配置的活化剂25g，作为实验组；取3份党参滤渣的纯水浸泡体系，在3份体系中均加入β-葡萄糖苷酶2.5g和0.25g的吐温-80，作为对照组2。在9份体系中，均用1mol/L柠檬酸溶液调整pH至6.0，50℃反应5h，反应结束后过滤取滤液，将滤液浓缩处理后，得党参多糖固体，收集党参多糖固体备用。
(3)标准曲线绘制
精密称取的葡萄糖10mg(葡萄糖经105℃干燥至恒重)，将葡萄糖置于100ml容量瓶中加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得到0.1mg/ml对照品标准液。
精密吸取标准品液0，100，200，400，600，800，1000ul分置于15ml具塞试管中，依次加蒸馏水补足到2ml，各管再加入5重量％的苯酚溶液1ml，摇匀，并迅速加入浓硫酸5ml，等待5min后，将试管置于100℃油浴锅中加热10min，然后冰浴冷却5min，于490nm处测定吸光光度，绘制标准曲线，用吸光度对样品浓度作回归分析。
(4)多糖含量的测定
将提取的样品多糖10mg(即步骤(2)中的党参多糖固体)溶于100ml水中，摇匀，吸取800ul加蒸馏水稀释至2ml，各管再加入5％的苯酚溶液1ml，摇匀，并迅速加入浓硫酸5ml，等待5min后，将试管置于100℃油浴锅中加热10min，然后冰浴冷却5min，于490nm处测定吸光光度，结合标准曲线计算样品中的多糖含量(标准曲线见图1)。
(5)实验结果
党参多糖含量测定表见表7。
测得标准曲线方程为：
Y＝164.2X+0.99(R2＝0.999)
表7：党参多糖含量测定表
Figure BDA0002071980260000121
从表7中能看出，实验组得到的党参多糖最多，达到3.36g，是党参多糖提取最少的组(对照组2)的1.3倍多。而对照组2的党参多糖最少，仅2.55g。所以采用酶解法(β-葡萄糖苷酶)加酶的活化剂的方案可以使得提取物中的有效成分多糖的含量更高，增加了多糖的提取效率。由对照组2的实验数据可知，表面活性剂吐温-80对β-葡萄糖苷酶的活性有一定抑制作用，导致提取物中多糖含量较低。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种党参提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理步骤：对党参药材进行匀浆处理，过滤取固相部分，得党参药渣；
党参多糖提取步骤：在党参药渣中分别加入党参药材质量2-5倍的水、党参药材质量1-10％的β-葡萄糖苷酶和党参药材质量10-100％的活化剂，得水提体系,使水提体系在pH6.0和45-55℃的条件下进行酶促反应4-6h；过滤酶促反应后的水提体系，得水提液和滤渣；
所述活化剂由如下方法制备：将赖氨酸和海藻酸钠混合并研磨10min，过80目筛，然后加水溶解，室温搅拌15min，然后静置2h，获得所述活化剂；所述活化剂包括0.2-0.6重量％的赖氨酸和0.4-0.8重量％的海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种党参提取物的制备方法，其特征在于，在党参多糖提取步骤之后还包括醇溶性物质提取步骤：使用无水乙醇为溶剂对党参多糖提取步骤中的所述滤渣进行热回流提取，然后过滤取液相部分，经减压浓缩后得醇提液。
3.根据权利要求2所述的一种党参提取物的制备方法，其特征在于，在醇溶性物质提取步骤中，热回流提取的温度条件为75℃，提取时间为1-1.5h。
4.根据权利要求3所述的一种党参提取物的制备方法所制备的党参提取物，其特征在于，所述党参提取物包括党参多糖提取步骤中的所述水提液和醇溶性物质提取步骤中的所述醇提液。
5.一种党参提取物，其特征在于，其由如下方法制备而成：将权利要求3所述制备方法得到的水提液和醇提液混合，得混合提取液，在混合提取液中同时加入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠，混匀后于4℃静置过夜，然后过滤取液相部分，得党参提取物。
6.根据权利要求5所述的党参提取物在制备保健品、化妆品或药品中的应用。
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