CN110144345A - 一种从卵泡液中提取cfDNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从卵泡液中提取cfDNA的方法，通过对卵泡液样本两步离心去除多余细胞碎片；利用裂解液对卵泡液进行裂解，加入的蛋白酶K消化多余的蛋白，同时加入的Carrier RNA使DNA更易析出沉降；利用羧基磁珠对DNA的吸附作用；在高盐低pH的条件下，将卵泡液中的cfDNA吸附到磁珠上，经过盐洗涤和醇洗涤后，去除100bp以下的片段，洗脱后再次加入0.5倍体积的羧基磁珠，吸附并去除大于300bp的长片段，获得合适长度范围的cfDNA。同时对所获的cfDNA进行末端修复，产生平末端连接，并在3’末端添加碱基A，并在cfDNA两端添加接头并扩增纯化等，完成高通量文库的构建，最终完成上机测序。

Description

一种从卵泡液中提取cfDNA的方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种从卵泡液中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库。

背景技术

卵泡的发生是一个极为复杂和精细的过程，不仅涉及到各种细胞之间的相互作用与联系，还涉及到局部卵泡液生化成分的改变与影响。而卵泡液作为卵母细胞的赖以生存的微环境，直接影响卵母细胞的生长发育过程、受精能力及发育潜能。许多研究将其视为评价卵泡发育能力的辅助指标，对于进一步的优质胚胎筛选和临床妊娠的成功建立具有十分重要的意义。卵泡液因其取材方便、含有众多卵母细胞发育相关的因子而备受关注，越来越多的与卵母细胞质量相关的卵泡液标记物已被发现，如促性腺激素、细胞因子、MicroRNA、循环游离DNA(cfDNA)等。目前对于卵泡液的蛋白组学和MicroRNA研究较多，已形成较为完善的研究体系，但对于卵泡液中cfDNA仍缺乏较为系统的研究方法，主要原因是没有一种有效的专门针对卵泡液cfDNA的分离提取技术。

cfDNA是游离于细胞外的核酸，广泛存在于血浆、血清、胸水、卵泡液等细胞外体液中，血清和血浆中的cfDNA研究已逐渐应用于临床肿瘤的诊断和监测中。因此，卵泡液cfDNA的研究作为一种无创的检测手段在多囊卵巢综合症(PCOS)、卵巢炎、卵巢囊肿、卵巢破裂、卵巢早衰、卵巢肿瘤等卵巢疾病的诊断检测及卵细胞发生发育分子机制的研究中具有广阔的应用前景，为今后更好地预测卵母细胞质量，提高临床妊娠率，优化胚胎培养液的成分，获得更高质量胚胎提供有力的证据支持。

高通量测序技术在许多疾病的基因检测中得到广泛应用，也被广泛应用于cfDNA的研究中。高通量测序的展开要基于构建高质量的基因文库，但由于卵泡液中成分复杂，现有的基于硅胶膜柱的试剂盒更适应于血清和胸水cfDNA的提取，但在卵泡液中无法提取获得高质量的cfDNA，质检结果显示片段较多较杂，未见明显主峰，无法及进行后续测序文库的构建等实验操作，如图1所示，目前基于高通量测序技术对卵泡液cfDNA的研究较少，尚处于起步阶段。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种卵泡液中提取cfDNA的方法、试剂盒以及提取的卵泡液cfDNA测序文库的构建方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是cfDNA的分离、提取和检测技术，并将其应用于基于高通量测序的全基因组范围卵泡液cfDNA的检测和机制研究。

为实现上述目的，本发明提供了一种从卵泡液中提取cfDNA的方法，包括如下步骤：

(1)卵泡液的分离：对卵泡液进行两步离心分离得到上清；

(2)裂解：在离心管中加入1mg/ml蛋白酶K后，依次加入上清和裂解液，上清:蛋白酶K:裂解液的体积比为8～12:1～2:6～8，混合均匀，随后将离心管在50～65℃的温度下孵育30min；优选的，上清:蛋白酶K:裂解液的体积比为10:1:8。

(3)结合：在步骤(2)得到的样品中先加入异丙醇，混合均匀得到混合物后，再加入0.2倍体积的羧基磁珠从而对cfDNA进行吸附，异丙醇与样品的体积比为1:4；

(4)洗涤：先后用盐洗涤液和醇洗涤液对步骤(3)中的羧基磁珠进行洗涤；

(5)干燥：在20～30℃干燥4～10min，使得羧基磁珠干燥；

(6)洗脱：用洗脱液对干燥后的羧基磁珠进行洗脱，得到洗脱后上清液；

(7)二次洗脱：向步骤(6)中洗脱后的上清液中加入0.5倍体积的羧基磁珠，充分重悬，随后在磁性分离器上静置澄清，获得的上清液中包含cfDNA。

进一步的，裂解液包括100mM Tris-HCl,20-30mM EDTA,500mM NaCl,1％SDS，同时每毫升加入6μg Carrier RNA，盐洗涤液包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-5M盐酸胍、10-30mM EDTA-2Na、0.1-1％HCl，醇洗涤液包括75～80％vol的乙醇，洗脱液包括100ul的10mMTris-HCl，pH8.0。

本发明提供了一种从卵泡液中提取cfDNA的试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、Carrier RNA、羧基磁珠、盐洗涤液、醇洗涤液和洗脱液。优选的，蛋白酶K、裂解液、盐洗涤液、醇洗涤液和洗脱液的体积比范围是：50～100:30～80:20～200:2～30:5～10。

进一步的，裂解液包括100mM Tris-HCl,20-30mM EDTA,500mM NaCl,1％SDS，同时每毫升加入6μg Carrier RNA，盐洗涤液包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-5M盐酸胍、10-30mM EDTA-2Na、0.1-1％HCl，醇洗涤液包括75～80％vol的乙醇，洗脱液包括100ul的10mMTris-HCl，pH 8.0。

本发明提供了一种从卵泡液中提取得到的cfDNA构建得到的cfDNA文库。

本发明提供了权利要求7的cfDNA文库在基因测序中的应用。

本发明提供了一种从卵泡液中提取得到的cfDNA构建得到的cfDNA文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用如权利要求1的从卵泡液中提取cfDNA的方法得到100～300bp的cfDNA；

(2)对100～300bp的cfDNA依次进行末端修复、3'末端加上碱基A、两端加上接头、胶回收纯化，得到cfDNA文库。

本发明提供了一种cfDNA文库构建试剂盒及其在基因测序中的应用，该试剂盒中包含了权利要求4的提取cfDNA的试剂盒。

技术效果

本发明首次成功地从卵泡液中提取到了cfDNA，所获得的cfDNA纯度更高，使其更适合DNA文库的构建，减少了测序通量的浪费；

与现有技术相比，通过羧基磁珠直接对裂解后的体系进行cfDNA的提取，洗脱时去除100bp以下的DNA的干扰，再用羧基磁珠的分选作用对体系中300bp以上的DNA进行吸附分离，这种巧妙设计方法实现了传统硅胶膜无法进行的cfDNA的片段筛选，且省略了需要多次过滤或抽滤的步骤，简化了提取步骤，节省了时间和成本；

本发明在裂解过程中，采用先加入蛋白酶K、随后依次加入上清和裂解液，目的是为了防止裂解液对蛋白酶K进行干扰，有效的提高了蛋白酶K的效率。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是现有技术中利用硅胶膜柱试剂盒提取的卵泡液cfDNA 2100检测结果；

图2是本发明的一个较佳实施例的提取的卵泡液cfDNA 2100检测结果；

图3是本发明的一个较佳实施例的卵泡液cfDNA构建的原始文库电泳结果；

图4是本发明的一个较佳实施例的卵泡液cfDNA扩增文库的片段大小分布结果；

图5是本发明的一个较佳实施例的卵泡液cfDNA文库原始数据质检结果；

图6是本发明的一个较佳实施例的从卵泡液中提取cfDNA的流程图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明中所述的百分比在无特别说明的情况下是指质量百分比。

本发明的技术原理是通过对卵泡液样本两步离心去除多余细胞碎片。利用裂解液对卵泡液进行裂解，加入的蛋白酶K消化多余的蛋白，同时加入的Carrier RNA使DNA更易析出沉降。利用羧基磁珠对DNA的吸附作用。在高盐低pH的条件下，将卵泡液中的cfDNA吸附到磁珠上，经过盐洗涤和醇洗涤后，去除100bp以下的片段，洗脱后再次加入0.5倍体积的羧基磁珠，吸附并去除大于300bp的长片段，获得合适长度范围的的cfDNA。同时对所获的cfDNA进行末端修复，产生平末端连接，并在3’末端添加碱基A，并在cfDNA两端添加接头并扩增纯化等，完成高通量文库的构建，最终完成上机测序，见图6。

实施例1 cfDNA的提取

1、卵泡液分离和保存

离心机4℃预冷，3000g离心15min后小心吸取上清。再对上清进行16000g离心10min，吸取上清至新的离心管中。若当天使用可保存于4℃，如果较长时间保存则需要存放在-80℃。

2.1、配置裂解液

100mM Tris-HCl,20-30mM EDTA,500mM NaCl,1％SDS，同时每毫升加入6μgCarrier RNA，涡旋混匀。

2.2、裂解

取一个新的15ml离心管，加入100μl蛋白酶K(1mg/ml)，再依次加入1ml卵泡液和800μl裂解液，最大转速漩涡振荡30s，将离心管置于60℃孵育30min。

3、羧基磁珠吸附cfDNA

向上述离心管中加入0.5ml异丙醇，漩涡震荡30s后，加入200μl羧基磁珠，最大转速漩涡震荡1min后置于实验台，静置10min，然后将离心管于磁性分离器上放置3min至溶液澄清，吸弃上清(注意不要吸到磁珠)。

4.1、配置盐洗涤液和醇洗涤液

盐洗涤液：10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-5M盐酸胍、10-30mM EDTA-2Na、0.1-1％HCl。

醇洗涤液：80vol.％的乙醇。

4.2、洗涤

(1)加入1ml盐洗涤液于上述离心管中，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液。

(2)加入1ml无水乙醇，涡旋震荡30s，使磁珠重分重悬，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液。

(3)加入200μl 80％乙醇，涡旋震荡30s，使磁珠充分重悬，并转移重悬液至新的1.5ml离心管中，以最大转速继续涡旋震荡30s，并于室温下静置1min，然后将离心管置于磁性分离器上至溶液澄清，吸弃上清。

5、干燥

保持离心管于磁性分离器上，开盖于室温下静置4-10min后，待磁珠干燥后取下离心管(注意：不要干燥过度，影响洗脱)。

6、洗脱：加入100ul Tris-HCl(10mM，pH8.0)的洗脱液于离心管中，漩涡震荡30s使磁珠充分重悬，静置5min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5ml离心管中。

7、向洗脱得到的上清液中加入50μl羧基磁珠(或0.5×常用分选磁珠)，涡旋震荡30s，使磁珠充分重悬，静置5min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5ml离心管中。

8、再次加入0.5×体积的羧基磁珠，重复上述7的操作，此上清液即为纯化得到的cfDNA，保存于-20℃。

将提取的cfDNA用Agilent 2100进行质量鉴定，检测片段大小分布符合cfDNA特征，且质量很好，结果如图2。

实施例2高通量测序文库的构建

(1)cfDNA末端修复

按表1的反应体系在PCR管中加入相应样品和试剂，涡旋混匀并瞬离后放于PCR仪中，20℃孵育5min。反应结束，补充ddH₂O至体系终体积200μl。然后将其转移至新的1.5ml离心管中，向体系中加入200μl混合酚(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，pH＝8.0)(与待纯化样品等体积)，剧烈摇晃混匀，13000rpm，室温离心5min。将上清转移至新的1.5ml管中(注意此时不要吸到水相和有机相交界的蛋白层以免吸入蛋白质污染基因组DNA，可以不必完全吸尽水相，留一点避免污染)。加入在-20℃预冷的500μl无水乙醇(原始需要被纯化体系体积的2.5倍)，20μl醋酸钠(pH＝5.2)(原始需要被纯化体系体积的1/10)，5μl糖原，颠倒摇晃混匀，将样品放入-80℃冰箱，孵育30min。预冷低温离心机至4℃，将样品置于离心机，13000rpm，低温离心30min。取出样品，吸弃上清(注意不要吸到沉淀)，加入1ml 75％乙醇，轻晃使沉淀漂浮起来，13000rpm，4℃离心5min，洗涤沉淀一遍。从离心机中取出样品，吸弃上清(注意不要吸走沉淀)，快速离心，将残余的液体吸尽，打开管盖，晾干沉淀(注意不要使沉淀过干，以免影响样品得率)，最终用20ul Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)溶解重悬。

表1 cfDNA末端修复反应体系

组分	体积
		cfDNA样品	27μl
End Repair Mix(10×)	5μl
		End Repair Enzyme Mix	2.5μl
ddH<sub>2</sub>O	15.5μl
		总计	50μl

(2)cfDNA 3’末端加碱基A

按表2的配方加入相应样品和试剂。将反应体系涡旋混匀并瞬离，放于PCR仪中，70℃，孵育30min。孵育结束后，体系补ddH₂O补至终体积为200μl，然后将其转移至新的1.5ml离心管中，酚抽醇沉步骤同上，产物最终溶于5μl Tris-HCl(10mM，pH8.0)中。

表2 cfDNA 3’末端加A反应体系

组分	体积
		cfDNA	20μl
Ex Buffer(10×)	3μl
		dATP(10mM)	2.5μl
Ex Taq	0.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	4μl
总计	30μl

(3)cfDNA两端加测序接头

配制表3的反应体系。将反应体系涡旋混匀并瞬离，放于PCR仪中，16℃，过夜孵育。第二天孵育结束，体系补ddH₂O至终体积为200μl，然后将其转移至新的1.5ml离心管中，酚抽醇沉步骤同上，产物最终溶于10ul Tris-HCl(10mM，pH8.0)中。

表3 cfDNA两端加测序接头的反应体系

(4)胶回收纯化

为除去文库中的接头二聚体，使用2％琼脂糖胶电泳胶回收来进一步纯化文库，电泳结果如图3。结果显示图中标注的即为cfDNA经接头连接之后的主峰片段(298bp左右)，大小符合，质量较好。Zymo clean胶回收试剂盒用于原始文库DNA的纯化回收。准备一个干净的1.5ml离心管，将200-500bp范围的胶块(注意：尽量远离二聚体所在位置)切下放入管中，最终用10μl Elution buffer洗脱cfDNA的原始文库。

(5)文库扩增

以胶回收得到的同接头连接好的DNA文库为模板，使用高保真酶进行PCR反应，之后再次进行片段的筛选以得到可以进行测序的文库。在PCR管中完成扩增体系的配制，见表4。

表4 PCR反应体系

组分	体积
		cfDNA	10μl
dNTP Mix(2.5mM)	2μl
		5×Q5 Reaction Buffer	5μl
Q5高保真聚合酶(2U/μl)	0.5μl
		P5/P7接头	DNA和接头摩尔比1:20
ddH<sub>2</sub>O	至总体积为25μl

混匀体系，将PCR管放入PCR仪中，热盖设为105℃，按照表5的扩增程序进行PCR扩增。

表5 PCR扩增程序

将PCR产物同Loading Buffer按比例混匀后加至2％的琼脂糖凝胶的胶孔中进行电泳，以实现待测文库和接头片段、引物片段的分离。具体的凝胶配置方法、电泳条件以及切取的片段范围、胶块中的DNA回收与连接测序接头后的回收步骤相同。接头二聚体的去除还可以通过Ampure XP beads纯化去除。

(6)将建库产物用Qubit进行定量并用Agilent Bioanalyzer 2100进行片段大小检测后即可进行高通量测序。如图4所示，在接头二聚体的位置(即121bp左右)没有信号，即在扩增文库中已将其除尽，且主峰片段大小与cfDNA文库一致，含有121bp测序接头的文库的主峰均为298bp左右，表明文库质检合格，可以上机测序。

实施例3高通量测序

利用Illumina Hiseq 2000对实施例2中的cfDNA的高通量测序文库进行高通量测序。测序数据利用Fastqc软件进行基本的质检，数据质量合格后方可进一步使用。测序所用到的PCR引物序列见表6。

表6 PCR引物序列

双端测序质检结果如图5所示，绝大部分的碱基质量均在30以上，表示数据质量良好。其中条形柱的含义是25％-75％的数据分布，只有其总质量分数在30(表示测序错误率为千分之一)以上的数据才能进一步分析。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种从卵泡液中提取cfDNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)卵泡液的分离：对卵泡液进行两步离心分离得到上清；

(2)裂解：在离心管中加入1mg/ml蛋白酶K后，依次加入所述上清和裂解液，所述上清:蛋白酶K:裂解液的体积比为8～12:1～2:6～8，混合均匀，随后将离心管在50～65℃的温度下孵育30min；

(3)结合：在步骤(2)得到的样品中先加入异丙醇，混合均匀得到混合物后，再加入0.2倍体积的羧基磁珠从而对cfDNA进行吸附，所述异丙醇与所述样品的体积比为1:4；

(4)洗涤：先后用盐洗涤液和醇洗涤液对步骤(3)中的羧基磁珠进行洗涤；

(5)干燥：在20～30℃干燥4～10min，使得羧基磁珠干燥；

(6)洗脱：用洗脱液对干燥后的羧基磁珠进行洗脱，得到洗脱后上清液；

(7)二次洗脱：向步骤(6)中洗脱后的上清液中加入0.5倍体积的羧基磁珠，充分重悬，随后在磁性分离器上静置澄清，获得的上清液中包含cfDNA。

2.如权利要求1所述的从卵泡液中提取cfDNA的方法，其中，步骤(2)中上清:蛋白酶K:裂解液的体积比为10:1:8。

3.如权利要求1所述的从卵泡液中提取cfDNA的方法，其中，所述裂解液包括100mMTris-HCl、20-30mM EDTA、500mM NaCl和1％SDS，同时每毫升加入6μg Carrier RNA，所述盐洗涤液包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-5M盐酸胍、10-30mM EDTA-2Na和0.1-1％HCl，所述醇洗涤液包括75～80％vol的乙醇，所述洗脱液包括100ul的10mM Tris-HCl，pH＝8.0。

4.一种从卵泡液中提取cfDNA的试剂盒，其特征在于，包括蛋白酶K、裂解液、CarrierRNA、羧基磁珠、盐洗涤液、醇洗涤液和洗脱液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述蛋白酶K、裂解液、盐洗涤液、醇洗涤液和洗脱液的体积比范围是50～100:30～80:20～200:2～30:5～10。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述裂解液包括100mM Tris-HCl、20-30mM EDTA、500mM NaCl和1％SDS，同时每毫升加入6μg Carrier RNA，所述盐洗涤液包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-5M盐酸胍、10-30mM EDTA-2Na和0.1-1％HCl，所述醇洗涤液包括75～80v％vol的乙醇，所述洗脱液包括100ul的10mM Tris-HCl，pH＝8.0。

7.从卵泡液中提取得到的cfDNA构建得到的cfDNA文库。

8.权利要求7所述的cfDNA文库在基因测序中的应用。

9.一种从卵泡液中提取得到的cfDNA构建得到的cfDNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用如权利要求1所述的从卵泡液中提取cfDNA的方法得到100～300bp的cfDNA；

(2)对100～300bp的cfDNA依次进行末端修复、3'末端加上碱基A、两端加上接头和胶回收纯化，得到cfDNA文库。

10.一种cfDNA文库构建试剂盒及其在基因测序中的应用，该试剂盒中包含了如权利要求4所述的提取cfDNA的试剂盒。