CN110144313B - 一种产酸克雷伯氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种产酸克雷伯氏菌及其应用。本发明所述产酸克雷伯氏菌保藏编号为CGMCC No.17360。本发明提供了一种同时具有解磷、解钾、耐盐等效果的产酸克雷伯氏菌，该菌株可将难溶性的磷、钾元素转化为植物可直接利用形态的速效磷、速效钾元素，同时具有固氮、抗病效果，在减少肥料施用量的同时，提高作物产量；所述产酸克雷伯氏菌可以应用于高效微生物菌剂的制备中，具有生产成本低，操作简单，对土壤无二次污染，改良土壤团粒结构的优点，其既可在普通土壤中定植，亦可适应盐碱地环境。

Description

一种产酸克雷伯氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种产酸克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

氮、磷、钾作为农作物生长发育所必须的三大营养元素，在植物的生长发育过程中发挥着极其重要的作用。在我国的土壤中，含有丰富的磷、钾元素，但绝大多数的磷、钾元素都是以难溶性盐的形式存在，其中90％以上不能被植物直接吸收利用。如何提高土壤中磷钾含量，成为限制农作物生长的重要因素。为了提高农作物产量，需要每年施用大量的化学肥料或有机肥料，但施入得肥料有70％以上积累在土壤中，肥料利用率极低，并不能有效被农作物吸收利用，当季利用率低于25％，大部分肥料成为无效态(难溶态)在土壤中积累。而且由于化学肥料的大量施用及施肥结构的不合理，导致我国的农业生态环境的污染和破坏以及土壤理化性能下降。

已有大量的研究表明，土壤中存在许多有益微生物，其中部分微生物具有溶磷、解磷、解钾、固氮、耐盐效果，能够将植物难吸收的养分转化为植物可吸收利用的形态，进而在降低化肥使用量的同时提高作用的产量。迄今为止报道的大部分具有解磷、解钾、固氮、耐盐功能的微生物基本只具备其中的一种或两种功能，难以同时解决多种问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具备较高解磷效果的产酸克雷伯氏菌及其相关应用；

本发明的另外一个目的在于提供一种具备较高解钾效果的产酸克雷伯氏菌及其相关应用；

本发明的另外一个目的在于提供一种能够耐盐的产酸克雷伯氏菌；

本发明的另外一个目的在于提供一种能够促进作物生长的产酸克雷伯氏菌及其相关应用；

本发明的另外一个目的在于提供同时具有上述一种或多种能力的产酸克雷伯氏菌及其相关应用；

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种产酸克雷伯氏菌，保藏编号为CGMCC No.17360，已于2019年3月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca。

本发明所述产酸克雷伯氏菌从番茄植株根周和根际土壤中经过多重筛选获得，编号为YJY19-04，其能够在固氮固体培养基中生长，表明该菌具备固氮能力，为作物提供充分的氮素营养。对所述菌株进行16S rDNA测序，其序列如SEQ ID No：1所示；其形态特征为微杆状，近似球形；该菌株在普通营养琼脂上形成圆形凸起的菌落，菌落表面光滑不透明，呈乳白色或灰白色，表面湿润，γ溶血(不溶血)。综合上述各项生理、生化试验结果，在分子水平上鉴定YJY19-04为产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca。

通过解磷试验证明，产酸克雷伯氏菌YJY19-04能够有效提高土壤中速效磷含量，为作物提供磷素营养；与从相同环境中筛选出来的产酸克雷伯氏菌SK1和WB2相比，其溶磷圈直径比能够达到2.0以上，而SK1和WB2无溶磷圈；同时，与现有专利的产酸克雷伯氏菌的速效磷(无机磷)结果相比，是其4倍含量，这表明本发明所述产酸克雷伯氏菌具有较高的解磷能力，不同于一般的产酸克雷伯氏菌；

同时，本发明产酸克雷伯氏菌YJY19-04在解钾试验中，发酵液中有效钾含量为5.1mg/L，空白对照组有效钾含量为0.48mg/L，明显高于对照组，表明所述产酸克雷伯氏菌YJY-04具有高效解钾能力；此外，本发明所述产酸克雷伯氏菌YJY19-04在NaCl含量为1％、3％、10％的平板上生长良好，在20％平板上略有生长，但生长缓慢，说明产酸克雷伯氏菌YJY19-04能够耐受10％的NaCl含量；所述产酸克雷伯氏菌还可以提高番茄植株的株高、茎粗、根长和生物量，表明其能够促进作物的生长。

鉴于上述多种优异的能力，本发明提出了所述产酸克雷伯氏菌在如下任意一个或两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的微生物制剂中的应用：

解磷、解钾、固氮和促进作物生长。

根据本发明所述产酸克雷伯氏菌的应用，本发明还提供了一种微生物菌剂，其包含保藏编号为CGMCC No.17360的产酸克雷伯氏菌。作为优选，所述产酸克雷伯氏菌的有效活菌数为2.0×10⁹～5×10¹⁰cfu/g。在本发明具体实施方式中，所述微生物菌剂是所述产酸克雷伯氏菌经由LB培养基活化并制成种子液，而后经由发酵培养基发酵而成。

同时，本发明还提供了一种微生物菌剂的制备方法，将保藏编号为CGMCCNo.17360的产酸克雷伯氏菌活化后制备成种子液，然后接种至发酵培养基扩大培养至稳定期，分离后获得所述微生物菌剂。

所述发酵培养基可以选择常规的LB培养基，但本发明给出了优化后的发酵培养基，其与常规LB培养基相比，能够有效提高发酵菌数，更能适应车间的大量生产运行，保证后期微生物菌剂中的有效活菌数，组成如下：

豆粕1.5-2.5％，玉米粉0.5-1.5％，麦芽糊精0.5-1.5％，酵母粉0.1-0.5％，尿素0.01-0.08％，蛋白胨0.01-0.1％，无水硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，氯化钠0.02-0.1％，硫酸锰0.01-0.05％，pH6.8-7.2，余量水。

在本发明具体实施方式中，所述制备方法如下：

1)菌种活化：取1～5μL冻存的产酸克雷伯氏菌接种于含有5ml LB液体培养基的试管内，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

2)液体种子制备：将活化的试管菌种转接到200ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

3)发酵：将制备好的液体种子按照5％～15％(V/V)的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，培养温度30℃～35℃，pH：6.8-7.5，发酵罐压：0.05Mpa，初始转速：200rpm，初始通气量10～15L/min，转速最高500rpm，通气量最高30L/min(1：2.6)，控制DO≥20mg/L，发酵周期：10-18h；注：缓效碳氮源多，发酵周期可适当延长；

4)菌粉制备：当发酵培养至稳定期(菌量最高)时停止发酵，按照质量比添加0.1‰聚丙烯酰胺，2～4％的硅藻土、1～2％的玉米淀粉吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌粉，菌粉的含水率控制在20％以下。

在本发明提供的微生物菌剂的基础上，还可以添加任何适宜的成分制备成包含本发明所涉及的各种技术效果在内的生物制剂，所述微生物菌剂可如下任意一个或两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的生物制剂中的应用：

解磷、解钾、固氮和促进作物生长。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种同时具有解磷、解钾、固氮、耐盐及促进作物生长效果的产酸克雷伯氏菌，为植物直接提供可利用形态的磷、钾元素，同时具有固氮、抗病效果，提高作物产量，减少肥料用量；所述产酸克雷伯氏菌可以应用于高效微生物菌剂制备中，具有生产成本低，操作简单，对土壤无二次污染，改良土壤团粒结构的优点，既能在普通土壤中定植，亦可适应盐碱地环境。

生物保藏说明

YJY19-04，分类命名：产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca，于2019年3月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.17360。

附图说明

图1所示为本发明所述产酸克雷伯氏菌与其他产酸克雷伯氏菌的溶磷圈试验结果。

具体实施方式

本发明公开了一种产酸克雷伯氏菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产酸克雷伯氏菌和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产酸克雷伯氏菌和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所提供的产酸克雷伯氏菌可与磷矿粉、钾长石或有机肥混合施用，也可以单独使用，既可以作为底肥、基肥使用，也可以作为追肥使用。与肥料一起施用时，须随拌随用，以免造成肥料融化而影响播肥质量。

本发明所提供的具有解磷、解钾和固氮功能的产酸克雷伯氏菌剂不能与杀菌剂等产品混合使用。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：产酸克雷伯氏菌YJY19-04的解磷功能定性检测

以磷酸钙作为无机磷源，无机磷PVK固体培养基配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母膏0.5g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，0.4％溴酚蓝，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.2。先将融化后的1.5％的素琼脂(已灭菌)倒入已灭菌的平板中，形成一层薄薄的琼脂层，使其恰好覆盖平板底部。待琼脂凝固后每个平板按照等边三角形的三个角放置3个牛津杯，每个平板倒入10ml无机磷PVK培养基，待凝固后用灭菌的镊子将牛津杯取出。每个孔内加入菌液30ul，于30℃培养5-7d。用直尺测量透明圈的直径(D)和菌斑的直径(d)，根据公式(1)计算直径比(M)。公式(1)如下：

其中，M——直径比

D——透明圈直径

d——菌斑直径

结果见图1，本发明产酸克雷伯氏菌YJY19-04的溶磷圈直径比能够达到2.0以上，而从相同环境中筛选出来的产酸克雷伯氏菌SK1和WB2无溶磷圈，只有菌斑圈。表明本发明产酸克雷伯氏菌具有降解无机难溶性磷，转化为植物可吸收利用的速效磷的功效，能够为植物的生长提供营养，对植物的生长有良好的促进作用。

实施例2：产酸克雷伯氏菌YJY19-04在土壤中的定植能力及对土壤中速效磷含量影响

从滨州市博兴县店子镇番茄大棚中取土样，将大块的土壤碾碎，取颗粒度较小的土壤进行实验。将产酸克雷伯氏菌挑取单菌落接于100ml LB液体培养基内，37℃170rpm过夜培养，5500rpm离心后，菌体用蒸馏水重悬后备用。将土壤放于育苗盆中进行实验，每7d取样检测土壤中速效磷含量的变化情况，具体体系配置如下：

1#：空白土壤；

2#：土壤+1ml YJY19-04菌悬液；

3#：土壤+1％磷酸三钙；

4#：土壤+1％磷酸三钙+1ml YJY19-04。

利用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法对土壤中的速效磷进行检测，从检测结果来看，添加菌剂的2#速效磷含量在7d后迅速上升，明显高于1#空白组，4#添加磷酸钙和菌液的土壤中速效磷含量也在7d后明显高于3#只添加磷酸钙的实验组，说明添加产酸克雷伯氏菌能够有效提高土壤中速效磷含量，为作物提供磷素营养。具体见表1。

表1土壤中速效磷含量(g/kg)

实施例3：产酸克雷伯氏菌YJY19-04速效磷(无机磷)检测

将菌落YJY19-04接种至LB液体培养基内，于35℃170rpm培养过夜，调节OD₆₀₀＝1，按照1％接种量接种于无机磷培养基内(无机磷培养基NBRIP(g/L)：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.25g，七水氯化镁5g，蒸馏水1L，pH6.8-7.0,120℃高温灭菌20min)，于30℃200rpm培养72h后，参照农业行业标准NY412-2000对发酵液进行速效磷检测。从检测结果来看，产酸克雷伯氏菌YJY19-04无机磷发酵液中速效磷含量为2.62％，相比现有专利CN102690767A说明书0032段公开的0.656％速效磷含量是其4倍，具有优异的解磷效果，具体结果见表2。

表2速效磷效果(无机磷，NY412-2000标准)

实施例4：产酸克雷伯氏菌YJY19-04解钾能力检测

配制液体解钾培养基(解钾培养基:蔗糖10g，酵母粉0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，(NH₄)SO₄ 1g，Na₂HPO₄ 2g，CaCO₃ 1g，钾长石粉1g，pH 7.0～7.5，蒸馏水1000ml)；将YJY19-04转接入LB液体培养基内，35℃ 170rpm培养，当菌液OD600＝0.5时，吸取种子液接种到解钾培养基中，接种量为2％，设置空白对照组，置于30℃，160r/min培养7d，设置三个重复，第7d检测发酵液中钾离子含量。将发酵培养液置于离心管中，13000r/min离心10min取上清液，采用火焰光度法测定上清液中钾离子含量。

通过检测，发酵液中有效钾含量为5.1mg/L，空白对照组有效钾含量为0.48mg/L，明显高于对照组。说明产酸克雷伯氏菌YJY-04具有高效解钾能力，能够将不溶性钾分解为可溶性钾，供植物吸收利用，减少钾肥的施用量。

实施例5：产酸克雷伯氏菌YJY19-04耐盐能力检测

配置LB固体培养基，添加不同含量的NaCl(1％、3％、10％、20％)，于121℃20min灭菌，待培养基温度降至40℃左右时，倒置固体平板，将YJY19-04在含有不同NaCl含量的平板上进行划线，于35℃恒温培养36h，发现YJY19-04在NaCl含量为1％、3％、10％的平板上生长良好，在20％平板上略有生长，但生长缓慢，说明产酸克雷伯氏菌YJY19-04能够耐受10％的NaCl含量。

实施例6：产酸克雷伯氏菌YJY19-04促进作物生长能力检测

从滨州市博兴县店子镇番茄大棚中取土样，将大块的土壤碾碎，取颗粒度较小的土壤进行实验。将取来的土壤称取相同质量装入花盆内备用。将购买的番茄苗按照每盆5棵进行移栽，移栽后每盆浇水500ml，使盆内土壤湿润。第二天，将活化后的YJY19-04菌液于5500rpm 4℃离心15min，去掉上清液，用蒸馏水重悬，添加时取10ml悬浮液稀释至400ml，浇灌至每盆番茄内。

设置空白实验组1#(不添加菌悬液)，实验组2#(添加菌悬液)。定期浇水，30d后对番茄的株高、茎粗、根长、地上生物量、地下生物量等指标进行测量。从检测结果来看，实验组的株高、茎粗、根长和生物量都明显高于空白组，说明添加产酸克雷伯氏菌YJY19-04能够有效促进植株的生长和植株的抗逆性。

表3番茄生物指标检测结果

实施例7：制备本发明所述微生物菌剂

1)菌种活化：取5μL冻存的产酸克雷伯氏菌接种于含有5ml LB液体培养基的试管内，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

2)液体种子制备：将活化的试管菌种转接到200ml LB液体培养基中，于30～35℃，150～180rpm培养16h-24h；

3)发酵：将制备好的液体种子按照5％～15％(V/V)的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，培养温度30℃～35℃，pH：6.8-7.5，发酵罐压：0.05Mpa，初始转速：200rpm，初始通气量10～15L/min，转速最高500rpm，通气量最高30L/min(1：2.6)，控制DO≥20mg/L，发酵周期：10-18h；注：缓效碳氮源多，发酵周期可适当延长。

所用的发酵培养基为：豆粕2.0％，玉米粉1.0％，麦芽糊精1.0％，酵母粉0.3％，尿素0.05％，蛋白胨0.05％，无水硫酸镁0.025％，磷酸二氢钾0.02％，氯化钠0.08％，硫酸锰0.03％，pH7.0-7.2。

4)菌粉制备：当发酵培养至稳定期(菌量最高)时停止发酵，按照质量比添加0.1‰聚丙烯酰胺，2～4％的硅藻土、1～2％的玉米淀粉吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌粉，菌粉的含水率控制在20％以下；经过5次以上制备，检测有效活菌数介于1.0×10¹⁰～5×10¹⁰cfu/g。

将步骤3)中的发酵培养基更换为LB培养基，其他步骤保持一致，经过5次以上制备，检测有效活菌数介于1.0×10⁹～5×10⁹cfu/g。由此表明，经过本发明优化后的发酵培养基可以明显增加有效活菌数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120> 一种产酸克雷伯氏菌及其应用

<130> MP1905861

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)

<400> 1

ggtagcgccc tcccgaaggt taagctacct acttcttttg caacccactc ccatggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgta gcattctgat ctacgattac 120

tagcgattcc gacttcatgg agtcgagttg cagactccaa tccggactac gacatacttt 180

atgaggtccg cttgctctcg cgaggtcgct tctctttgta tatgccattg tagcacgtgt 240

gtagccctgg tcgtaagggc catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc tccagtttat 300

cactggcagt ctcctttgag ttcccggcct gaccgctggc aacaaaggat aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatttcac aacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtctcacag ttcccgaagg caccaatcca tctctggaaa gttctgtgga tgtcaagacc 480

aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc gatttaacgc 600

gttagctccg gaagccacgc ctcaagggca caacctccaa atcgacatcg tttacggcgt 660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctga gcgtcagtct 720

ttgtccaggg ggccgccttc gccaccggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct 780

acacctggaa ttctaccccc ctctacaaga ctctagcctg ccagtttcga atgcagttcc 840

caggttgagc ccggggattt cacatccgac ttgacagacc gcctgcgtgc gctttacgcc 900

cagtaattcc gattaacgct tgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag 960

ccggtgcttc ttctgcgggt aacgtcaatc gccaaggtta ttaaccttaa cgccttcctc 1020

cccgctgaaa gtgctttaca acccgaaggc cttcttcaca cacgcggcat ggctgcatca 1080

ggcttgcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tggaccgtgt 1140

ctcagttcca gtgtggctgg tcatcctctc agaccagcta gggatcgtcg cctaggtgag 1200

ccattacccc acctactagc taatcccatc tgggcacatc tgatggcatg aggcccgaag 1260

gtcccccact ttggtcttgc gacattatgc ggtattagct accgtttcca gtagttatcc 1320

ccctccatca ggcagtttcc cagacattac tcacccgtcc gccgctcgtc acccgagagc 1380

aagctctctg tgctaccgct cgactgca 1408

Claims (7)

1.一种产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.17360。

2.保藏编号为CGMCC No.17360的产酸克雷伯氏菌在如下任意一个或两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的微生物制剂中的应用：

解磷、解钾、固氮和促进作物生长。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCC No.17360的产酸克雷伯氏菌。

4.根据权利要求3所述微生物菌剂，其特征在于，所述产酸克雷伯氏菌的有效活菌数为2.0×10⁹～5×10¹⁰cfu/g。

5.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.17360的产酸克雷伯氏菌活化后制备成种子液，然后接种至发酵培养基扩大培养至稳定期，分离后获得所述微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：

豆粕1.5-2.5％，玉米粉0.5-1.5％，麦芽糊精0.5-1.5％，酵母粉0.1-0.5％，尿素0.01-0.08％，蛋白胨0.01-0.1％，无水硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，氯化钠0.02-0.1％，硫酸锰0.01-0.05％，pH6.8-7.2，余量水。

7.权利要求3或4所述微生物菌剂或由权利要求5或6所述制备方法制备的微生物菌剂在如下任意一个或两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的生物制剂中的应用：

解磷、解钾、固氮和促进作物生长。

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