CN110133268A - 针对ap25的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

针对ap25的elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种针对AP25的ELISA试剂盒及其应用，属于生物医药领域。该试剂盒包括AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液；利用该试剂盒能快速检测被测样品中的AP25浓度，准确性好、特异性强，操作简单。

Description

针对AP25的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种针对AP25的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
AP25是一种整合素阻断剂，能够显著抑制内皮细胞增殖和迁移，抑制管状结构形成，具有显著的抑制血管生成和抗肿瘤活性。AP25多肽是一组新的氨基酸序列，是一种小分子药物，分子量为1500～3000道尔顿，性状为白色或类白色的块状物或无定形粉末，具备抗肿瘤活性。
AP25的抗肿瘤研究过程中，需进行动物试验，动物给服AP25后，AP25的分布及血浆浓度的测定直接反应的是代谢动力学，为给药方式提供指导。因此，AP25在动物，包括人体中的分布测定方法会影响临床给药方式，建立一种简单、高效的AP25测定方法显得尤为重要。
ELISA-酶联免疫吸附法利用抗原与抗体的特异性反应，以定量测定抗原或者抗体的含量，ELISA的应用非常广，但专门针对AP25的ELISA试剂盒尚未见报道。
发明内容
本申请的目的在于提供一种针对AP25的ELISA试剂盒，该试剂盒包括AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，利用该试剂盒能快速检测被测样品中的AP25浓度，准确性好、特异性强，操作简单。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一方面，本申请提供了一种针对AP25的ELISA试剂盒，包括：AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，所述偶联抗原的制备方法为：先将AP25与BSA溶液混合，加入戊二醛，涡旋混合反应后加入甘氨酸和非离子型表面活性剂，再次涡旋混合反应，即得到偶联抗原。
优选地，所述偶联抗原的制备方法为：
将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液混匀，得到反应体系；所述BSA溶液是指以PBS缓冲液为溶剂制备的BSA溶液；
取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取150ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸溶液以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。
优选地，所述封闭液的制备方法为：称取8g脱脂奶粉和2g蔗糖，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。
优选地，所述PBS缓冲液的制备方法为：称取8.5g NaCl、0.2g KCl、2.85gNa2HPO4·12H2O和0.27g KH2PO4，加入100ml去离子水，调节pH至7.2，即得。
优选地，所述包被液的制备方法为：称取Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。
优选地，所述酶标二抗是指HRP标记的山羊抗小鼠IgG，所述显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液。
优选地，所述洗液的制备方法为：将0.5mL TWEEN-20加入1L的PBS缓冲液中，混匀，即得。
优选地，所述非离子型表面活性剂选自辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或几种。
另一方面，本申请提供了前述试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
S1.将偶联抗原用包被液稀释，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；
S2.去除包被液，洗板，拍干；
S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板，拍干；
S4.向酶标板中添加AP25标准品或试样，再加入AP25单克隆抗体，于摇床震荡混匀2-5min，再移至37℃水浴放置2-3h，重复洗板，拍干；
S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干；
S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应20-30min，每孔加入50μL终止液，终止反应；
S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。
优选的，所述应用还至少包括以下技术特征之一：
步骤S1中偶联抗原用包被液稀释是指按照体积比1:200-250将偶联抗原与包被液混合；
步骤S4中，加入AP25单克隆抗体前，先用PBS缓冲液稀释，AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000；
所述洗板的方法为：每孔加入400μL洗液，重复洗涤3次；
所述终止液为浓度3M的硫酸。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
1.采用改进型的戊二醛法制备偶联抗原，在反应过程中添加甘氨酸进行封闭，同时添加非离子型表面活性剂促进偶联反应，有效减少自身偶联，提高了AP25-BSA偶联抗原的收率，进而提高了ELISA测定结果的准确性。
2.ELISA试剂盒中的封闭液采用脱脂奶粉和蔗糖的PBS溶液，封闭效果好，加入AP25后，游离AP25与固定的偶联抗原竞争性地与AP25单克隆抗体结合，实现竞争性的ELISA测定，能有效提高检测的准确性和灵敏度。
3.本申请优化了PBS缓冲液、包被液的配方组成，提高了偶联抗原在酶标板上的固相结合率，提高ELISA测定的特异性与灵敏度。
4.本申请建立了一套完整的针对AP25的ELISA测定方法，检测限低、灵敏度高，特异性强。
采用本申请提供的试剂盒能简单快速的检测试样中的AP25浓度，操作简单，涉及的试剂常规，成本低。
具体实施方式
本申请中涉及的试剂和设备均为商购，其中，
AP25标准品，购自天根生化科技有限公司；
AP25单克隆抗体，购自天根生化科技有限公司；
戊二醛，购自国药集团化学试剂有限公司；
脱脂奶粉，购自黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司；
酶标板，购自山东博科生物产业有限公司；
涡旋混匀器VORTEX3，购自上海达姆实业有限公司；
酶标分析仪，购自Thermo公司。
为进一步说明本申请，以下通过具体的实施例进行阐述，但实施例仅作为本申请实施方式的例举，本发明并不局限于此。
实施例1
一种针对AP25的ELISA试剂盒，该试剂盒中包括：AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液。其中，
偶联抗原的制备方法为：将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液(每1mL PBS缓冲液中含有2.5mg蛋白BSA)混匀，得到反应体系。
取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取150ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸溶液(以去离子水配制)以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。非离子型表面活性剂为辛基酚聚氧乙烯醚。
PBS缓冲液的制备方法为：称取8.5g NaCl、0.2g KCl、2.85gNa2HPO4·12H2O和0.27g KH2PO4，加入100ml去离子水，调节pH至7.2。
包被液的制备方法为：称取Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。
封闭液的制备方法为：称取8g脱脂奶粉和2g蔗糖，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。
洗液的制备方法为：将0.5mL TWEEN-20加入1L的PBS缓冲液中，混匀，即得。
酶标二抗是指HRP标记的山羊抗小鼠IgG。
显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液。
终止液为浓度3M的硫酸。
实施例2
采用实施例1提供的试剂盒测定AP25浓度，建立标准曲线。
先将AP25标准品用PBS缓冲液稀释成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1ng/mL系列浓度，备用。测定步骤如下：
S1.采用包被液将偶联抗原稀释，偶联抗原与包被液的稀释体积比为1:200；将稀释后的偶联抗原加入96孔的酶标板中，每孔100μl，4℃过夜。
S2.去除包被液，每孔加入400μL洗液洗板，重复洗涤3次，拍干。
S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板3次，拍干。
S4.向酶标板中添加50μl不同浓度AP25标准品，每个浓度的AP25标准品设置4个复孔，同时设置一组空白对照，即加入相同体积的PBS缓冲液；再加入50μl稀释后的AP25单克隆抗体(AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000)，于摇床震荡混匀5min，再移至37℃水浴放置2h，重复洗板3次，拍干。
S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干。
S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min，每孔加入50μL终止液，终止反应。
S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。
以标准品浓度lgC为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归系数R2，回归方程为y＝0.3628x-0.3917，R2为0.993，说明本次测定有效，且AP25浓度在1ng/ml至640ng/ml的范围内线性好，检测范围广，检测限低。
计算AP25标准品与空白对照组的OD值比值，1ng/ml的AP25与空白对照组(PBS缓冲液)的OD450吸光度值比值为5，说明该试剂盒在1ng/ml的浓度下能灵敏的检测AP25，检测限低，灵敏度强。
实施例3
采用实施例1提供的试剂盒测定AP25浓度，确定采用该试剂盒检测AP25的回收率。
试样为大鼠的血浆，用血浆与PBS混合溶液(体积比为1:4)稀释AP25标准品，得到AP25浓度分别为1000、200和50ng/ml的试样，编号分别为1、2和3。将试样置于80℃水浴20min，在12000r/min离心2min，取上清液测定，每个浓度重复三次，测得值与理论值之间的百分比即为回收率。测定方法如下：
S1.采用包被液将偶联抗原稀释，偶联抗原与包被液的稀释体积比为1:200；将稀释后的偶联抗原加入96孔的酶标板中，每孔100μl，4℃过夜。
S2.去除包被液，每孔加入400μL洗液洗板，重复洗涤3次，拍干。
S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板3次，拍干。
S4.向酶标板中添加50μl试样1-3，每个试样设置4个复孔，同时设置一组空白对照，即加入相同体积的PBS缓冲液；再加入50μl稀释后的AP25单克隆抗体(AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000)，于摇床震荡混匀5min，再移至37℃水浴放置2h，重复洗板3次，拍干。
S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干。
S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min，每孔加入50μL终止液，终止反应。
S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。
根据实施例2得到的回归方程，将OD值代入，计算得到浓度数值，结果见表1。
表1.回收率
试样编号 理论值(ng/ml) 测定值(ng/ml) 回收率(％)
1 1000 986.32 98.63
2 200 197.82 98.91
3 50 49.68 99.36
由表1可见，采用本申请提供的试剂盒及实施例2建立的测定方法，能够准确地测定AP25浓度，回收率高，准确性好。
实施例4
将实施例1中的试剂盒置于室温、4℃保存1h、2h、4h和10h，然后再用于实施例3所述的试样1的回收率测定，结果见表2。
表2
室温 1h 2h 4h 10h
回收率(％) 97.32 97.03 96.44 96.17
4℃ 1h 2h 4h 10h
回收率(％) 98.01 98.03 97.69 97.58
由表2的数据可见，本申请提供的试剂盒在室温下保存10h后，依旧能准确的测定试样中的AP25浓度，产品稳定性好，易于保存和运输。
实施例5
采用实施例1提供的试剂盒测定AP25浓度，确定采用该试剂盒检测AP25的回收率。
试样为小鼠的血浆，用血浆与PBS混合溶液(体积比为1:4)稀释AP25标准品，得到AP25浓度分别为1000、200和50ng/ml的试样，编号分别为1、2和3。将试样置于80℃水浴20min，在12000r/min离心2min，取上清液测定，每个浓度重复三次，测得值与理论值之间的百分比即为回收率。测定方法如下：
S1.采用包被液将偶联抗原稀释，偶联抗原与包被液的稀释体积比为1:250；将稀释后的偶联抗原加入96孔的酶标板中，每孔100μl，4℃过夜。
S2.去除包被液，每孔加入400μL洗液洗板，重复洗涤3次，拍干。
S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板3次，拍干。
S4.向酶标板中添加50μl试样1-3，每个试样设置4个复孔，同时设置一组空白对照，即加入相同体积的PBS缓冲液；再加入50μl稀释后的AP25单克隆抗体(AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000)，于摇床震荡混匀2min，再移至37℃水浴放置3h，重复洗板3次，拍干。
S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干。
S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应30min，每孔加入50μL终止液，终止反应。
S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。
根据实施例2得到的回归方程，将OD值代入，计算得到浓度数值，结果见表3。
表3.
试样编号 理论值(ng/ml) 测定值(ng/ml) 回收率(％)
1 1000 987.11 98.71
2 200 197.76 98.88
3 50 49.64 99.28
对比例1
本对比例提供了一种试剂盒，其与实施例1的区别在于，偶联抗原的制备过程中，没有添加非离子型表面活性剂。
利用该试剂盒，重复实施例2的方法建立标准曲线，得到的回归方程为：y＝0.1352x-0.7634，R2为0.825，说明该试剂盒测定浓度在1ng/ml至640ng/ml的AP25，线性一般，测定范围小。因此，偶联抗原的制备方法会影响试剂盒检测的灵敏性和特异性。
对比例2
本对比例提供了一种试剂盒，其与实施例1的区别在于，封闭液的制备方法为：称取10g脱脂奶粉，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。
对比例3
本对比例提供了一种试剂盒，其与实施例1的区别在于，偶联抗原的制备方法为：将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与1.0ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液(每1mL PBS缓冲液中含有2.5mg蛋白BSA)混匀，得到反应体系。其余同实施例1。
对比例4
本对比例提供了一种试剂盒，其与实施例1的区别在于，偶联抗原的制备方法为：将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液(每1mL PBS缓冲液中含有2.5mg蛋白BSA)混匀，得到反应体系。取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取120ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。
分别利用对比例2-4的试剂盒重复实施例2中的方法，测定试样1中AP25浓度，计算回收率，结果见表4。
表4.
由表4可见，试剂盒中的封闭液组成、偶联抗原的制备方法均会影响试剂盒检测结果的准确性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，所述偶联抗原的制备方法为：先将AP25与BSA溶液混合，加入戊二醛，涡旋混合反应后加入甘氨酸和非离子型表面活性剂，再次涡旋混合反应，即得到偶联抗原。
2.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述偶联抗原的制备方法为：
将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液混匀，得到反应体系；所述BSA溶液是指以PBS缓冲液为溶剂制备的BSA溶液；
取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取150ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸溶液以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。
3.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液的制备方法为：称取8g脱脂奶粉和2g蔗糖，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。
4.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液的制备方法为：称取8.5g NaCl、0.2g KCl、2.85gNa2HPO4·12H2O和0.27g KH2PO4，加入100ml去离子水，调节pH至7.2，即得。
5.如权利要求2所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液的制备方法为：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。
6.如权利要求5所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是指HRP标记的山羊抗小鼠IgG，所述显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液。
7.如权利要求6所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗液的制备方法为：将0.5mL TWEEN-20加入1L的PBS缓冲液中，混匀，即得。
8.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或几种。
9.权利要求1-8任一项所述的针对AP25的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将偶联抗原用包被液稀释，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；
S2.去除包被液，洗板，拍干；
S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板，拍干；
S4.向酶标板中添加AP25标准品或试样，再加入AP25单克隆抗体，于摇床震荡混匀2-5min，再移至37℃水浴放置2-3h，重复洗板，拍干；
S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干；
S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应20-30min，每孔加入50μL终止液，终止反应；
S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。
10.如权利要求9所述的针对AP25的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，还至少包括以下技术特征之一：
步骤S1中偶联抗原用包被液稀释是指按照体积比1:200-250将偶联抗原与包被液混合；
步骤S4中，加入AP25单克隆抗体前，先用PBS缓冲液稀释，AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000；
所述洗板的方法为：每孔加入400μL洗液，重复洗涤3次；
所述终止液为浓度3M的硫酸。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4347311A (en) * 1979-07-28 1982-08-31 MEDAC Gesellschaft fur Klinishce Spezialpraparate mbH Enzyme immunoassay for determining antigen specific antibodies and test kit for carrying out this assay
US20060263833A1 (en) * 2005-02-18 2006-11-23 Hematologics, Inc. System, method, and article for detecting abnormal cells using multi-dimensional analysis
CN101236200A (zh) * 2008-02-06 2008-08-06 中国计量学院 氯丙嗪的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN101407580A (zh) * 2008-11-28 2009-04-15 吉林大学 一种合成三聚氰胺完全抗原的方法及检测三聚氰胺的elisa试剂盒
CN101571540A (zh) * 2009-06-01 2009-11-04 北京望尔康泰生物技术有限公司 检测猪免疫球蛋白g的酶联免疫试剂盒及其应用
CN101928346A (zh) * 2009-07-31 2010-12-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备
CN103439503A (zh) * 2013-08-03 2013-12-11 河南省农业科学院 司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法
US20140072592A1 (en) * 2011-01-07 2014-03-13 Seiko Epson Corporation Method of preparing antigen for acquiring anti-hydrophobic peptide antibody

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4347311A (en) * 1979-07-28 1982-08-31 MEDAC Gesellschaft fur Klinishce Spezialpraparate mbH Enzyme immunoassay for determining antigen specific antibodies and test kit for carrying out this assay
US20060263833A1 (en) * 2005-02-18 2006-11-23 Hematologics, Inc. System, method, and article for detecting abnormal cells using multi-dimensional analysis
CN101236200A (zh) * 2008-02-06 2008-08-06 中国计量学院 氯丙嗪的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN101407580A (zh) * 2008-11-28 2009-04-15 吉林大学 一种合成三聚氰胺完全抗原的方法及检测三聚氰胺的elisa试剂盒
CN101571540A (zh) * 2009-06-01 2009-11-04 北京望尔康泰生物技术有限公司 检测猪免疫球蛋白g的酶联免疫试剂盒及其应用
CN101928346A (zh) * 2009-07-31 2010-12-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备
US20140072592A1 (en) * 2011-01-07 2014-03-13 Seiko Epson Corporation Method of preparing antigen for acquiring anti-hydrophobic peptide antibody
CN103439503A (zh) * 2013-08-03 2013-12-11 河南省农业科学院 司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YONGBING LI等: "Quantitative Analysis and Pharmacokinetics Study of integrin Antagonist AP25 in Rat Plasma", 《PROTEIN & PEPTIDE LETTERS》 *

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