CN110129248B - 用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，所述工程菌中含有表达载体merR mer‑phzM‑mer‑phzS‑pAK1900，其中，merR mer‑phzM‑mer‑phzS为重组基因，pAK1900为质粒骨架。本发明还提供了一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法及其用途。本发明的生物工程菌用于检测二价汞离子具有灵敏度高、选择性好、成本低廉以及应用范围广等特点。

Description

用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及水污染检测领域。更具体地说，本发明涉及用于检测二价汞离子的生物工程菌及其用途。
背景技术
汞是环境中毒性最强的重金属元素之一，一旦进入水体中，容易转化为毒性更大的甲基汞，甲基汞进入人体后易被吸收，不易降解，特别是容易在脑中积累，侵犯中枢神经从而引发汞中毒。汞的熔点极低，以至于在0℃时就能挥发为汞蒸气并可随大气循环造成长距离的跨界污染，而且能够通过食物链高度富集，这对生活在食物链顶端的人类健康造成严重的威胁。
随着工业化程度的不断提高，以汞为原料的工业生产中产生含汞废水的排放对环境的污染十分严重，甚至危及人们的生命安全。因此，建立高效且快速的检测水体中重金属汞离子的方法是十分有必要的。较早的检测汞离子的方法有化学试剂法，如双硫腙法等，但其选择性差、灵敏度低再加上其属有机试剂，容易对环境造成二次污染。为了寻找更高效灵敏的检测汞离子的方法，科学研究工作者们也在不断的改进汞离子检测的技术及方法设备。拥有灵敏性极好的检测方法有原子发射光谱法(Atomic Emission pectrometry，AES)、原子吸收光谱法(Atmotic Absorption Spectrometry，AAS)和电感耦合等离子体质谱法(Iductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS)等[3-6]。但这些仪器分析法存在着仪器昂贵、操作复杂、无法对汞离子进行原位检测等局限性。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，其能够通过细胞内的MerR蛋白特异性的与二价汞离子结合，金属调控蛋白MerR的构型发生变化进而导致与之结合的启动子DNA发生扭曲，从而激活下游phzM及phzS基因的转录，产生大量绿脓菌素(PYO)，并且其强度随金属离子Hg2+浓度的变化而变化，从而实现水污染体系中痕量Hg2+的可视化检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，所述工程菌中含有表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，其中，merRmer-phzM-mer-phzS为重组基因，pAK1900为质粒骨架。
本发明还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其包括以下步骤：
1)利用PCR技术分别扩增基因片段merR mer、phzM和phzS，将扩增后的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术拼接，并将纯化后的拼接产物通过PCR技术扩增，得到基因片段merR mer-phzM；
2)使用限制性内切酶HindIII和BamHI对载体质粒pAK1900和基因片段merR mer-phzM进行双酶切，使基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900同时露出相同的粘性末端，通过T4DNA连接酶将基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900连接，构建质粒merRmer-phzM-pAK1900；
3)利用PCR技术扩增质粒merR mer-phzM-pAK1900中的基因片段mer，将扩增的基因片段mer和基因片段phzS通过重叠PCR技术实现连接，获得基因片段mer-phzS；
4)使用限制性内切酶BamHI对质粒merR mer-phzM-pAK1900和基因片段mer-phzS进行单酶切，再用T4DNA连接酶将质粒merR mer-phzM-pAK1900与基因片段mer-phzS连接，构建表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900；
5)将表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900转化至感受态细胞，扩增并提取表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，转化至绿脓杆菌，获得所述生物工程菌。
优选的是，步骤5)中，所述感受态细胞为E.coli DH5α。
优选的是，所述基因片段merR mer-phzM的构建方法为：分别以全基因合成的基因片段merR mer和基因片段phzM为模板，进行第一次PCR扩增反应以分别扩增基因片段merRmer和基因片段phzM，将扩增的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术连接，获得连接片段merR mer-phzM，以连接片段merR mer-phzM为模板，通过PCR扩增技术，获得基因片段merR mer-phzM。
优选的是，第一次PCR扩增反应包含35个循环，其中，一次循环依次包括98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10-90s，引物为primer I和primer II。
优选的是，基因片段mer-phzS的构建方法为：以质粒merR
mer-phzM-pAK1900为模板进行第二次PCR扩增反应以扩增基因片段mer；以全基因合成的基因片段phzS为模板进行第三次PCR扩增反应以扩增基因片段phzS。
优选的是，第二次PCR扩增反应包含30个循环，其中，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，引物为primer V和primer VI；第三次PCR扩增反应包含30个循环，其中，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，引物为primer VII和primer VIII。
本发明还提供一种所述生物工程菌的用途，所述生物工程菌用于检测水环境中是否含有二价汞离子。
本发明至少包括以下有益效果：利用金属调控蛋白MerR特异性识别Hg2+的能力以及其转录激活机制调控绿脓杆菌中绿脓菌素合成基因phzM和phzS的转录，当进入细胞内部的Hg2+与MerR蛋白结合后，将激活与绿脓菌素合成相关基因phzM和phzS的大量表达，使绿脓杆菌产生大量的绿脓菌素，从而达到Hg2+的可视化检测。本发明的生物工程菌对水环境中的目标金属离子Hg2+具有高灵敏特性以及高选择性的识别特性，表现为对10nM金属离子Hg2+已经有明显的响应，并且在25-1000nM浓度范围内呈现良好的线性关系，而对于其它金属离子Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+等均没有响应，且对Hg2+特异性响应的信号不受其他金属离子的干扰。此外，本发明的生物工程菌具有较宽广的适应范围，在pH＝4-10范围内对Hg2+均有良好的响应，适用于实际样品的分析。本发明的生物工程菌具有灵敏度高、选择性好、成本低廉以及应用范围广等特点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的质粒pAK1900的图谱；
图2说明的是本发明的表达载体的构建流程图；
图3为本发明基因片段merR mer、phzM、mer、phzS的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明基因片段merR mer-phzM、mer-phzS的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图；
图5为本发明生物工程菌识别二价汞的灵敏度测试图；
图6为本发明生物工程菌与二价汞离子浓度关系变化图；
图7为本发明生物工程菌识别二价汞离子特异性性能研究结果图；
图8为本发明生物工程菌识别二价汞离子的抗干扰性能研究结果图；
图9为本发明生物工程菌在不同pH环境中对二价汞离子的识别研究结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，所述工程菌中含有表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，其中，merR mer-phzM-mer-phzS为重组基因，pAK1900为质粒骨架，质粒pAK1900的图谱如图1所示。
基因片段merR mer的基因序列如SEQ ID NO.1所示，基因片段phzM的基因序列如SEQ ID NO.2所示，基因片段phzS的基因序列如SEQ ID NO.3所示，基因片段merR mer-phzM的基因序列如SEQ ID NO.4所示；基因片段mer的基因序列如SEQ ID NO.5所示，基因片段mer-phzS的基因序列如SEQ ID NO.6所示；primer I序列如SEQ ID NO.7所示，primer II序列如SEQ ID NO.8所示，primer III序列如SEQ ID NO.9所示，primer IV序列如SEQ IDNO.10所示，primer V序列如SEQ ID NO.11所示，primer VI序列如SEQ ID NO.12所示，primer VII序列如SEQ ID NO.13所示，primer VIII序列如SEQ ID NO.14所示；基因片段merR mer-phzM-mer-phzS的序列如SEQ ID NO.15所示。
如图2所示，本发明还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其包括以下步骤：
1)利用PCR技术分别扩增基因片段merR mer、phzM和phzS，将扩增后的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术拼接，并将纯化后的拼接产物通过PCR技术扩增，得到基因片段merR mer-phzM；
所述基因片段merR mer-phzM的构建方法为：分别以全基因合成的基因片段merRmer和基因片段phzM为模板，进行PCR扩增反应以分别扩增基因片段merR mer和基因片段phzM，将扩增的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术连接，获得连接片段merR mer-phzM，以纯化后的连接片段merR mer-phzM为模板，进行PCR扩增反应，获得基因片段merR mer-phzM；
扩增基因片段merR mer、phzM和phzS的PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示；基因片段merR mer和phzM重叠连接的反应体系如表3所示，反应程序如表4和表5所示。
2)使用限制性内切酶HindIII和BamHI对载体质粒pAK1900和基因片段merR mer-phzM进行双酶切，酶切体系如表6所示，使基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900同时露出相同的粘性末端，通过T4DNA连接酶将基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900连接，构建质粒merR mer-phzM-pAK1900，其连接体系如表7所示；
3)利用PCR技术扩增质粒merR mer-phzM-pAK1900中的基因片段mer，将扩增的基因片段mer和基因片段phzS通过重叠PCR技术实现连接，获得基因片段mer-phzS；其中，基因片段mer-phzS的构建方法为：以质粒merR mer-phzM-pAK1900为模板进行PCR扩增反应以扩增基因片段mer；以全基因合成的基因片段phzS为模板进行PCR扩增反应以扩增基因片段phzS；
扩增基因片段mer的反应体系如表1所示，反应程序如表2所示；
扩增基因片段mer-phzS的反应体系如表3所示，反应程序如表4和表5所示；
4)使用限制性内切酶BamHI对质粒merR mer-phzM-pAK1900和基因片段mer-phzS进行单酶切，再用T4DNA连接酶将质粒merR mer-phzM-pAK1900与基因片段mer-phzS连接，构建表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900；
5)将表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900转化至感受态细胞E.coli DH5α，扩增并提取表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，转化至绿脓杆菌，获得所述生物工程菌。
扩增基因片段merR mer的引物为primer I和primer II，扩增基因片段phzM的引物为primer III和primer IV，扩增基因片段phzS的扩增引物为primer VII和primerVIII；基因片段mer的扩增引物为primer V和primer VI；基因片段merR mer-phzM的扩增引物为primer I和primer IV；基因片段mer-phzS的扩增引物为primer V和primer VIII。
表1扩增基因片段merR mer/phzM/phzS反应体系
Figure BDA0002071613410000061
表2扩增基因片段merR mer/phzM/phzS反应程序
Figure BDA0002071613410000062
Figure BDA0002071613410000071
将PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定，并将目的条带通过使用切胶回收试剂盒进行回收。基因片段merR mer、phzM、mer、phzS通过PCR程序扩增后使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示泳道1、2、3、4在500bp附近、1000bp附近、1000bp附近、1000bp-1500bp之间均有明显的单条带，与merR mer(506bp)、phzM(1008bp)、mer(71bp)、phzS(1209bp)基因片段的大小完全相符，如图3所示，表明PCR扩增结果正确。
表3扩增基因片段merR mer-phzM/mer-phzS的反应体系
Figure BDA0002071613410000072
表4未加引物时扩增基因片段merR mer-phzM/mer-phzS的反应程序
Figure BDA0002071613410000073
Figure BDA0002071613410000081
表5添加引物后扩增基因片段merR mer-phzM/mer-phzS的反应程序
Figure BDA0002071613410000082
将PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定，并将目的条带通过使用切胶回收试剂盒进行回收。基因片段merR mer-phzM、mer-phzS通过PCR程序扩增后使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示泳道1、2在1500bp附近、1000bp-1500bp之间均有明显的单条带，与merR mer-phzM(1514bp)、mer-phzS(1280bp)基因片段的大小完全相符，结果如图4所示，表明PCR扩增结果基本正确。
表6基因merR mer-phzM及质粒pAK1900的双酶切反应体系
Figure BDA0002071613410000083
使用限制性内切酶HindIII及BamHI处理通过重叠PCR连接的基因片段merR mer-phzM及质粒pAK1900，反应体系加入限制性内切酶BamHI于30℃恒温反应10min后，再加入限制性内切酶HindIII于37℃恒温反应30min，具体反应体系如表6所示。双酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳实验和切胶回收实验纯化后进行回收及浓度测试。
表7质粒merR mer-phzM-pAK1900
Figure BDA0002071613410000091
通过连接反应将基因片段merR mer-phzM构建至pAK1900质粒，实现merR mer-phzM-pAK1900表达载体的构建。于16℃恒温过夜后取少量连接产物进行转化，使连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，在转化平板中于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定，并将鉴定正确的单克隆于LB培养基中过夜培养后送去上海生工生物公司进行测序，将测序结果正确的载体merR mer-phzM-pAK1900进行后续的构建实验。
表8基因片段mer-phzS和质粒merR mer-phzM-pAK1900酶切反应体系
Figure BDA0002071613410000092
表9扩增基因片段所用的引物
Figure BDA0002071613410000093
Figure BDA0002071613410000101
生物工程菌性能测试
一、生物工程菌识别二价汞的灵敏度测试
(1)从划线的含有merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900质粒的绿脓杆菌菌株的LB平板上挑取单菌落，接种于分装好的灭菌3mL的液体LB培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃220rpm恒温培养12h；
(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于100mL的液体KingA培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃250rpm恒温培养直至OD600＝0.05～0.07；
(3)分装上述生长至OD600＝0.05～0.07菌液(3mL/管)，分别向分装好的菌液中加入相应Hg2+标准液至终浓度分别为0μM、0.01μM、0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM于37℃220rpm继续培养12h(设置5个重复实验)；
(4)8000rpm离心5min后，定量移取2.5ml上清至5ml离心管中；
(5)加入1.5ml的氯仿，萃取离心后除去上层废液；
(6)吸取1ml下层溶液至1.5EP管中，再加入300μl 0.2M盐酸，充分振荡进行萃取后离心；
(7)使用UV-3600Plus紫外可见分光光度计检测并进行拍照。
结果显示，在10～1000nM Hg2+的浓度范围内，该工程菌均能产生不同含量肉眼可见的绿脓菌素(PYO)。随着Hg2+浓度的增加，体系产生的绿脓菌素不断增加，在Hg2+浓度达到1μM时产生绿脓菌素的含量最高。样品经处理后，该工程菌产生的绿脓菌素在酸性条件下呈现粉红色到深红色的变化，并且在520nm紫外吸收强度不断增加，结果如图5所示，并且在25-1000nM内呈现很好的线性关系如图6所示。研究成果表明，生物工程菌可高效、便捷、可视化检测水环境中痕量Hg2+。
二、工程菌识别Hg2+特异性性能研究
(1)从划线的含有merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900质粒的绿脓杆菌菌株的LB平板上挑取单菌落，接种分装好的灭菌3mL的液体LB培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃220rpm恒温培养12h；
(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于100mL的液体King A培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃250rpm恒温培养直至OD600＝0.05～0.07；
(3)分装上述生长至OD600＝0.05～0.07菌液(3mL/管)，分别向分装好的菌液加入相应金属离子溶液如Hg2+、Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+至最终浓度为0.5μM，于37℃220rpm继续培养12h(设置5个重复实验)；
(4)8000rpm离心5min后，定量移取2.5ml上清至5ml离心管中；
(5)加入1.5ml的氯仿，萃取离心后除去上层废液；
(6)吸取1ml下层溶液至1.5EP管中，再加入300μl 0.2M盐酸，充分振荡进行萃取后离心；
(7)使用UV-3600Plus紫外可见分光光度计检测并进行拍照。
环境中含有Hg2+时，工程菌显示较强的吸光度；而其他金属离子如Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+存在时，工程菌几乎不显示吸光度，结果如图7所示。由此说明，该工程菌能特异性识Hg2+，对Hg2+有较好选择性，可以有效检测环境中的Hg2+，相对环境中的其它金属离子如Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+均没有响应。研究结果表明，工程菌对Hg2+有较好的选择性，可特异性检测水环境中汞离子含量。
三、工程菌识别Hg2+的抗干扰性能研究
(1)从划线的的含有merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900质粒的绿脓杆菌菌株的LB平板上挑取单菌落，接种于分装好的灭菌3mL的液体LB培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃220rpm恒温培养12h；
(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于100mL的液体King A培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃250rpm恒温培养直至OD600＝0.05～0.07；
(3)分装上述生长至OD600＝0.05～0.07菌液(3mL/管)，分别向分装好的菌液加入Hg2+与Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+两两混合的溶液至各自最终浓度为0.1μM，于37℃220rpm继续培养12h(设置5个重复实验)；
(4)8000rpm离心5min后，定量移取2.5ml上清至5ml离心管中；
(5)加入1.5ml的氯仿，萃取离心后除去上层废液；
(6)吸取1ml下层溶液至1.5EP管中，再加入300μl 0.2M盐酸，充分振荡进行萃取后离心；
(7)使用UV-3600Plus紫外可见分光光度计检测并进行拍照。
由图8可看出，Hg2+与其他7种金属离子(Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+)两两混合的溶液与只含单一金属Hg2+的溶液相比，混合溶液的吸光度与只含有Hg2+的溶液吸光度相差不大。由此说明，在Hg2+与其他金属混合的情况下，其他金属离子并不影响该工程菌对汞离子的识别作用，该工程菌具有较好的单一金属选择性，可以有效的检测水体环境中的Hg2+而不受其他金属离子的影响。
四、工程菌在不同pH环境中对Hg2+的识别
(1)从划线的的含有merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900质粒的绿脓杆菌菌株的LB平板上挑取单菌落，接种于分装好的灭菌3mL的液体LB培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃220rpm恒温培养12h；
(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于pH分别为4、5、6、7、8、9、10的3ml液体King A培养基(含150μg/mL羧苄青霉素)中，于37℃250rpm恒温培养直至OD600＝0.05～0.07；
(3)往上述生长至OD600＝0.05～0.07菌液(3mL/管)，加入Hg2+标准液至最终浓度为0.1μM，于37℃220rpm继续培养12h(设置5个重复实验)；
(4)8000rpm离心5min后，定量移取2.5ml上清至5ml离心管中；
(5)加入1.5ml的氯仿，萃取离心后除去上层废液；
(6)吸取1ml下层溶液至1.5EP管中，再加入300μl 0.2M盐酸，充分振荡进行萃取后离心；
(7)使用UV-3600Plus紫外可见分光光度计检测并进行拍照。
由图9可明显看出，该菌在pH为4～10的PB培养基中培养，仍然能够识别Hg2+，显示出不同程度的吸光度，其中该菌在pH＝7的培养基中的吸光度最强。由此说明，该菌在pH为7的培养环境中对Hg2+的识别作用最佳，且在酸性和碱性条件下，仍然能够识别Hg2+，进一步说明环境对该生物工程菌的检测效果影响不大，可以有效的检测水体环境中的Hg2+而不易受到环境的限制，扩大了该菌的应用范围。
本发明利用基因工程技术，通过特异性结合Hg2+的金属调控蛋白MerR调控绿脓杆菌中绿脓菌素合成基因phzM和phzS的转录，从而达到检测Hg2+的目的，具体机理如下：在没有Hg2+的情况下，MerR蛋白以阻遏子的形式结合在启动子DNA上，抑制下游phzM及phzS基因的转录，此时绿脓杆菌仅有自身产生的微量绿脓菌素(PYO)，肉眼无法辨别；当Hg2+进入了细胞内部，Hg2+与细胞内的MerR蛋白结合，使金属调控蛋白MerR的构型发生变化进而导致与之结合的启动子DNA发生扭曲，从而激活下游phzM及phzS基因的转录，产生大量绿脓菌素(PYO)，并且其强度随金属离子Hg2+浓度的变化而变化，从而实现水污染体系中痕量Hg2+的可视化检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>南宁师范大学
<120>用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途
<160>15
<170>PatentIn version 3.5
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TTACGGCATAGCAGAACCAGCCAGTGAAGCACCACCTTGCAGCGAAGCGATCAGCGGACACGACACGTTACCGCGACGAGCATGACATGCGCAAACCAGTTCTGACAGCACTGCTTCCATACGTGCCAGGTCTGCCATCTTTTCACGGACATCCTTCAGTTTGTGTTCGGCCAGAGAGCTCGCTTCTTCGCAATGCGTACCGTCTTCCAGGCGCAGCAGTTCTGCGATTTCATCCAGGGAGAAGCCCAGACGCTGAGCACTTTTGACAAAGCGAACACGGGTCACGTCTGCTTCACCGTAGCGACGAATAGAGCCATACGGCTTATCCGGTTCCAGCAGCAGGCCTTTGCGTTGATAGAAGCGGATCGTTTCCACATTCACACCGGCAGCCTTAGCGAAGACACCAATCGTCAGGTTTTCCAGGTTATTTTCCATATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGCATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCGCGTAATTTGATACAAGTTGTTACCGGGGAATGGAAGTCCCGTTGCGTCTACGTCGCTACGCGCCTCGGGCTGGCCGATCTGATCGAGAGCGGGATCGACAGCGACGAGACGCTGGCCGCCGCGGTCGGTTCCGATGCCGAGCGCATCCATCGACTGATGCGCCTGCTGGTGGCCTTCGAGATCTTCCAGGGCGATACCCGCGACGGCTACGCCAATACCCCCACCAGCCACCTGCTGAGGGATGTCGAGGGCTCCTTCCGCGACATGGTGCTGTTCTACGGCGAGGAGTTCCACGCCGCCTGGACGCCCGCCTGCGAGGCGCTGCTCAGCGGTACCCCAGGCTTCGAGCTGGCGTTCGGCGAAGACTTCTACAGCTACCTGAAGCGCTGCCCGGATGCCGGCCGGCGCTTCCTGCTGGCGATGAAGGCGAGCAACCTGGCATTCCACGAGATCCCCAGGCTCCTGGATTTCCGCGGGCGTAGCTTCGTCGACGTCGGTGGCGGTTCCGGCGAATTGACCAAGGCCATCCTGCAGGCCGAGCCCAGCGCCCGGGGCGTGATGCTCGACCGCGAGGGTTCCCTCGGCGTGGCCCGCGACAACCTTTCCAGCCTGTTGGCAGGGGAGCGCGTCAGCCTGGTGGGCGGCGACATGCTGCAAGAGGTGCCGTCCAACGGCGATATCTACCTGCTGTCGCGGATCATCGGCGATCTGGACGAAGCCGCCAGCCTGCGGTTGCTCGGCAATTGCCGCGAGGCGATGGCCGGCGACGGCCGGGTGGTGGTGATCGAGCGGACCATCTCGGCCAGCGAGCCGTCGCCGATGTCGGTGCTCTGGGACGTGCACCTGTTCATGGCCTGCGCTGGCCGTCACCGCACCACCGAGGAGGTGGTCGACCTGCTCGGGCGCGGCGGCTTCGCGGTGGAGCGGATCGTCGACCTGCCGATGGAAACCCGCATGATCGTCGCTGCCAGGGCCTGATAA 1514
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
ATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGC 71
<210> 6
<211> 1280
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
ATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGC ATGAGCGAACCCATCGATATCCTCATCGCCGGCGCCGGCATCGGCGGCCTCAGTTGCGCCCTGGCCCTGCACCAGGCCGGCATCGGCAAGGTCACGCTGCTGGAAAGCAGCAGCGAGATACGCCCCCTTGGCGTCGGCATCAATATCCAGCCGGCGGCGGTCGAGGCCCTTGCCGAACTGGGCCTCGGCCCGGCGCTGGCGGCCACCGCCATCCCCACCCACGAGCTGCGCTACATCGACCAGAGCGGCGCCACGGTATGGTCCGAGCCGCGCGGGGTGGAAGCCGGCAACGCCTATCCGCAGTACTCGATCCATCGCGGCGAACTGCAGATGATCCTGCTCGCCGCGGTGCGCGAGCGCCTCGGCCAACAGGCGGTACGCACCGGTCTCGGCGTGGAGCGTATCGAGGAGCGCGACGGCCGCGTGCTGATCGGCGCCCGCGACGGACACGGCAAGCCCCAGGCGCTCGGTGCCGATGTGCTGGTCGGCGCCGACGGTATCCATTCGGCGGTCCGCGCGCACCTGCATCCCGACCAGAGGCCGCTGTCCCACGGTGGGATCACCATGTGGCGCGGCGTCACCGAGTTCGACCGCTTCCTCGACGGCAAGACCATGATCGTCGCCAACGACGAGCACTGGTCGCGCCTGGTCGCCTATCCGATCTCGGCGCGTCACGCGGCCGAAGGCAAGTCGCTGGTGAACTGGGTGTGCATGGTGCCGAGCGCCGCCGTCGGCCAGCTCGACAACGAGGCCGACTGGAACCGCGACGGGCGCCTGGAGGACGTGCTGCCGTTCTTCGCCGACTGGGACCTGGGCTGGTTCGACATCCGCGACCTGCTGACCCGCAACCAGTTGATCCTGCAGTACCCGATGGTAGACCGCGATCCGCTGCCGCACTGGGGCCGGGGACGCATCACCCTGCTCGGCGACGCCGCCCACCTGATGTATCCGATGGGCGCCAACGGCGCTTCGCAAGCAATCCTCGACGGCATCGAGCTGGCCGCCGCGCTGGCGCGCAACGCCGACGTGGCCGCAGCCCTGCGCGAATACGAAGAAGCGCGGCGGCCGACCGCCAACAAGATCATCCTGGCCAACCGAGAACGGGAAAAAGAGGAATGGGCCGCGGCTTCGCGACCGAAGACCGAGAAGAGCGCGGCGCTGGAAGCGATCACCGGCAGCTACCGCAACCAGGTGGAACGGCCACGCTAG1280
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
GTAGTAAGCTTTTACGGCATAGCAGAACCAGCC 33
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
AGCAGCAAGATTCGAATTATTCATGCGCTTGTCCTTTCGAATTGAAA 47
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
CAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGCATGAATAATTCGAATCTTGCT 47
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
GTAGTGGATCCTTATCAGGCCCTGGCAGCGA 31
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
GTAGTGGATCCATCGCTTGACTCCGTACA 29
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
TATCGATGGGTTCGCTCATGCGCTTGTCCTTTCGAA 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 13
TTCGAAAGGACAAGCGCATGAGCGAACCCATCGATA 36
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 14
GTAGTGGATCCTTACTAGCGTGGCCGTTCC 30
<210> 15
<211> 2794
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 15
TTACGGCATAGCAGAACCAGCCAGTGAAGCACCACCTTGCAGCGAAGCGATCAGCGGACACGACACGTTACCGCGACGAGCATGACATGCGCAAACCAGTTCTGACAGCACTGCTTCCATACGTGCCAGGTCTGCCATCTTTTCACGGACATCCTTCAGTTTGTGTTCGGCCAGAGAGCTCGCTTCTTCGCAATGCGTACCGTCTTCCAGGCGCAGCAGTTCTGCGATTTCATCCAGGGAGAAGCCCAGACGCTGAGCACTTTTGACAAAGCGAACACGGGTCACGTCTGCTTCACCGTAGCGACGAATAGAGCCATACGGCTTATCCGGTTCCAGCAGCAGGCCTTTGCGTTGATAGAAGCGGATCGTTTCCACATTCACACCGGCAGCCTTAGCGAAGACACCAATCGTCAGGTTTTCCAGGTTATTTTCCATATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGCATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCGCGTAATTTGATACAAGTTGTTACCGGGGAATGGAAGTCCCGTTGCGTCTACGTCGCTACGCGCCTCGGGCTGGCCGATCTGATCGAGAGCGGGATCGACAGCGACGAGACGCTGGCCGCCGCGGTCGGTTCCGATGCCGAGCGCATCCATCGACTGATGCGCCTGCTGGTGGCCTTCGAGATCTTCCAGGGCGATACCCGCGACGGCTACGCCAATACCCCCACCAGCCACCTGCTGAGGGATGTCGAGGGCTCCTTCCGCGACATGGTGCTGTTCTACGGCGAGGAGTTCCACGCCGCCTGGACGCCCGCCTGCGAGGCGCTGCTCAGCGGTACCCCAGGCTTCGAGCTGGCGTTCGGCGAAGACTTCTACAGCTACCTGAAGCGCTGCCCGGATGCCGGCCGGCGCTTCCTGCTGGCGATGAAGGCGAGCAACCTGGCATTCCACGAGATCCCCAGGCTCCTGGATTTCCGCGGGCGTAGCTTCGTCGACGTCGGTGGCGGTTCCGGCGAATTGACCAAGGCCATCCTGCAGGCCGAGCCCAGCGCCCGGGGCGTGATGCTCGACCGCGAGGGTTCCCTCGGCGTGGCCCGCGACAACCTTTCCAGCCTGTTGGCAGGGGAGCGCGTCAGCCTGGTGGGCGGCGACATGCTGCAAGAGGTGCCGTCCAACGGCGATATCTACCTGCTGTCGCGGATCATCGGCGATCTGGACGAAGCCGCCAGCCTGCGGTTGCTCGGCAATTGCCGCGAGGCGATGGCCGGCGACGGCCGGGTGGTGGTGATCGAGCGGACCATCTCGGCCAGCGAGCCGTCGCCGATGTCGGTGCTCTGGGACGTGCACCTGTTCATGGCCTGCGCTGGCCGTCACCGCACCACCGAGGAGGTGGTCGACCTGCTCGGGCGCGGCGGCTTCGCGGTGGAGCGGATCGTCGACCTGCCGATGGAAACCCGCATGATCGTCGCTGCCAGGGCCTGATAAATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTTACGCTATCCAATTTCAATTCGAAAGGACAAGCGCATGAGCGAACCCATCGATATCCTCATCGCCGGCGCCGGCATCGGCGGCCTCAGTTGCGCCCTGGCCCTGCACCAGGCCGGCATCGGCAAGGTCACGCTGCTGGAAAGCAGCAGCGAGATACGCCCCCTTGGCGTCGGCATCAATATCCAGCCGGCGGCGGTCGAGGCCCTTGCCGAACTGGGCCTCGGCCCGGCGCTGGCGGCCACCGCCATCCCCACCCACGAGCTGCGCTACATCGACCAGAGCGGCGCCACGGTATGGTCCGAGCCGCGCGGGGTGGAAGCCGGCAACGCCTATCCGCAGTACTCGATCCATCGCGGCGAACTGCAGATGATCCTGCTCGCCGCGGTGCGCGAGCGCCTCGGCCAACAGGCGGTACGCACCGGTCTCGGCGTGGAGCGTATCGAGGAGCGCGACGGCCGCGTGCTGATCGGCGCCCGCGACGGACACGGCAAGCCCCAGGCGCTCGGTGCCGATGTGCTGGTCGGCGCCGACGGTATCCATTCGGCGGTCCGCGCGCACCTGCATCCCGACCAGAGGCCGCTGTCCCACGGTGGGATCACCATGTGGCGCGGCGTCACCGAGTTCGACCGCTTCCTCGACGGCAAGACCATGATCGTCGCCAACGACGAGCACTGGTCGCGCCTGGTCGCCTATCCGATCTCGGCGCGTCACGCGGCCGAAGGCAAGTCGCTGGTGAACTGGGTGTGCATGGTGCCGAGCGCCGCCGTCGGCCAGCTCGACAACGAGGCCGACTGGAACCGCGACGGGCGCCTGGAGGACGTGCTGCCGTTCTTCGCCGACTGGGACCTGGGCTGGTTCGACATCCGCGACCTGCTGACCCGCAACCAGTTGATCCTGCAGTACCCGATGGTAGACCGCGATCCGCTGCCGCACTGGGGCCGGGGACGCATCACCCTGCTCGGCGACGCCGCCCACCTGATGTATCCGATGGGCGCCAACGGCGCTTCGCAAGCAATCCTCGACGGCATCGAGCTGGCCGCCGCGCTGGCGCGCAACGCCGACGTGGCCGCAGCCCTGCGCGAATACGAAGAAGCGCGGCGGCCGACCGCCAACAAGATCATCCTGGCCAACCGAGAACGGGAAAAAGAGGAATGGGCCGCGGCTTCGCGACCGAAGACCGAGAAGAGCGCGGCGCTGGAAGCGATCACCGGCAGCTACCGCAACCAGGTGGAACGGCCACGCTAG 2794

Claims (8)

1.一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，其中，merR mer-phzM-mer-phzS为重组基因，其基因序列如SEQ ID NO.15所示，pAK1900为质粒骨架，merR mer-phzM-mer-phzS基因序列的插入位点为限制性内切酶HindIII和BamHI在质粒骨架pAK1900上的双酶切位点之间；所述工程菌为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) 。
2.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用PCR技术分别扩增基因片段merR mer、phzM和phzS，将扩增后的基因片段merRmer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术拼接，并将拼接产物通过PCR技术扩增，得到基因片段merR mer-phzM；其中，merR mer的基因序列如SEQ ID NO.1所示，phzM的基因序列如SEQ ID NO.2所示，phzS的基因序列如SEQ ID NO.3所示，merR mer-phzM的基因序列如SEQID NO.4所示；
2)使用限制性内切酶HindIII和BamHI对载体质粒pAK1900和基因片段merR mer-phzM进行双酶切，使基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900同时露出相同的粘性末端，通过T4 DNA连接酶将基因片段merR mer-phzM和载体质粒pAK1900连接，构建质粒merR mer-phzM-pAK1900；
3)利用PCR技术扩增质粒merR mer-phzM-pAK1900中的基因片段mer，将扩增的基因片段mer和基因片段phzS通过重叠PCR技术实现连接，获得基因片段mer-phzS；其中，基因片段mer的基因序列如SEQ ID NO.5所示，mer-phzS的基因序列如SEQ ID NO.6所示；
4)使用限制性内切酶BamHI对质粒merR mer-phzM-pAK1900和基因片段mer-phzS进行单酶切，再用T4 DNA连接酶将质粒merR mer-phzM-pAK1900与基因片段mer-phzS连接，构建表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900；
5)将表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900转化至感受态细胞，扩增并提取表达载体merR mer-phzM-mer-phzS-pAK1900，转化至绿脓杆菌，获得所述生物工程菌。
3.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述感受态细胞为E.coli DH5α。
4.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，所述基因片段merR mer-phzM的构建方法为：分别以全基因合成的基因片段merR mer和基因片段phzM为模板，进行第一次PCR扩增反应以分别扩增基因片段merR mer和基因片段phzM，将扩增的基因片段merR mer和基因片段phzM通过重叠延伸PCR技术连接，获得连接片段merR mer-phzM，以连接片段merR mer-phzM为模板，通过PCR技术扩增，获得基因片段merRmer-phzM。
5.如权利要求4所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，第一次PCR扩增反应包含35个循环，其中，一次循环依次包括98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10-90s，引物为primer I和primer II；引物primer I序列如SEQ ID NO.7所示，引物primer II序列如SEQ ID NO.8所示。
6.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，基因片段mer-phzS的构建方法为：以质粒merR mer-phzM-pAK1900为模板进行第二次PCR扩增反应以扩增基因片段mer；以全基因合成的基因片段phzS为模板进行第三次PCR扩增反应以扩增基因片段phzS。
7.如权利要求6所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，其特征在于，第二次PCR扩增反应包含30个循环，其中，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，引物为primer V和primer VI；第三次PCR扩增反应包含30个循环，其中，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，引物为primer VII和primer VIII；引物primer V序列如SEQ ID NO.11所示，引物primer VI序列如SEQ ID NO.12所示，引物primer VII序列如SEQ ID NO.13所示，引物primer VIII序列如SEQ ID NO.14所示。
8.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途，其特征在于，所述生物工程菌用于检测水环境中是否含有二价汞离子。
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