CN101824483B - 一种霍乱弧菌o139群检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒，本发明的试剂盒包括BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照，还包括以以霍乱弧菌wbfR基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的霍乱弧菌O139群检测试剂盒检测效果更全面、特异性高、漏检率低，适用于霍乱弧菌O139群的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
霍乱是一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，至今已发生7次世界大流行，1961年开始由埃尔托霍乱弧菌引起的霍乱第7次世界大流行，波及140个国家和地区，报告病例400万以上。据WHO专家会议估计，全球每年约发生550万例，其中以亚洲、非洲和拉丁美洲较为严重，引起亚洲10万和非洲2万人死亡。时至今日，霍乱仍然是最危险的烈性传染病之一。因此，早期迅速和正确的诊断对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
目前霍乱弧菌已被分为 200 多个血清群, 但只有O1血清群和 O139 血清群能够引起流行，准确、快速地检测霍乱弧菌O139群具有十分重要的意义
传统霍乱弧菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应（PCR）技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术（LAMP）具有很多的优越性。
因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌O139群检测试剂盒及检测方法以解决上述问题。
基于环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplication of DNA, 简称LAMP）是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物（即内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63～65℃）条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP 法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需 10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高的不足提供检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌O139群检测试剂盒。
霍乱弧菌O139群有多个重要抗原。本发明检测的是wbfR基因，该wbfR基因为霍乱弧菌O139群O抗原139型的编码基因，可以特异地检测出霍乱弧菌O139群。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除霍乱弧菌O139群外，无其它菌带有该基因。
本发明所提供的霍乱弧菌O139群检测试剂盒包括下列组成：以霍乱弧菌wbfR基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3，BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照。
所述的两对内外引物分别为
外引物F3：GAAGGTATCTTCAAGTTAGAGC （SEQ ID NO 1）
外引物B3：ACGGAACATCCGATAACG （SEQ ID NO 2）
内引物FIP：TGGCATCCCAAAATGTTTGTTTAGATTTTCGGGTGTTATTGCTGTCT（SEQ ID NO 3）
内引物BIP：GCTGTTTCTCTGCAAAATTTTTCCGTTTTCTTGATCTTGAATAGACTGCTT （SEQ ID NO 4）
或
外引物F3：CTTTACGATCGGGTTTGAC （SEQ ID NO 5）
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT （SEQ ID NO 6）
内引物FIP：ACATGATCCGTTCCTAAGTGTTTTGTTTTCACGCGGATTTTAATGAAGC（SEQ ID NO 7）
内引物BIP：
GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG （SEQ ID NO 8）
或
外引物F3：CTTTAAAGGCAAGAGATATTGAAG （SEQ ID NO 9）
外引物B3：TTTTCACTAAAACATCGTCCA （SEQ ID NO 10）
内引物FIP：CCGCAGTATTTTTAACCAAAGGCTTTTACCTTTATACACGGGTTGT（SEQ ID NO 11）
内引物BIP：TACCGTTTTTGTCTGACTTAACAGATTTTTTAGATAAGATTGCTTATCCCAC （SEQ ID NO 12）
或
外引物F3：TAATGAAGCGAGTGAGGC （SEQ ID NO 13）
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT（SEQ ID NO 14）
内引物FIP：AGCATCTTCTGCACTGACAATTAATTTTCTCAGACGTTGCAAAACAC （SEQ ID NO 15）
内引物BIP：GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG （SEQ ID NO 8）。
所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为 1.2～2.0μmol/L；优选内引物FIP/BIP的浓度为0.2μmol/L，外引物 F3/B3的浓度为1.6μmol/L。
所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10 U/μL，优选酶浓度为8 U/μL。
所述的反应液含：1.6～2mmol/L dNTPs、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L （NH4）2SO4、8～10mmol/L MgSO4、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；
优选2mmol/L dNTPs、25mmol/L Tris-HCl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L （NH4）2SO4、10mmol/L MgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱。
所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green，优选SYBR Green I。
所述稳定液为石蜡油。
所述的阳性对照为霍乱弧菌O139群基因组DNA。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种霍乱弧菌O139群检测方法，包括如下步骤：
（1）将待测样品离心，去上清，得到沉淀；
（2）将步骤（1）的沉淀加入本发明检测试剂盒中的样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；
（3）在反应容器中加入本发明试剂盒中的Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA 4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物 F3/B3各4体积份数，恒温反应；
（4）在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
步骤（3）中所述的恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的RfbN基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测霍乱弧菌O139群的准确率更高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1 试剂盒的制备
（1）按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
外引物F3：GAAGGTATCTTCAAGTTAGAGC （SEQ ID NO 1）
外引物B3：ACGGAACATCCGATAACG （SEQ ID NO 2）
内引物FIP：TGGCATCCCAAAATGTTTGTTTAGATTTTCGGGTGTTATTGCTGTCT （SEQ ID NO 3）
内引物BIP：GCTGTTTCTCTGCAAAATTTTTCCGTTTTCTTGATCTTGAATAGACTGCTT（SEQ ID NO 4）。
（2）购置DNA聚合酶：Bst DNA 聚合酶置于容器；
（3）配制反应液和引物：反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L（NH4）2SO4、10mmol/L MgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.2μmol/L和外引物 F3/B3各0.25μmol/L，置于容器；
（4）配制样品预处理液：样品预处理液含有20 mmol/L Tris- HCl （pH 8.0）、2 mmol/L EDTA和1.2体积% Triton X-100，置于容器；
（5）购置稳定液：石蜡油，置于容器；
（6）购置显色液： SYBR Green I，置于容器；
（7）提取阳性对照：提取霍乱弧菌O139群基因组DNA，置于容器；
（8）将上述7个容器装成试剂盒，封装。
制备工艺简述如下：
1、将内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将上述（2）~（4）步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。
在本发明霍乱弧菌O139群检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是
外引物F3：CTTTAAAGGCAAGAGATATTGAAG （SEQ ID NO 9）
外引物B3：TTTTCACTAAAACATCGTCCA （SEQ ID NO 10）
内引物FIP：CCGCAGTATTTTTAACCAAAGGCTTTTACCTTTATACACGGGTTGT（SEQ ID NO 11）
内引物BIP：TACCGTTTTTGTCTGACTTAACAGATTTTTTAGATAAGATTGCTTATCCCAC （SEQ ID NO 12）
实施例2 试剂盒的制备
（1）按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
外引物F3：CTTTACGATCGGGTTTGAC （SEQ ID NO 5）
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT （SEQ ID NO 6）
内引物FIP：ACATGATCCGTTCCTAAGTGTTTTGTTTTCACGCGGATTTTAATGAAGC （SEQ ID NO 7）
内引物BIP：GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG （SEQ ID NO 8）
（2）购置DNA聚合酶：Bst DNA 聚合酶置于容器；
（3）配制反应液和引物：反应液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-Cl、10mmol/L KCl、10mmol/L（NH4）2SO4、8mmol/L MgSO4、0.1体积％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.25μmol/L和外引物 F3/B3各1.2μmol/L，置于容器；
（4）配制样品预处理液：样品预处理液含有10 mmol/L Tris- HCl （pH 8.0）、1 mmol/L EDTA和1.0体积% Triton X-100，置于容器；
（5）购置稳定液：石蜡油，置于容器；
（6）购置显色液： EVA Green I，置于容器；
（7）提取阳性对照：提取霍乱弧菌O139群基因组DNA，置于容器；
（8）将上述7个容器装成试剂盒，封装。
其他同实施例1。
在本发明霍乱弧菌O139群检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是
外引物F3：TAATGAAGCGAGTGAGGC （SEQ ID NO 13）
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT （SEQ ID NO 14）
内引物FIP：AGCATCTTCTGCACTGACAATTAATTTTCTCAGACGTTGCAAAACAC （SEQ ID NO 15）
内引物BIP：GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG （SEQ ID NO 16）。
实施例3 霍乱弧菌O139群检测试剂盒的应用
1材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
本发明采用菌株有17株，主要来源于中国疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、浦东新区疾病预防控制中心。详见表1。
1．2 分离菌株的鉴定
1．2．1将标本接种至TCBS琼脂、双洗平板上，TCBS上出现黄色菌落，双洗平板上出现灰黑色中心的菌落均为可疑菌落。在显微镜下菌体为稍弯的杆菌，菌体短，逗点状，菌体单端有一根鞭毛，运动活泼呈穿梭状，革兰氏染色阴性。生化反应：氧化酶+ 蔗糖+ 靛基质- 硫化氢- 动力+ V-P+。
血清学反应：与霍乱弧菌0139群多价诊断血清发生凝集，生理盐水不凝集。
1.3 样品处理（模板DNA提取）
1.3.1 取1mL液体培养的菌液样品，10000rpm离心2分钟，获得菌体沉淀；
1.3.2 在上述菌体沉淀中加入100μL样品预处理液混合均匀，沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。
1.4、采用实施例1或实施例2的试剂盒进行环介导等温扩增技术的反应过程
1.4.1 在200μL 反应管配制反应体系：反应液和引物共 22μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（4U），稳定液30μL，模板DNA 2.5μL。
1.4.2将配制好的反应管于65℃恒温反应1小时。
1.5反应后处理
向上述反应产物中加入2μL SYBR Green I，混匀，同时也向阳性对照管（霍乱弧菌O139群基因组DNA）和阴性对照管（去离子水）中加入SYBR Green I混匀，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。
1．6电泳
配制0.2%琼脂糖凝胶电泳。以SYBR Green I作为染料进行显色反应观察结果。
1．7 特异度试验
1．7．1 纯菌株LAMP检测 用LAMP方法对25株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。
1．7．2 几种菌株混合DNA检测 用LAMP对霍乱弧菌O139群及沙门氏、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的DNA等体积混合液取2.5ul作LAMP检测。
1．8 灵敏度试验 将霍乱弧菌O139群于普通营养琼脂平板上纯培养18-24小时后，挑两满环菌落混悬于5mL无菌生理盐水中，用生理盐水10倍倍比稀释至10-10。选择适宜的3个浓度级取100ul平铺于普通营养琼脂平板上，分别作3个平板，37℃培养48h，取菌落数在30～300之间的平板作平板计数，该浓度级的3个平板的菌落数的均数推算细菌浓度，为菌落平均数×稀释倍数×10；同时，各浓度级取1mL，提取DNA，作LAMP检测。
1．8 重复性试验 特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。
2 结果
2．1霍乱弧菌O139群 LAMP检测方法的建立
2．2 特异度试验 霍乱弧菌O139群（编号N16961）检测结果阳性，11株非霍乱弧菌O139群均阴性，霍乱弧菌O139群的5例样品及霍乱弧菌O139群、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌4种细菌DNA混合液为阳性，如表2所示。结果显示试剂盒具有高特异性。
2．3 灵敏度试验
经菌落平板计数，选择第9个稀释度进行读数，平均菌落数为126cfu，推算细菌原液浓度为1.26×1011cfu/mL ，LAMP方法可检测到第4个稀释度，为1.26×107cfu/mL。
电泳结果也符合上述结果。
2．4 重复性试验 特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州华峰生物科技有限公司，中华人民共和国上海出入境检验检疫局
<120> 一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒及其检测方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaggtatct tcaagttaga gc 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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acggaacatc cgataacg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggcatccca aaatgtttgt ttagattttc gggtgttatt gctgtct 47
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgtttctc tgcaaaattt ttccgttttc ttgatcttga atagactgct t 51
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctttacgatc gggtttgac 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acctcttttt tagccagct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acatgatccg ttcctaagtg ttttgttttc acgcggattt taatgaagc 49
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<212> DNA
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<400> 8
gttacctgtt atgtacgatg aacctttttt cgaaaccaga aacgtagg 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctttaaaggc aagagatatt gaag 24
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ttttcactaa aacatcgtcc a 21
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ccgcagtatt tttaaccaaa ggcttttacc tttatacacg ggttgt 46
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acctcttttt tagccagct 19
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<212> DNA
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<400> 15
agcatcttct gcactgacaa ttaattttct cagacgttgc aaaacac 47
Claims (8)
1.一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒，包括Bst DNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照，其特征在于：还包括以霍乱弧菌wbfR基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的霍乱弧菌O139群两对内外引物序列分别为：
外引物F3：GAAGGTATCTTCAAGTTAGAGC SEQ ID NO 1
外引物B3：ACGGAACATCCGATAACG SEQ ID NO 2
内引物FIP：TGGCATCCCAAAATGTTTGTTTAGATTTTCGGGTGTTATTGCTGTCT SEQ ID NO 3
内引物BIP：GCTGTTTCTCTGCAAAATTTTTCCGTTTTCTTGATCTTGAATAGACTGCTT SEQ ID NO 4
或
外引物F3：CTTTACGATCGGGTTTGAC SEQ ID NO 5
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT SEQ ID NO 6
内引物FIP：ACATGATCCGTTCCTAAGTGTTTTGTTTTCACGCGGATTTTAATGAAGC SEQ ID NO 7
内引物BIP：GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG SEQ ID NO 8
或
外引物F3：CTTTAAAGGCAAGAGATATTGAAG SEQ ID NO 9
外引物B3：TTTTCACTAAAACATCGTCCA SEQ ID NO 10
内引物FIP：CCGCAGTATTTTTAACCAAAGGCTTTTACCTTTATACACGGGTTGT SEQ ID NO 11
内引物BIP：TACCGTTTTTGTCTGACTTAACAGATTTTTTAGATAAGATTGCTTATCCCAC SEQ ID NO 12
或
外引物F3：TAATGAAGCGAGTGAGGC SEQ ID NO 13
外引物B3：ACCTCTTTTTTAGCCAGCT SEQ ID NO 14
内引物FIP：AGCATCTTCTGCACTGACAATTAATTTTCTCAGACGTTGCAAAACAC SEQ ID NO 15
内引物BIP：GTTACCTGTTATGTACGATGAACCTTTTTTCGAAACCAGAAACGTAGG SEQ ID NO 8。
2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.2～2.0μmol/L。
3.根据权利要求2所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：内引物FIP/BIP的浓度为0.2μmol/L，外引物F3/B3的浓度为1.6μmol/L。
4.根据权利要求1所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶∶酶浓度4-10U/μl；所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green。
5.根据权利要求4所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述的酶浓度为8U/μL，所述的显色液为SYBR Green I。
6.根据权利要求1所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液含：1.6～2mmol/L dNTPs、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L(NH4)2SO4、8～10mmol/L MgSO4、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱。
7.根据权利要求6所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述的反应液含：2mmol/L dNTPs、25mmol/L Tris-HCl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/LMgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱。
8.根据权利要求1所述的霍乱弧菌O139群检测试剂盒，其特征在于：所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为霍乱弧菌O139群基因组DNA。
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