CN110124045A - 疟原虫var2csa蛋白在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，将疟原虫VAR2CSA蛋白作为抗癌药物靶向性载体，将抗癌药物靶向性投递到肿瘤细胞内或体内，具体的是将miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，得到耦合物，耦合物加入常规辅料制备成抗肿瘤药物；利用疟原虫VAR2CSA蛋白可以靶向性地将miRNAs或siRNAs投递到肿瘤细胞内，抑制肿瘤细胞的生长、转移，并最终导致肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞的转移，使之成为未来肿瘤的有价值的治疗选项。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的分子生物学研究，尤其涉及源于疟原虫编码的VAR2CSA蛋白在疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
疟原虫VAR2CSA蛋白是一种分离自疟原虫体上的蛋白，它可以特异性地识别肿瘤细胞表面表达的一种跨膜蛋白---硫酸软骨素(chondroitin sulfate(CS))。
MicroRNA(简称miRNA)是一类约为20-24nt(Neucliotide，nt)非编码单链RNA分子，20世纪90年代初期在秀丽隐杆线虫的体内被首次鉴定。miRNA不参与蛋白质编码，但是能经mRNA切割和阻遏蛋白的翻译进而对靶基因进行各种调节，而对细胞的成长、增殖、分化和凋亡等一系列的细胞生命活动产生影响。研究表明miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。
随着肿瘤进一步的研究，发现miRNA与肿瘤间的关系十分密切，研究显示肿瘤的发生和发展与miRNA密切相关。研究证实了，一些miRNAs在肿瘤中含量的异常升高能促进细胞增加繁殖能力、血管的形成迁移能力等，这类miRNA在癌症的发生、生长方面起重要作用；反之，有的miRNA含量的异常升高却具有抑制肿瘤细胞生长、肿瘤组织血管的形成、侵袭等能力。这类miRNA在肿瘤细胞中的表达量异常降低，扮演着抑癌基因的角色。
小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)有时称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与专一性的基因的调节和表达。
发明内容
本发明提供疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，将疟原虫VAR2CSA蛋白作为抗癌药物靶向性载体，将抗癌药物靶向性投递到肿瘤细胞内，具体的是将miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，得到耦合物，耦合物加入常规辅料制备成抗肿瘤药物。
所述将miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上的方法为常规现有技术；包括但不限于将两者直接混合后得到。
所述miRNAs的相关表达质粒为miRNAs-mimics系列质粒或pGCMV/EGFP/has-ati-miRNAs干扰质粒等。
所述siRNAs的相关表达质粒为siRNA系列表达质粒。
所述疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白。
所述miRNAs、siRNAs的核苷酸序列是公知的。
本发明的耦合物加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善药物吸收效果或便于服用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等。
本发明所述的辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明的有益效果：
本发明将疟原虫VAR2CSA蛋白作为抗癌药物靶向性载体，利用疟原虫VAR2CSA蛋白可以靶向性地将miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒投递到肿瘤细胞内，抑制肿瘤细胞的生长、转移，并最终导致肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞的转移。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，如无特殊说明，所涉及到的代码、简称均是本领域技术人员的公知常识。
实施例1
将miR-218-mimics质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的miR-218-mimics质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，利用带正电荷的重组蛋白质与带负电荷的miR-218-mimics质粒通过静电作用相互偶联，在室温下放置12h即可得到miR-218-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的miR-218-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的miR-218-mimics质粒加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入miR-218-mimics质粒，单独将与实验组相同量的VAR2CSA蛋白加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入miR-218-mimics质粒和VAR2CSA蛋白的个旧肺磷癌(YTMLC-90)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的miR-218-mimics投递到个旧肺鳞癌(YTMLC-90)肿瘤细胞内，miR-218-mimics在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例2
将miR-218-mimics质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的miR-218-mimics质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到miR-218-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的miR-218-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的miR-218-mimics质粒加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入miR-218-mimics质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入miR-218-mimics质粒和VAR2CSA蛋白的宣威肺腺癌(XWLC-05)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的miR-218-mimics投递到宣威肺腺癌(XWLC-05)肿瘤细胞内，miR-218-mimics在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例3
将miR-34a-mimics质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的miR-34a-mimics质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到miR-34a-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的miR-34a-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入疟原虫VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的miR-34a-mimics质粒加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入miR-34a-mimics质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入宣威肺腺癌(XWLC-05)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入miR-34a-mimics质粒和VAR2CSA蛋白的宣威肺腺癌(XWLC-05)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的miR-34a-mimics质粒投递到宣威肺腺癌(XWLC-05)肿瘤细胞内，miR-34a-mimics质粒在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例4
将miR-34a-mimics质粒耦合在VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的miR-34a-mimics质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到miR-34a-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的miR-34a-mimics质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入疟原虫VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的miR-34a-mimics质粒加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入miR-34a-mimics质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入miR-34a-mimics质粒和VAR2CSA蛋白的个旧肺磷癌(YTMLC-90)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的miR-34a-mimics投递到个旧肺鳞癌(YTMLC-90)肿瘤细胞内，miR-34a-mimics在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例5
将has-ati-miR-21干扰质粒耦合在VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的has-ati-miR-21干扰质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到has-ati-miR-21质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的has-ati-miR-21干扰质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入疟原虫VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的has-ati-miR-21质粒加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入has-ati-miR-21质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入个旧肺鳞癌(YTMLC-90)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入has-ati-miR-21质粒和VAR2CSA蛋白的个旧肺磷癌(YTMLC-90)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的has-ati-miR-21投递到个旧肺鳞癌(YTMLC-90)肿瘤细胞内，has-ati-miR-21在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例6
将has-ati-miR-21干扰质粒耦合在VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对个大肠癌(CT-26)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的has-ati-miR-21干扰质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到has-ati-miR-21质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的has-ati-miR-21干扰质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入大肠癌(CT-26)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入疟原虫VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的has-ati-miR-21质粒加入大肠癌(CT-26)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入has-ati-miR-21质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入大肠癌(CT-26)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入has-ati-miR-21质粒和VAR2CSA蛋白的大肠癌(CT-26)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的has-ati-miR-21投递到大肠癌(CT-26)肿瘤细胞内，has-ati-miR-21在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例7
将has-ati-miR-21干扰质粒耦合在VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对脑胶质瘤(U251)细胞的抑制作用。
具体步骤如下：
(1)将等体积的has-ati-miR-21干扰质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到has-ati-miR-21质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)将步骤(1)制备得到的has-ati-miR-21干扰质粒/疟原虫VAR2CSA蛋白耦合物加入脑胶质瘤(U251)细胞的培养液中，作为实验组；
未加入疟原虫VAR2CSA蛋白，单独将与实验组相同量的has-ati-miR-21质粒加入脑胶质瘤(U251)细胞的培养液中，作为对照组I；
未加入has-ati-miR-21质粒，单独将与实验组相同量的疟原虫VAR2CSA蛋白加入脑胶质瘤(U251)细胞的培养液中，作为对照组II；
未加入has-ati-miR-21质粒和VAR2CSA蛋白的脑胶质瘤(U251)的细胞，作为对照组Ⅲ；
(3)用酶标仪每隔24小时对处理后的每组细胞测定一次，进行连续一周的测定，实验组、对照组I、对照组II、对照组Ⅲ进行比较，结果显示：
实验组中肿瘤细胞的生长能力被显著抑制了，对照组I中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组II中肿瘤细胞的生长能力抑制不明显，对照组Ⅲ中肿瘤细胞的生长能力未受到抑制，说明疟原虫VAR2CSA蛋白能将携带的has-ati-miR-21投递到脑胶质瘤(U251)肿瘤细胞内，has-ati-miR-21在这种细胞内的高表达能抑制癌细胞的生长。
实施例8
将has-ati-miR-21干扰质粒耦合在VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照常规现有方法人工合成的重组蛋白，得到耦合物，本实施例考察该耦合物对癌细胞的抑制作用。
本实施例将耦合物用于SD大鼠体内实验，考察该耦合物对SD大鼠的C6脑胶质瘤的生长的抑制作用，具体步骤如下：
(1)将等体积的has-ati-miR-21干扰质粒和疟原虫VAR2CSA蛋白混合，室温下放置12h，得到has-ati-miR-21干扰质粒/VAR2CSA蛋白耦合物；
(2)SD大鼠模型的建立，复苏C6脑胶质瘤细胞株，用含10％标准小牛血清的RPMI1640全培养基常规传代培养，将对数生长期的细胞调整为适宜浓度1×106μL；
(3)取体重在200～250g的SD大鼠，10％戊巴比妥那注射麻醉(0.3mL/100g)，将麻醉后的大鼠头部固定在脑立体定向仪上，常规备皮，消毒，铺巾；内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，分离暴露颅骨；以牙科电钻(转速2000r/min)在颅骨上钻一小孔，注射位点为冠状缝前1mm，中线右旁开3mm，深5mm；20μL微量注射器抽取步骤(2)培养的C6脑胶质瘤细胞悬液15μL(约1×106个)，注射完毕后留针3～5min，缓慢拔针，骨孔用明胶海绵填充后，骨蜡封闭；生理盐水冲洗手术部分，缝合切口后消毒皮肤；
(4)取步骤(3)中40只脑皮质层接种了C6脑胶质瘤的SD大鼠随机分成5组，每组8只，在C6脑胶质瘤细胞接种第3天后，各组采用尾部静脉给药法注射3次，各组注射时间相同，本实施例分别在第4天、第9天、第14天进行注射，具体分组及注射药物如下：
I组：即对照组，单独注射生理盐水0.4mL/(20g.d)；
Ⅱ组：即阳性对照组，单独注射洛莫司汀2mg/(kg.d)；
Ⅲ组：即实验组，注射has-ati-miR-21干扰质粒/VAR2CSA蛋白耦合物(体积为0.5uL，浓度为10umol/L)；
Ⅳ组：即非耦合组I，注射has-ati-miR-21干扰质粒(体积为0.5uL，浓度为10umol/L)50.0mg/(kg.d)；
Ⅴ组：即非耦合组Ⅱ，单独注射疟原虫VAR2CSA蛋白(体积为0.5uL，浓度为10umol/L)50.0mg/(kg.d)；
(5)于接种后的第20天解剖SD大鼠，按垂直和水平方向测量肿瘤大小，肿瘤体积＝a2bπ/6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。
实验结果显示Ⅳ组的抑瘤率为17.6％、Ⅱ组的抑瘤率为64.3％、Ⅲ组的抑瘤率为89.5％、Ⅴ组的抑瘤率为1.2％；可见pGCMV/EGFP/has-ati-miR-21干扰质粒/VAR2CSA蛋白耦合物能够明显抑制SD大鼠的C6脑胶质瘤的生长；各组均是与生理盐水组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。
上述实施例中所列举的质粒均为本领域常规质粒，miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，疟原虫VAR2CSA蛋白作为抗癌药物靶向性载体，将抗癌药物靶向性投递到肿瘤细胞内，均能够明显抑制肿瘤细胞的生长，在此不一一列举。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个技术方案，说明书这种叙述方式仅为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书视为一个整体，各实施例中的技术方案也可以进行组合，形成本领域技术人员其他可以理解的实施例。
Claims (5)
1.疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将miRNAs、siRNAs、miRNAs的相关表达质粒或siRNAs的相关表达质粒耦合在疟原虫VAR2CSA蛋白上，得到耦合物，耦合物加入常规辅料制备成抗肿瘤药物。
3.根据权利要求2所述疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，miRNAs的相关表达质粒为miRNAs-mimics系列质粒或pGCMV/EGFP/has-ati-miRNAs干扰质粒。
4.根据权利要求2所述疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，siRNAs的相关表达质粒为siRNA系列表达质粒。
5.根据权利要求2所述疟原虫VAR2CSA蛋白在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，疟原虫VAR2CSA蛋白是按照现有方法人工合成的的重组蛋白。
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