CN110121648A - 预装注射器中生物制品的稳定性的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用定制设计的模拟肽模拟和评价预装注射器(PFS)中生物制品的化学降解风险的方法。这种方法还能够预测医疗用容器中溶液中的生物制品降解的倾向性。

Description

预装注射器中生物制品的稳定性的评价方法
技术领域
本发明的技术领域是评价预装注射器(PFS)中生物制品的稳定性。
本发明涉及一种确定生物制品的化学降解风险的方法，该降解主要通过接触、特别是长期接触用于医疗用途的容器的组成部分、例如注射器和包含至少一种氨基酸的生物制品发生，所述氨基酸选自甲硫氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，半胱氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸和苯丙氨酸。
众所周知，由于法规、安全性和质量要求，药物产品的开发和制造具有挑战性。特别地，应管理和控制患者被污染化合物污染的风险，以评价质量风险管理。
当药物产品在用于医疗用途的容器中的溶液中时污染化合物的风险增加，典型的是包含例如疫苗的预装注射器。当考虑药物物质或药物产品在整个制造、填充、包装和标记、储存和运输过程中直接和/或间接接触的所有聚合物物质表面时，污染化合物是不可避免的。污染化合物的来源可以来自容器的组成部分(例如玻璃桶、不锈钢皮下针头、橡胶针头护罩、硅油润滑剂和橡胶柱塞)，而其他令人惊讶的其它来源来自加工工具的残留物和用于连接针头与所述桶且更一般地为来自用于医疗用途的容器的组成部分的添加剂。
污染化合物可以通过化学修饰治疗性生物制品或通过具有直接的免疫佐剂活性来增强免疫原性。
因此，需要预测长期储存的生物制品所面临的医疗用容器污染化合物释放的风险。因此，递药装置供应商和药品制造商进行可提取物和可浸出物研究来预测和评价那些可能会渗入容器并与生物制品接触的污染化合物的性质。产品质量研究所(ProductQuality Research Institute)(PQRI)为口腔吸入鼻用药品OINDP中可提取物和可浸出物(E&Ls)评价的最佳实践做出了重大贡献，并且目前正集中于胃肠外和眼科药物产品(PODP)，以便将可浸出物分类为遗传毒物、刺激物、敏化剂和其他毒物，其中每个类别均存在提出的阈值。由于对该分类方案进行验证和足以进行统计分析的数据集，所以污染化合物将基于其相应的阈值考虑进行鉴定。
然而，需要一种连贯的科学框架，其能够理解污染化合物与生物制品的相互作用并导致化学降解的可能性。
为了评价预装注射器(PFS)系统在开发单克隆抗体(mAb)产品中的适用性，已经开发了一种已知的实验方法，该方法由对最少6个月加速稳定性研究期间接触预装注射器部件时整个生物制品的完整性的如下评估组成。这种方法突出了可浸出物与生物制品相互作用的可能性，但每种蛋白质的独特性使得该研究非常特殊，并且限制药物制造商对正在开发中的每种生物产品进行这类长期且昂贵的研究。
已经开发了另一种已知的实验方法，其显示出对易受浸出液诱导的结构改变敏感的生物制品的重要关注，并提出了用于生物技术产品的整体可提取和可浸出程序。该方法鉴定了可能形成蛋白质共价修饰的化合物，并且他们已经建立了用于基于科学和风险的可提取物和可浸出物分析的决策树。然而，这种方法需要发现、鉴定和量化来自用于医疗用途的容器的组成部分的任何材料的所有潜在的可提取物和可浸出物。该信息主要由递药装置供应商作为技术诀窍保护，因此不易获得。为了获得详尽的清单，必须使用一组分析技术和详尽的筛选方法以及化学结构鉴定方面的相关专业知识进行可提取物/可浸出物研究。
因此，本领域持续需要优化基于科学的方法，以降低生物制品在医疗用途容器(如预装注射器)中的长期稳定性风险。
令人惊讶的是，本发明人发现使用模拟模型肽可以满足这一要求。使用定制设计的模拟肽，本发明人开发了一种模拟和评价生物制品与医用容器的组成部分接触时的化学降解的方法。这种方法还能够预测医疗用容器中的溶液中生物制品降解的倾向性。
在本发明的上下文中，本发明涉及确定式(I)化合物因接触用于医疗用途的容器的组成部分的降解百分比的方法，包含以下连续步骤：
i)制备包含下式(I)的化合物的水溶液：
其中：
R1、R2、R4和R5各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
n和m各自彼此独立地表示0-10的整数；
R3表示-(CH2)2-COOH、-CH2-COOH、-(CH2)4-COOH、
-CH2-OH、-C(OH)-CH3、-CH2-CO-NH2、CH2-SH、-(CH2)4-NH2、
-(CH2)2-CO-NH2、-CH2-CH2-S-CH3、-(CH2)3-NH-C(NH)-NH2；
或R3表示下式(II)的基团：
其中R6、R7、R8和R9各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
r和p各自彼此独立地表示0-10的整数；
ii)在1小时至2个月的时间期限期间、在5-80℃温度下向在步骤i)制备的溶液中添加用于医疗用途的容器的组成部分；
iii)通过液相色谱法分析在步骤ii)得到的溶液；和
iv)测定降解百分比。
本发明预期提供具有如下特征的一个或多个的新方法：
-本发明的方法能够模拟生物制品的降解敏感位置；
-本发明的方法能够评价对于医疗用途的容器组成部分如预装注射器部件发生相互作用的生物制品敏感位置的倾向性；
-本发明的方法能够有助于生物技术/药物制造商对用于医疗用途的容器进行最低风险的选择并且确保可预测的销售时间；
-本发明的方法能够评价药物添加剂在保护药物完整性方面的效能；
-本发明的方法能够研发用于快速筛选关联性评价的方法和工具；
-本发明的方法能够为与用于医疗用途的容器的组成部分、工艺残留物、混合物或各可提取物直接接触的模型溶液提供加速稳定性研究；
-本发明的方法能够预测生物制品的降解风险；
-本发明的方法能够有助于生物技术/药物制造商筛选并且进一步选择早期药物研发过程中的容器的适合部件；
-本发明的方法能够有助于生物技术/药物制造商选择用于医疗用途配置的容器的最佳适合部件；
-本发明的方法能够理解用于医疗用途的预装容器中的生物制品的用于销售后研究的相互作用问题；
-本发明的方法能够评价容器的新的部件(组成部分)；
-本发明的方法能够选择容器的最佳适合部件；
-本发明的方法能够控制和评价容器组成部分的改变后果。
定义
所谓术语“用于医疗用途的容器的组成部分”表述中使用的“容器的组成部分(部件)”，应理解为整个容器本身、容器的一部分、容器的元件或用于制造该容器的材料，或甚至污染化合物。本发明的容器不受制造材料的限制，并且包括许多材料，例如玻璃，金属(例如，钢，不锈钢，铝等)，聚合物(例如，热塑塑料，弹性体，热塑塑料-弹性体)和硅油润滑剂。常用聚合物包括聚乙烯(PE)，聚丙烯(PP)，聚碳酸酯(PC)，氟化乙烯-丙烯(FEP)，乙烯四氟乙烯(ETFE)和聚四氟乙烯(PTFE)。常用的弹性体包括饱和和不饱和弹性体：溴丁基弹性体，氯丁基异戊二烯共混物，天然橡胶和合成聚异戊二烯橡胶，丁基橡胶和卤代丁基橡胶，丁苯橡胶，丁腈橡胶，乙丙橡胶(EPM)和乙烯丙烯二烯橡胶，聚丙烯酸橡胶，硅橡胶，氟硅橡胶，含氟弹性体，全氟弹性体，聚醚嵌段酰胺，氯磺化聚乙烯，乙烯-乙酸乙烯酯等。
应理解，用于医疗用途的容器的组成部分可含有污染化合物。
其他材料是聚酯，聚偏二氯乙烯(PVDC)，乙基乙烯醇(EVOH)，共聚物，聚酰胺(PA)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚砜(PS)。
常用金属包括铬，铜，铁，锰，镍，钨和锌，锂，硼(bore)，镁，铝，硅，钛，铬，钴，砷，锑，钡及其氧化衍生物；
所谓“医疗用容器”这一表述应理解用于“包含”、“保持”、“混合”、“共混”、“分配”、“注射”、“转移”、“雾化”等的任何方式。在研究、加工、开发、配制、制造、储存和/或施用期间的生物制品。例如，本发明的医疗用容器包括但不限于普通实验室玻璃器皿，烧瓶，烧杯，刻度量筒，发酵罐，生物反应器，配管，管，袋，一次性使用的生物质袋，缸瓶，小瓶，小瓶盖(例如，橡胶塞，螺帽)，安瓿，注射器，预装注射器，可预装的注射器，自动注射器，笔式注射器，塞，注射器塞，注射器柱塞，橡胶塞，塑性材料填盖，玻璃盖，圆筒，尖端帽，帽，针头，活塞，柱塞，柱塞杆，玻璃桶，不锈钢皮下注射针头，橡胶针头护罩，涂覆的橡胶柱塞，粘合剂标签，墨水标签，涂层标签等。本发明中关注的用于医疗用途的另外的容器可以在实验室设备供应商和制造商的公开目录中找到，例如VWR(TM)(West Chester,PA)、BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)、Fisher Scientific International Inc.(Hampton,NH)和Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
所谓表述“预装注射器”应理解为已经预装流体的注射器，也缩写为PFS。
所谓表述“可预装注射器”应理解为能够填充的空注射器。
所谓表述“注射器”应理解为预装或可预装的注射器。
所谓表述“递药装置提供者”应理解为用于医疗用途的容器部件的提供者。
如本文所定义，本发明的“生物制品”包括肽，蛋白质，多糖-蛋白质缀合物，基于蛋白质的生物制药产品，用于人和/或动物用途的药物产品。大多数情况下，生物制品可以是活性药物成分(API)。API旨在提供药理学活性或其他直接影响疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或影响人或动物体的结构或任何功能。
所谓术语“降解”或“化学降解”应理解为由于与环境中的成分反应，特别是与污染化合物的反应而对生物制品的化学改变。通常，这些改变与最活泼的侧链一起发生，并且主要是氧化、还原和亲核和亲电取代。降解包括肽键断裂，外消旋化，β-消去和蛋白质与添加的化学物质反应产物的形成。降解不包括天然构象变化，天然结构变化如静电相互作用，疏水相互作用等。
所谓术语“稳定性”理解为化学稳定性，因为不会发生生物产物的化学降解。生物制品的主要结构在用于医疗用途的容器中的存储过程中或者与用于医疗用途的容器的组成部分的接触过程中保持不变。
如本文所述，术语“污染化合物”旨在涵盖包括可提取物、可浸出物或工艺残留物的污染化合物。
可提取物是可从医用容器的组成部分中提取的化合物，如弹性体或塑料成分，其在溶剂存在下提取，特别是在严格条件下提取。可提取物可以是主要由寡聚体和不同物理和化学性质的添加剂组成的复杂混合物，并且通常以远低于生物制品的任何其他成分的浓度存在，使得难以检测它们的存在。美国食品和药物监督管理局(The American Food&DrugAdministration)(FDA)要求评价可提取物对生物制品安全性和效能的影响。
可浸出物是从用于医疗用途的容器的组成部分中浸入制剂的化合物，例如弹性体或塑料成分，特别是在实际使用条件下。可浸出物的实例包括但不限于丙烯酸，甲基丙烯酸，双丙烯酸1,6-己二醇酯和马来酸二丁酯。可浸出物对生物制品的影响可能与降解、聚集、颗粒形成和/或产品质量问题有关，例如与制剂或蛋白质反应。
所谓术语“工艺残留物”应理解为来自用于医疗用途的容器或来自可注射药物产品制造或填充工艺的化学化合物。作为工艺残留物的例子，可以列出：表面活性剂，钨，有机酸，但不限于该列表。
本发明中使用的术语“(C1-C6)烷基”是指含有1至6个碳原子的直链或支链一价饱和烃链，包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，正己基等。
本发明中使用的术语“(C2-C6)烯基”是指含有2至6个碳原子且包含至少一个双键的直链或支链一价不饱和烃链，包括但不限于乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基，己烯基等。
本发明中使用的术语“(C2-C6)炔基”是指含有2至6个碳原子且包含至少一个三键的直链或支链一价不饱和烃链，包括但不限于乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基等。
本发明中使用的术语“(C1-C6)烷氧基”是指通过氧原子与分子结合的如上定义的(C1-C6)烷基，包括但不限于甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，正己氧基等。
本发明中使用的术语“(C1-C6)烷氧基羰基”是指通过-C(＝O)-基团与分子结合的如上定义的(C1-C6)烷氧基，包括但不限于乙氧基羰基，甲氧基羰基和叔丁氧基羰基(Boc)。
本发明中使用的术语“芳基”是指芳族烃基，其优选包含6至10个碳原子并且包含一个或多个稠合环，例如苯基或萘基。有利地，它是苯基。
本发明中使用的术语“保护基”是指选择性地阻断多官能化合物中的反应性位点以允许在另一个未受保护的反应性位点上选择性地进行化学反应的化学基团。
本发明中使用的术语“O-保护基”是指在合成过程中保护式(I)化合物的羟基(OH)免于不期望的反应的取代基，例如在“Greene's Protective Groups In OrganicSynthesis”,第4版,2007,John Wiley&Sons,Hoboken,New Jersey中公开的那些O-保护基。通常，式(I)化合物的基团OX被这种保护基封端以保护羟基官能团。被O-保护基保护的羟基可以是例如醚、酯、碳酸酯、缩醛等。特别地，O-保护基可以是任选被一个或几个(特别是1-3个)卤原子(例如氯原子)取代的(C1-C6)烷基，例如甲基，乙基，叔丁基或2,2,2-三氯乙基-甲基；芳基-(C1-C6)烷基，例如苄基，芳基部分任选地被一个或几个甲氧基取代，例如苄基(Bn)或对甲氧基苄基(PMB)；式-CAr1Ar2Ar3的三苯甲基衍生物，例如三苯基甲基(也称为三苯甲基-Tr)，(4-甲氧基苯基)二苯甲基(也称为甲氧基三苯甲基-NMT)或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基(也称为二甲氧基三苯甲基-DMT)；式CH2ORGP2或CH2SRGP2(特别是CH2ORGP2)的取代甲基基团，例如甲氧基甲基(MOM)，苄氧基甲基，2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)，2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基或甲硫基甲基；式CH2CH2ORGP2或-CH2CH2SRGP2(特别是-CH2CH2ORGP2)的取代乙基基团，例如乙氧基乙基(EE)；式-SiRGP3RGP4RGP5的甲硅烷基基团，例如，三甲基甲硅烷基(TMS)，三乙基甲硅烷基(TES)，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS或TBDMS)和叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)；式CO-RGP6的羰基化基团，例如乙酰基(Ac)，新戊酰基(Piv或Pv)或苯甲酰基(Bz)或式-CO2-RGP7的羰基化基团，例如烯丙氧基羰基(Alloc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；或四氢吡喃基(THP)或四氢呋喃基；
其中Ar1、Ar2和Ar3彼此独立地表示芳基，例如苯基，其任选被一个或几个甲氧基取代；RGP2表示任选被芳基(如苯基)、(C1-C6)烷氧基(如甲氧基)或三烷基甲硅烷基(如SiMe3)取代的(C1-C6)烷基(如甲基或乙基)；RGP3、RGP4和RGP5彼此独立地表示(C1-C6)烷基或芳基(如苯基)；且RGP6和RGP7彼此独立地表示(C1-C6)烷基、(C2-C6)链烯基、芳基、芳基-(C1-C6)烷基或9-芴基甲基。
特别地，它是苄基、乙酰基或甲氧基甲基。
本发明中使用的术语“N-保护基”主要用于控制式(I)化合物的合成。为此目的，典型地用于肽化学中的所有基团，通常作为保护基团是适合的。通常，式(I)化合物的氨基X2N被这种保护基团封端，以保护胺官能团在合成过程中不发生不期望的反应。常用的N-保护基公开于“Greene's Protective Groups In Organic Synthesis”，第4版，2007，JohnWiley&Sons，Hoboken，New Jersey中。被N-保护基保护的X2N胺官能团可以是氨基甲酸酯，酰胺，磺酰胺，N-烷基衍生物，氨基缩醛衍生物，N-苄基衍生物，亚胺衍生物，烯胺衍生物或N-杂原子衍生物。特别地，N-保护基可以是甲酰基；任选被一个或几个甲氧基取代的芳基如苯基，如对甲氧基苯基(PMP)；芳基-(C1-C6)烷基，如苄基，芳基部分任选被一个或几个甲氧基取代，如苄基(Bn)，对甲氧基苄基(PMB)或3,4-二甲氧基苄基(DMPM)；CO-RGP1，如乙酰基(Ac)，新戊酰基(Piv或Pv)，苯甲酰基(Bz)或对甲氧基苄基羰基(Moz)；-CO2-RGP1，如叔丁氧基羰基(Boc)，三氯乙氧基羰基(TROC)，烯丙氧基羰基(Alloc)，苄氧基羰基(Cbz或Z)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；-SO2-RGP1，例如苯磺酰基，甲苯磺酰基(Ts或Tos)或2硝基苯磺酰基(也称为nosyl-Nos或Ns)等；
其中RGP1表示任选被一个或几个卤素原子如F或Cl取代的(C1-C6)烷基；(C2-C6)烯基，例如烯丙基；任选被一个或几个选自OMe(甲氧基)和NO2(硝基)的基团取代的芳基，如苯基；芳基-(C1-C6)烷基，例如苄基，芳基部分任选地被一个或几个甲氧基取代；或9-芴基甲基。
特别地，它可以是叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
本发明中使用的所谓术语“液相色谱法”是指使用液相色谱装置的分析技术，该装置用于分离与用于检测式(I)的降解产物和污染化合物的存在的检测器偶联的化合物。液相色谱仪可以选自HPLC(高效液相色谱)，UPLC(超效液相色谱)，UHPLC(超高效液相色谱)和RRLC(快速解析液相色谱)。检测器可以选自UV检测器、二极管阵列检测器(DAD)、质谱仪(MS)、结合质谱仪的光电二极管阵列检测器(PDA)(PDA/MS或DAD/MS)、蒸发光散射检测(ELSD)和Corona CAD检测器。
附图说明
图1是在25℃/60％相对湿度(HR)下与涂覆的和未涂覆的柱塞直接接触15或30天后AAWAA五肽的UPLC/DAD色谱图。
图2是在未涂覆的柱塞与AAWAA肽溶液之间接触30天(25℃)后检测到的(a)完整AAWAA肽(保留时间为17.2min)和(b)氧化形式的AAWAA(保留时间为17.1min)的电喷雾阳离子(ESI+)质谱。
图3是在70℃下与两种注射器成分直接接触3天后的AAHAA肽ULPC/DAD色谱图：(a)粘合剂和(b)不溶性钨，(c)是AAHAA参比物。
图4是AAMAA肽在70℃下与ThermoPlastic Elastomer(TPE)尖端帽直接接触储存3天时的降解曲线的比较。
发明内容
本发明涉及确定因与用于医疗用途的容器的组成部分接触的式(I)化合物的降解百分比的方法，包含以下连续步骤：
i)制备包含下式(I)的化合物的水溶液：
其中：
R1、R2、R4和R5各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
n和m各自彼此独立地表示0-10的整数；
R3表示-(CH2)2-COOH、-CH2-COOH、-(CH2)4-COOH、
-CH2-OH、-C(OH)-CH3、-CH2-CO-NH2、CH2-SH、-(CH2)4-NH2、
-(CH2)2-CO-NH2、-CH2-CH2-S-CH3、-(CH2)3-NH-C(NH)-NH2；
或R3表示下式(II)的基团：
其中R6、R7、R8和R9各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
r和p各自彼此独立地表示0-10的整数；
ii)在1小时至2个月的时间期限期间、在5-80℃温度下向在步骤i)制备的溶液中添加用于医疗用途的容器的组成部分；
iii)通过液相色谱法分析在步骤ii)得到的溶液；和
iv)测定降解百分比。
根据本发明的方法，与医疗用容器的组成部分的接触可以是直接的或间接的。所谓直接接触是指生物制品在没有任何中间体的情况下接触容器的组成部分。所谓间接接触是指生物制品始终不接触容器的组成部分，而是接触与所述容器的组成部分直接接触的另一种化合物/中间体。
步骤(i)
在步骤i)中制备水溶液。在步骤i)中制备的水溶液优选包含30-100％的水，更优选75-100％，甚至更优选85-100％，按质量百分比计。
根据变化形式，在步骤i)中制备的水溶液可以进一步含有赋形剂，缓冲剂，酸，碱，盐，防腐剂，增溶剂，表面活性剂，螯合剂，糖，氨基酸，肽，溶剂及其组合。
在步骤i)中制备的水溶液优选包含至少5μg/ml的式(I)化合物，更优选至少15μg/ml。在步骤i)中使用的式(I)化合物的量取决于在步骤iii)中使用的检测器仪器的灵敏度，在步骤i)中通常使用45μg/ml以检测合成的肽降解产物。
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中X＝H。
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中n＝1，且m＝1。
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中R1、R2、R4和R5各自表示CH3，且X＝H，n＝1，且m＝1。
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中R1、R2、R4和R5各自表示CH3，且X＝H，n＝1，m＝1，且R3是如下之一：
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中R1、R2、R4和R5各自表示CH3，且X＝H，n＝1，m＝1，且R3是如下之一：
-CH2-CH2-S-CH3(Met)、-(CH2)3-NH-C(NH)-NH2(Arg)、-(CH2)4-NH2(Lys)、-CH2-CO-NH2(Asn)、-CH2-COOH(Asp)、CH2-CH2-CO-NH2(Gln)、-(CH2)2-COOH(glu)。
在本发明的一个优选的实施方案中，在步骤i)使用的化合物具有如上述所定义的式(I)，其中R1、R2、R4和R5各自表示CH3，且X＝H，n＝1，m＝1，且R3是如下之一：-CH2-CH2-S-CH3、
步骤(ii)
在步骤ii)期间，将用于医疗用途的容器的组成部分在1小时至2个月的时间段内，在5至80℃的温度下加入到在步骤i)制备的溶液中。
优选地，步骤ii)在部分搅拌下和/或进入气候室中进行。
优选地，用于医疗用途的容器的组成部分是注射器、可预装注射器、可预装注射器的组成部分、预装注射器或预装注射器的组成部分(参见上文的定义)。
优选地，用于医疗用途的容器的组成部分是药筒、尖端帽、帽、针头或柱塞，所有这些均来自注射器、可预装注射器或预装注射器。
优选地，用于医疗用途的容器的组成部分是玻璃，橡胶，钨或其衍生物，粘合剂，硅油，塑料或金属(铝，硼，硅，镁，锌，铬)。
步骤ii)的优选持续时间为4小时至2个月。最优选地，步骤ii)的持续时间为7天至45天。
根据本发明的方法的步骤ii)的温度优选为10至80℃，更优选15至75℃，甚至更优选18至70℃，甚至更优选18℃至30℃。根据本发明的方法的步骤ii)的温度优选为25℃、45℃或70℃。
步骤(iii)
在步骤iii)，通过液相色谱法分析在步骤ii)得到的溶液。
优选的色谱法是超效液相色谱法(UPLC)。优选的检测器选自质谱仪(MS)、光电二极管阵列检测器(PDA)和合并质谱仪(PDA/MS)的光电二极管阵列检测器。优选地，液相色谱法是UPLC、液相色谱法/合并质谱仪的光电二极管阵列检测器。
获得PDA色谱图以便能够评价合成的模拟肽(式(I)化合物)的降解产率并检测相关的降解产物。获得MS谱以便能够鉴定式(I)化合物的降解产物。
步骤(iv)
步骤iv)在于测定式(I)化合物的降解百分比。
步骤(v)
本发明的方法还可以包含在步骤iv)之后，使用步骤v)质谱法的测量，以及步骤vi)鉴定化学降解(如氧化或脱氨)。如果式(I)化合物与生物制品中存在的污染产物或任何化合物共洗脱，MS检测器也可以用于确定式(I)化合物的降解百分比。
在本说明书中，包括所附权利要求，除非另有说明，否则百分比均以质量计。
提供以下本发明的实施例，且仅在于示例性和非限制性目的。
具体实施方案
材料：
AAXAA五肽由GeneCust(Luxembourg)合成，纯度>99％。PBS(磷酸缓冲盐水)和醋酸铵缓冲液购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。所有其他试剂均为分析级。
涂层是指ETFE(乙烯-四氟乙烯)。
肽n°1具有下式：Ala-Ala-Trp-Ala-Ala(AAWAA)
肽n°2具有下式：Ala-Ala-His-Ala-Ala(AAHAA)
肽n°3具有下式：Ala-Ala-Met-Ala-Ala(AAMAA)
所使用的容器的组成部分是来自不同橡胶制造商(例如Becton Dickinson,AptarStelmi,West,Sumitomo)的柱塞和TPE尖端盖，用于粘合针头和不溶性钨的粘合剂，形成工艺残留物潜在的尖端。
仪器：
所用的液相色谱仪来自Waters。
通过LC/DAD/MS与来自Waters的Quattro premier XE质谱仪分析肽溶液。
所用软件为Mass Lynx。
实施例1：使用模拟肽n°1的柱塞的测试
将肽AAWAA溶于乙酸铵pH4缓冲液(20mM)+0.02％吐温80中至终浓度为45μg/ml。将获得的AAWAA肽溶液在25℃/60％RH下与未涂覆和ETFE涂覆的柱塞直接接触储存30天。
结果如图1和2中所示。
图1是AAWAA五肽与涂覆的和未涂覆的柱塞直接接触在25℃/60％RH下储存15天(c，d)和30天(a，b)后的UPLC/DAD色谱图。色谱图e和f是AAWAA溶液参比物(不与柱塞有任何直接接触)
图2是未涂覆的柱塞与AAWAA肽溶液之间接触30天(25℃)后检测到的(a)完整AAWAA肽(保留时间为17.2min)和(b)氧化形式的AAWAA(保留时间为17.1min)的电喷雾阳离子(ESI+)质谱。
如在图1(a和b)上所观察代的，当肽与未涂覆的柱塞直接接触时，AAWAA的降解产率更为重要。在图1b上观察到AAWAA降解产物。当与未涂覆的塞直接接触储存时，AAWAA的较高降解产率突显了W氨基酸与可浸出物相互作用的较高风险。
实施例2：粘合剂和钨残留物与模拟肽n°2在高温和短时间期限下的测试
将AAHAA肽溶于乙酸铵pH4缓冲液(20mM)+0.02％吐温80中至终浓度为45μg/ml。将AAHAA肽溶液与用于将针头连在注射器上的粘合剂和不溶性钨(一种潜在的工艺残留物)储存在70℃下直接接触3天。
结果如图3中所示。
图3是在70℃下与两种注射器成分直接接触3天后的AAHAA肽ULPC/DAD色谱图：(a)粘合剂和(b)不溶性钨。(c)是色谱图参比物。
如在图3上观察到的，在70℃下3天后，AAHAA肽与不溶性钨反应。
实施例3：尖端帽与模拟肽n°3在高温和短时间期限下的测试
将AAMAA肽溶液溶于PBS pH7缓冲液(20mM)+吐温80(0.02％)中至终浓度为45μg/ml。将AAMAA肽溶液与TPE尖端帽部分直接接触储存，在70℃下保持3天。

Claims (11)

1.确定式(I)化合物因接触用于医疗用途的容器的组成部分的降解百分比的方法，包含以下连续步骤：
i)制备包含下式(I)的化合物的水溶液：
其中：
R1、R2、R4和R5各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
n和m各自彼此独立地表示0-10的整数；
R3表示-(CH2)2-COOH、-CH2-COOH、-(CH2)4-COOH、
-CH2-OH、-C(OH)-CH3、-CH2-CO-NH2、CH2-SH、-(CH2)4-NH2、
-(CH2)2-CO-NH2、-CH2-CH2-S-CH3、-(CH2)3-NH-C(NH)-NH2；
或R3表示下式(II)的基团：
其中R6、R7、R8和R9各自彼此独立地表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基或(C2-C6)炔基；
X表示H或基团(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基羰基、芳基或保护基；
r和p各自彼此独立地表示0-10的整数；
ii)在1小时至2个月的时间期限期间、在5-80℃温度下向在步骤i)制备的溶液中添加用于医疗用途的容器的组成部分；
iii)通过液相色谱法分析在步骤ii)得到的溶液；和
iv)测定降解百分比。
2.权利要求1的方法，还包含在步骤iv)后，使用质谱法的测量步骤v)和化学降解如氧化或脱氨的鉴定步骤vi)。
3.上述权利要求任一项的方法，其中R1、R2、R4和R5各自表示CH3，且X＝H，n＝1，且m＝1。
4.上述权利要求任一项的方法，其中在步骤i)制备的水溶液包含30-100％的水，按质量百分比计。
5.上述权利要求任一项的方法，其中在步骤i)制备的水溶液还包含赋形剂、缓冲剂、酸、碱、盐、防腐剂、增溶剂、表面活性剂、螯合剂、糖、氨基酸、肽、溶剂及其组合。
6.上述权利要求任一项的方法，其中在步骤i)制备的水溶液包含至少5μg/ml的式(I)的化合物。
7.上述权利要求任一项的方法，其中用于医疗用途的容器的组成部分是注射器、可预装注射器、可预装注射器的组成部分、预装注射器或预装注射器的组成部分。
8.上述权利要求任一项的方法，其中用于医疗用途的容器的组成部分是桶、尖端帽、帽、针头或柱塞，所有这些均来自注射器、可预装注射器或预装注射器。
9.上述权利要求任一项的方法，其中用于医疗用途的容器的组成部分是玻璃、橡胶、钨或其衍生物、粘合剂、硅油、塑料、金属或(铝，硼，硅，镁，锌，铬)。
10.上述权利要求任一项的方法，其中步骤ii)的期限为4小时至2个月，优选7天至45天。
11.上述权利要求任一项的方法，其中步骤ii)的温度为15-75℃，优选18-70℃。
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