CN110121643A - 用于流式细胞仪的光学检测系统、流式细胞仪系统及其使用方法 - Google Patents

Abstract

一种光学引擎，用于台式流式细胞仪，该光学引擎具有一组激光器，每个激光器沿x轴水平聚焦到相同的水平位置，沿流动池的相同激发平面沿y轴垂直聚焦到不同的垂直位置，一组光学器件，根据激发荧光的不同激光，将相同波长范围的荧光分离到收集光学器件的焦平面中的不同位置；以及检测器，选择性地从不同的位置检测光，从而根据不同的激光器激发在相同波长范围内发射的荧光之间的区分。

Description

用于流式细胞仪的光学检测系统、流式细胞仪系统及其使用 方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2016年7月15日提交的美国临时专利申请序列号62/363,032的优先权；其全部内容通过引用并入本申请中。

技术领域

本发明涉及流式细胞仪，更具体地涉及一种光学检测系统，其收集包括来自流动通道中不同垂直位置的荧光的光，并根据波长范围和垂直位置将收集的荧光分离成多个不同的检测通道用于选择性检测。

背景技术

流式细胞仪是一种基于激光的生物物理技术，其中与细胞偶联的荧光分子通过流动池并由一组激光激发。收集荧光并将其分离成具有特定检测波长的不同通道，转换成电信号，并使用计算机进行分析。通过用不同的荧光团标记细胞，可以解析各种不同的细胞群。例如，多色流式细胞仪，例如三色流式细胞仪，使用具有不同激发和/或发射波长的荧光团来区分生物样品中的各种细胞亚群。

在操作上，通过光束整形、转向和引导光学部件将激发光传递到流动池。使荧光标记的细胞或颗粒通过流动池衍射光并激发标记产生荧光。使用位于相对于彼此和相对于流动池的精确位置的多个透镜的复杂设计来收集来自颗粒的荧光和衍射光。然后根据特定的激发激光器并根据光波长将收集的光分成不同的通道。

在一种方法中，使用不同的光纤电缆来收集从不同激光源激发的荧光/散射光。然后来自每根光纤电缆的光被分成不同的荧光通道。或者，特殊设计的物镜用于在粒子穿过不同的激光源时收集来自粒子的光，并且根据不同的二向色镜根据产生光并分成不同的通道的激光源将光分离成不同的光束。

所有这些收集光学器件制造昂贵，难以对准并且难以调节。而且，对于许多情况，光收集效率是有限的。此外，通常用光电倍增管(PMT)检测和测量所收集的分光。虽然PMT广泛用于流式细胞术应用和其他光学测量情况，但它们昂贵、体积庞大且使用复杂。因此，需要改进的收集光学器件，其设计简单，具有较少的光学元件，具有高的光收集效率，并且具有光检测/测量灵敏度/效率。

发明内容

本发明解决了流式细胞仪设计和技术方法的上述缺陷。在本发明的一个方面，提供了一种用于流式细胞仪的光学引擎，该光学引擎包括：一组激光器，每个激光器被调谐到适合于激发荧光分子的波长，其中来自每个激光器的光沿x轴水平地聚焦至一相同的水平位置并沿相同的激发平面沿y轴垂直地聚焦至不同的垂直位置，其中沿激发平面的相同水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交；一组光学器件，包括用于收集从流动池发射的荧光的收集光学器件，和过滤光学器件，其将收集的荧光从流动池过滤到不同的波长范围，其中该组光学器件将相同波长范围的荧光进一步分离到根据激发荧光的不同激光器的聚光光学器件的焦平面上的不同位置；以及检测器，选择性地检测来自不同位置的光，从而区分由在激光器组内的不同激光器激发的相同波长范围内发射的荧光，并将光转换成电信号。对于本申请，每个激光器的光传播方向限定为Z轴，其垂直于水平x轴和垂直y轴。

光学引擎允许使用任何数量的激光器，但是在一些实施例中具有至少两个激光器，例如，两个、三个、四个或五个激光器，每个激光器被调谐到不同的波长。在优选实施例中，所有激光器沿垂直方向垂直聚焦到流动池的不同垂直位置。在一个实施例中，光学引擎包括多个激光器，每个激光器发射适合于激发荧光分子的特定波长的光；用于每个激光器的一组光束整形光学器件，其中每组包括两个透镜，用于沿x轴水平地将光可调节地聚焦到相同的水平位置，并且沿着相同的激发平面沿y轴垂直地聚焦到不同的垂直位置，其中激发平面上的水平位置通过流式细胞仪的流动池的流动路径。在优选实施例中，一组光束整形光学器件包括一组柱面透镜(例如，x轴柱面透镜和y轴柱面透镜)或一组鲍威尔棱镜(例如x轴鲍威尔棱镜和y轴鲍威尔棱镜)。在另一个实施例中，光学引擎包括多个激光器，每个激光器发射适合于激发荧光分子的特定波长的光；所有激光器的光束均可沿x轴水平独立可调节以及沿y轴垂直独立可调节，通过适当放置的二向色镜组合在一起，并通过单个消色光束整形光学元件，使所有激光束聚焦到相同的水平位置和沿相同激发平面的不同的垂直位置聚焦，其中激发平面上的水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交。该实施例不同于所描述的每个激光器具有其自己的光束整形光学器件的示例。

在其他实施例中，光学引擎包括多个激光器，每个激光器发射适合于激发荧光分子的特定波长的光。采用与上述两个实施例不同的光学设计方法，使得所有激光束聚焦到相同的水平位置和沿相同的激发平面的不同的垂直位置，其中激发平面上的水平位置通过流式细胞仪的流动池的流动路径。

激发平面上的聚焦激光束应具有适合流式细胞仪应用的光束尺寸。通常，激发平面处的垂直光束宽度可以从大约2微米到大约20微米变化。在一个实施例中，垂直光束宽度在2到5微米之间。在另一个实施例中，垂直光束宽度在5到20微米之间。优选地，垂直光束宽度在5到15微米之间。通常，水平光束宽度可以从大约20微米到大约200微米变化。在一个实施例中，水平光束宽度在20到50微米之间。在另一个实施例中，水平光束宽度在50到200微米之间。优选地，水平光束宽度在50到100微米之间。

将多个激光器(例如，2个激光器、3个激光器、4个激光器、5个激光器或更多个)中的每一个沿着样品的流动方向分别垂直聚焦在不同的垂直位置，允许通过不同的光电检测器区分由多个激光器的每一个激发的荧光，因为三个不同激光器沿垂直轴的空间分离转换为粒子在通过不同激光器中的每个时发出的荧光的时间和位置差异。特别设计的收集光学器件不仅收集来自流动池的不同垂直位置的光，而且当光传播通过过滤光学器件时还允许来自不同垂直位置的光的进一步分离。具有诸如二向色镜、带通滤光器和/或其他类型的滤光器或透镜的光学部件的过滤光学器件可以将来自流动池的荧光和光过滤到不同的波长范围内。因此，在收集光学器件的焦平面处沿着垂直轴在空间上分离这些波长范围中的每一个的光，从而允许在检测期间根据其始发激光器来区分相同波长范围内的荧光分量。在一些实施例中，聚焦光束沿流动池中的激发平面的相邻垂直位置之间的垂直间隔在60至200μm之间。在其他实施例中，流动池中聚焦光束的相邻垂直位置之间的垂直间隔在60至100μm之间。在又一个实施例中，流动池中聚焦光束的相邻垂直位置之间的垂直间隔约为80μm。收集光学器件能够放大这种间隔距离以实现在收集光学器件的焦平面处的相邻垂直位置之间大约一两(a couple)毫米(例如，在1.5到2.5毫米之间的值)或大约几(a few)毫米(例如大约3毫米、大约3.5毫米、大约4毫米或者大约5毫米)的空间间隔(这里的每个垂直位置对应于由一个相应的激光器激发的粒子发出的荧光光束)。在收集光学器件的焦平面处的相邻光束的空间分离允许荧光信号通过波长范围和使用光学检测器的始发激光器来区分。

在一些实施例中，光学检测器沿着收集光学器件的焦平面放置在相应的垂直位置，其中每个检测器检测由一个相应的激光器激发的粒子发出的荧光光束。这种光学检测器可以以检测器阵列的形式布置。在其他实施例中，光学检测器放置在离收集光学器件的焦平面一定距离处，其中每个检测器检测由一个相应激光器激发的粒子发出的荧光光束。在其他实施例中，光学检测器放置在离收集光学器件的焦平面一定距离处，并且透镜沿着焦平面和光学检测器之间的光学路径定位，其中每个检测器检测由一个相应的激光器激发的粒子发出的荧光光束。这种透镜可以用于扩展来自焦平面的光束并提供相对均匀的光束分布。

在优选实施例中，收集光学器件包括半球透镜，后面是两组双合透镜。优选地，半球透镜由具有高折射率的材料制成。优选地，两组双合透镜的组合不仅允许从流动池中的不同垂直位置收集光，而且还允许在光穿过过滤光学器件之后将这种光进一步聚焦到具有更大的毫米间隔距离的焦平面。过滤光学器件可包括长通和/或短通分色镜、带通滤光器和其他滤光器和/或透镜。在一些实施例中，过滤光学器件将收集的荧光(例如，使用半球透镜和两组双合透镜)过滤到不同的波长范围，其特征在于以下波长780/60nm、615/24nm、530/30nm(或530/43nm)、445/45nm、586/20nm(或572/28nm)、661/20、697/58nm(或695/40nm)和725/40nm。请注意，所有波长都以nm为单位。这里引用的通道波长仅用于示例性目的，并不意图限制本发明。

可以使用各种方法来区分在收集光学器件的焦平面处具有mm范围分离的光点。在一个实施例中，这些光点被分离并聚焦成较小的尺寸，然后耦合到一束光纤电缆中。光纤电缆末端的光可以由光检测器检测，例如光子倍增管(PMT)、硅倍增器或多像素光子计数器(MPPC)或光电二极管。在另一个实施例中，在收集光学器件的焦平面处的这种光点由线性MPPC阵列直接检测，该线性MPPC阵列包括多个MPPC芯片，其中每个芯片检测相应的光点。在又一个实施例中，这些光点通过另外的光学元件进一步分离到相邻光点之间甚至更大的空间距离，以通过多个光电检测器(例如多个MPPC检测器，或多个光电二极管，或多个雪崩光电二极管，或多个PMT)检测或测量。在示例性实施例中，采用4个激光器作为激发源，在流动池中相邻的垂直聚焦光束之间具有80微米的垂直间隔。在收集光学器件的焦平面处的相邻光点之间的垂直间隔距离约为一两(a couple of)毫米(例如1.5-2.5毫米)或几(a few)毫米(例如，3-5毫米)。然后通过棱镜反射器进一步分离两个中间光点，每个光点由MPPC检测器检测。特别地，两个侧光点由安装在相应位置的两个MPPC检测器直接检测。

在本发明的光学引擎的其他实施例中，也可以采用与上述收集光学器件和过滤光学器件不同的其他方法来收集、分隔和分离来自流过流动池的颗粒的荧光和散射光。在一个实施例中，通过光束整形、转向和引导光学部件将不同波长的激发激光束传递并聚焦到流动池。所有聚焦的激光束共享共同的水平位置，并且在流动池中具有不同的垂直位置，其中流动通道沿垂直方向放置。使荧光标记的细胞或颗粒通过流动池衍射光并激发标记产生荧光。使用位于相对于彼此和相对于流动池的精确位置的多个透镜的复杂设计来收集来自颗粒的荧光和衍射光。然后根据特定的激发激光器并根据光波长将收集的光分成不同的通道。

在一种光收集和分离方法中，使用不同的光纤电缆来收集从不同激光源激发的荧光/散射光。然后，通过使用不同的二向色镜和带通过滤器，来自每根光纤电缆的光被分成不同的荧光通道。在另一种方法中，特殊设计的物镜用于在粒子穿过不同的激光源时收集来自粒子的光，并且根据产生光的激光源将光分离成不同的光束。然后，根据不同的二向色镜和带通过滤器的使用，将源自一个激光源的每个分离的光束分离成不同的通道。

为每个荧光通道提供本发明的用于光检测的检测器(散射光或荧光)，其优选为MPPC检测器的形式。优选地，通过MPPC将荧光信号转换为模拟电流信号，然后通过使用电阻器将其转换为模拟电压信号。仍优选地，然后使用模数转换器(ADC)将模拟电压信号转换为数字信号，并以数字形式处理以提高精度和速度。在优选实施例中，来自ADC的每个数字输出数据通过将数据除以相应的校准因子来校正或校准，该校准因子使用下面的说明书部分中描述的技术确定。优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约半个(0.5)十进位(decade)。更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约一个(1)十进位。甚至更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约一个半(1.5)十进位。甚至更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约二个(2)十进位。

在本发明的另一个实施例中，提供了一种用于台式流式细胞仪的光学引擎，其包括激光器，调谐到适合于激发荧光分子的波长，其中来自激光器的光沿激发平面沿x轴水平地聚焦至一水平位置并沿y轴垂直地聚焦至一垂直位置，其中沿激发平面的水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交；一组光学器件，包括用于收集从流动池发射的荧光的收集光学器件和将收集的荧光从流动池过滤到不同的波长范围的过滤光学器件，从而提供不同的荧光通道；以及每个荧光通道上的MPPC检测器，用于检测荧光并将光转换为电信号。在优选发实施例中，光学引擎还包括一组激光器，其中每个激光器沿着y轴垂直聚焦到沿着相同激发平面的不同垂直位置，此外，该组光学器件将发射的荧光从流动池分离到不同的荧光通道，其中每个通道的特征在于不同的波长范围和激发荧光的不同激光器。

在上述光学引擎的优选实施例中，MPPC以高于3个十进位的线性动态范围操作。更优选地，MPPC以高于4个十进位的线性动态范围操作。

在上述光学引擎的一些实施例中，根据校准因子校正MPPC数字输出值。优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过半个十进位。更优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过一个十进位。甚至更优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过一个半十进位。更进一步优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过两个十进位。

在优选的实施例中，流动池的前向散射(FSC)特征包括FSC检测器、用于收集FSC光的FSC聚焦透镜，以及阻挡入射激光束进入FSC聚焦透镜和FSC检测器的遮蔽条。荧光检测器处的荧光信号的定时与FSC检测器处的前向散射信号的定时之间的关系提供了用于确定哪个激光器在检测通道中诱导激发检测到的荧光信号的方法。

通过使用改进的遮蔽条已经实现了前向散射(FSC)检测的进一步改进。在优选实施例中，提供了菱形遮蔽条。在另一个实施例中，提供了矩形形状并且其水平尺寸与其垂直尺寸相同或更长的遮蔽条，用于阻挡入射激光束。在又一个实施例中，遮蔽条的周边遵循用于阻挡入射激光束的光强度分布图的轮廓。在又一个实施例中，遮蔽条遵循0.1％轮廓线内的光强度分布图的轮廓。0.1％轮廓线或边界对应于轮廓上每个点处的光强度为入射光的最大光强度的0.1％处的线。确定遵循在0.1％轮廓内的光强度分布图的轮廓的遮蔽条，以阻挡来自FSC检测器的99％的未散射光束。因此，本发明还提供一种通常为菱形的遮蔽条，其遵循0.1％、0.2％的光强度分布图的轮廓。0.5％、1.0％或2.0％轮廓线及其成形方法。

光学引擎的组件优选地被容纳为单个单元，并且这些光学组件中的一些可以移除和互换,用其他组件修改。为此，还提供了一种用于容纳光学引擎组件的外壳。所述外壳包括光学引擎组件，例如激光器组，用于将激光束聚焦到激发平面的光学器件，收集光学器件，过滤光学器件，光电检测器或光检测器，其他过滤器(和/或透镜)，以及作为用于从光电检测器或光检测器到电路的电连接的电接口，所述电接口将连接到外部微处理器或远程计算机。在一些实施例中，每个激光器具有相应的一组光束整形光学器件，其中来自每个激光器的光沿x轴水平聚焦到相同的水平位置并且沿y轴垂直聚焦到沿相同激发平面的不同垂直位置，其中沿着激发平面的相同水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交。在其他实施例中，所有激光束可沿x轴水平独立可调且可沿y轴垂直独立可调，所有激光束通过适当放置的二向色镜组合在一起，并通过共同的消色差光束整形光学器件，以便所有激光束聚焦到相同的水平位置和聚焦到沿相同的激发平面的不同的垂直位置，其中激发平面上的水平位置通过流式细胞仪的流动池的流动路径。优选地，同一外壳内的组件配置用于不同激光器、聚焦透镜、长通和短通分色镜、过滤器、针孔通道和检测器的可互换性。这是通过标准化接合特征(例如将对准孔、按扣、螺钉或其他紧固件定位在不同的部件上以便互换)以及通过为每个激光器单独提供一组光束整形光学器件来实现的。优选地，光电检测器或光检测器是MPPC检测器。在一些实施例中，流动通道安装在外壳中并配置成用于耦合到流式细胞仪装置，用于通过管连接器对包括颗粒(例如珠子或细胞)的样品进行流体动力聚焦。

在相关的实施例中，本发明还包括流式细胞仪，其包括本文公开的任何光学引擎；流动通道；与抽吸针流体连通的泵，用于通过流动通道抽吸和输送细胞悬浮液。在优选实施例中，流式细胞仪的特征还在于有两(2)、或三(3)、或四(4)或五(5)个激光器，每个激光器调谐到不同的波长并聚焦到流动池的不同的垂直位置；一组光学器件，包括收集和过滤光学器件，用于收集和过滤来自流动池的光；并且该组光学器件在空间上区分和分离在相同波长范围内的过滤荧光，所述过滤荧光由两个、三个、四个或五个不同激光器中的每一个激发到沿着收集光学器件的焦平面的不同垂直位置。

在优选实施例中，流式细胞仪的特征还在于，存在四个激光器，每个激光器调谐到不同的波长并聚焦到流动池的不同垂直位置(即，流动池中的总共四个垂直位置)；用于收集来自流动池的光的收集光学器件和用于过滤光的过滤光学器件；并且其中收集光学器件和过滤光学器件基于聚焦激发光束至收集光学器件的焦平面中的不同垂直位置的垂直位置在空间上区分和/或分离过滤荧光(即，焦平面中的四个不同的垂直位置)。在这样的平面上的光点可选地进一步由许多MPPC检测器或MPPC阵列分离和检测。为此，提供了一种流式细胞仪装置，除了侧向散射和前向散射测量之外，其还包括多达25个荧光颜色通道，用于通过流动池的颗粒或细胞。

在相关的实施例中，开发了流式细胞分析系统，其包括本文提供的流式细胞仪；以及用于在计算机中加载和执行以获取和分析流式细胞仪数据的软件。因此，还开发了用于在计算机中加载的流式细胞仪软件。在一些实施例中，软件提供编程以执行以下功能：从每个检测器的荧光通道收集数据，其中由不同检测器收集的荧光信号被转换成不同的数据系列，对应于在不同垂直位置由激光激发的荧光；生成显示所获取数据的各种图的图形用户界面(GUI)，其中GUI还包括与比较图相邻的补偿滚动条，以调整一个或多个通道之间的光谱重叠的补偿；从细胞仪获取数据并将数据作为数据文件保存到计算机硬盘驱动器中。该软件还包括门控功能，允许用户从数据图中选择一个子群，并为选定的子群生成其他图。对于所有荧光通道数据以及侧向散射和前向散射数据，可以重复执行该过程。

在另一个相关的实施例中，提供了流细胞计数法，其包括提供本文提供的流式细胞分析系统；用多个荧光标记标记细胞悬浮液；将细胞样品泵入流动池；收集流式细胞仪数据；分析流式细胞仪数据以确定样品细胞上或细胞中多个荧光标记中的一个或多个的存在、不存在或丰度。

附图说明

图1是提供通过光学引擎100输送细胞悬浮液的概览的示意图。

图2是示出示例性光学引擎100的表示的顶视图。

图3是表示沿Z轴沿三个光路P1-3传播激光的示意俯视图；其中水平X轴垂直于包括3激光激发源的光学照射系统的激光传播方向(即Z轴)。还示出了遮挡条180阻挡来自路径P2的未散射光。

图4是示出流动池130的放大视图的示意图，示出了用于三个光路P1-P3的公共水平焦点位置H和每个路径P1、P2、P3的不同垂直聚焦位置Vv、Vb、Vr。

图5是显示将来自流动池中的流动通道的收集光分成六个不同的荧光波长范围加上一个侧向散射通道(SSC)的示意图。使用本发明的装置和方法，六个荧光波长范围可以对应于13个荧光颜色通道。

图6A示出通过收集光学器件152、154收集的来自相同的流动池130的四个不同的垂直位置(Vv、Vr、Vg、Vb)的荧光，通过分光模块142行进，由带通过滤器144过滤，聚焦在收集光学器件152、154的焦平面200和在具有检测器162-165的检测模块161内检测。

图6B是示出用于检测由透镜192(193、194或195)加宽的四个荧光光束的配置的示意图，用于在检测器162(163、164或165)处进行检测。

图7A示出了来自尺寸为1.5mm×1.5mm的MPPC检测器的数字输出对入射光的功率水平的依赖性。图7B示出了来自具有与图7A中使用的电阻器不同的电阻器的另一MPPC检测器的数字输出的依赖性(电阻器用于将MPPC输出电流转换为电压)。图7C示出了MPPC数字输出与图7B中的1.1mm的光束尺寸的入射光强度的线性回归拟合。

图8示出了转换来自MPPC的电子模拟电压信号后数字输出对入射光的功率水平的依赖性。MPPC尺寸为3mm×3mm。

图9示出了对于波长范围在515-545nm之间的入射光束，在特定操作偏压和室温下针对尺寸为3mm×3mm的MPPC确定的校准因子与MPPC数字输出的关系图。

图10示出了具有MPPC的暗计数噪声的直方图，MPPC不接受任何外部光线，左侧面板处于室温且右侧面板处于降低的温度。

图11示出了在530/43nm的荧光通道处检测到的6-pk珠子的初步数据，通过蓝色激光激发，通过MPPC检测器检测，左侧面板处于室温下，右侧面板处于降低的温度。

具体实施方式

本发明提供了一种流式细胞仪及其光学引擎，其可通过可互换的激光器、光学配置和检测器单独地配置和扩展，所述可互换的激光器、光学配置和检测器提供多个参数的测量，所述参数包括单个样品中的许多单个颗粒的大量颜色荧光通道。光学引擎内的组件的可互换性允许用户根据个别需要根据独特的实验条件定制激发和检测通道。这允许用户在同一流式细胞仪内添加或替换组件，同时保持高检测灵敏度和解析度。通过结合具有高光子-电子转换效率的多像素光子计数器(MPPC)，可以进一步提高检测灵敏度和解析度，同时克服了MPPC设备的缺点，即更大的暗计数和更大的背景噪声和更窄动态范围。

流式细胞仪包括光学引擎，其在本文的各种非限制性实施例中描述；流动通道；与抽吸针流体连通的泵，用于通过流动通道抽吸和输送细胞悬浮液。显示出泵流体可重复地通过流动通道以高速递送细胞，以可再现地进行超过数千事件/秒的样品采集速率。此外，利用美国专利9,575,063和US 2016/0097707中提供的附加自动进样器、可选振动器和样品收集方法，其中每个都通过引用整体并入本文，这些速率可以与自动进样至抽吸针同时实现。此外，对流式细胞仪编程具有的功能包括抽吸针的自动清洗，以减少样品携带和交叉污染的可能性。

在优选实施例中，流式细胞仪内的光学引擎的特征还在于具有一组激光器，例如从单激光器到多激光器(例如，2或3或4或5，或甚至更多)，每个激光器被调谐到适合激发荧光分子的不同的波长。在一些实施例中，通过为每个激光器提供一组光束整形光学器件来实现将多个激光束中的每一个改进地聚焦到沿着流动池的不同位置，其中每组优选地包括两个透镜以可调节地沿着x轴水平地将光聚焦到相同的水平位置并且沿着相同的激发平面沿着y轴垂直地聚焦到不同的垂直位置，该平面的特征为在通过流式细胞仪的流动池的流动路径内。对于这里描述的光束整形光学器件，激光传播方向定义为Z轴，其垂直于水平x轴和垂直y轴。光束整形光学器件优选地包括柱面透镜，使得聚焦光束位于流动池中的中心线处并且具有椭圆形状。通过将光束整形光学器件分配给每个激光器，每个激光器可以精确地聚焦到流动池的不同垂直位置，从而消除了与需要在激光器之间共享光束整形、转向和引导光学器件的配置相关联的权衡，如在商业上可获得的系统中通常提供的那样。

在相关实施例中，多个激光器共享某些光束整形光学器件，同时，每个单独的激光器可以沿同一平面聚焦和转向或引导到不同的垂直位置。光学设计领域的技术人员可以在此引导下开发这种光学照明系统。

在优选实施例中，提供一组光学器件，其包括收集来自流动池的粒子散射光和荧光的收集光学器件和将从流动池发射的收集的荧光(由收集光学器件收集)过滤成不同的波长范围的过滤光学器件，其中该组光学器件根据激发荧光的激光器进一步将相同波长范围的荧光分离成不同的位置；和检测来自各个不同的位置的光的检测器，每个由一个单独的激光器激发，从而区分激光器组内不同激光器的相同波长范围内发射的荧光并将光转换成电信号。

值得注意的是，收集光学器件和过滤光学器件不仅收集来自流动池的粒子散射光和荧光，而且还将从流动池收集的荧光过滤到不同的波长范围。此外，采集光学器件和过滤光学器件利用沿着流动池(也称为激发平面内)的用于不同激光器的分离激光焦点，允许将由不同激光器激发的相同波长范围的荧光信号分离成使用检测器来检测和测量由每个不同激光器激发的荧光的不同位置。

可以用各种光学检测器检测荧光信号和散射信号。将激光聚焦在沿着流动池的不同位置以进行激发，允许比较不同波长的每个检测器的荧光信号的时序和前向散射信号，这有助于将光信号(散射光、前向散射和侧向散射，以及不同波长的荧光信号并由不同的激光激发)构建成对应于通过流动池中的激发平面的单个细胞或颗粒的数据集。注意，数据集是从通过将光转换成电子信号的光检测器获得的模拟电子信号转换的数字信号。

例如，对于具有红色、蓝色和紫色激光的3激光系统，激光束沿流动池聚焦到3个不同的垂直位置，从较低位置计数到较高位置，排序为红色，然后是蓝色，然后紫色。考虑用许多不同的荧光染料标记颗粒，其中两种荧光染料被紫色激光激发，发射～450nm和～780nm的光，两种荧光染料被蓝光激发激发，发射～530nm和～780nm的光，一种荧光染料被红色激光激发，发射～780nm范围的光。当粒子穿过这3个激光束时，由红色激光激发诱导的～780nm的荧光将在～780nm处的荧光和由蓝色激光诱导的～530nm的荧光前方，然后是由紫色激光诱导的～780nm和～450nm的荧光。假设对于通过蓝色激光束的粒子检测前向散射，粒子的前向散射的时序将与蓝色激光诱导的～780nm和～530nm的荧光一致。类似地，假设对于通过蓝色激光束的粒子检测侧向散射，粒子的侧向散射的时序将与蓝色激光诱导的～780nm和～530nm的荧光一致。注意，收集光学器件将收集由三个激光器激发的不同波长范围(即～450nm，～530nm和～780nm范围)的侧向散射和所有荧光。过滤光学器件将收集的荧光分成波长约为450nm的光，波长约为530nm的光和波长约为780nm的光。然后放置光检测器以分别检测450nm和530nm的荧光。此外，利用收集光学器件和过滤光学器件，波长约为780nm的过滤光将根据激发荧光的激光被分离成三个不同的位置。然后可以使用三个不同的检测器，以便每个检测器检测由一个激光器激发的荧光(在～780nm范围内)。在一个示例性实施例中，这些不同的位置在收集光学器件的焦平面内相隔几(a coupe)毫米到几(afew)毫米(因为荧光是从流动池收集的，并且被过滤并向下聚焦到收集光学器件的焦平面上)。在另一个实施例中，分开几毫米的荧光可以进一步分隔开甚至更大的距离，例如相隔5-10或10-20毫米。

在上面的例子中，光学检测器可以检测前向散射、侧向散射以及450nm范围内的荧光(由紫色激光激发)、530nm范围内的荧光(由蓝色激光激发)以及780nm范围内的三种不同荧光，分别由红色激光，蓝色激光和紫色激光激发。信号处理方法和算法将从每个检测器获得的信号分配并组合成属于单个细胞或粒子的数据集。

流式细胞仪优选地作为流式细胞分析系统的一部分提供，其包括用于获取和分析流式细胞仪数据的计算机软件。流式细胞仪软件可操作地将流式细胞仪传送到计算机并提供各种易于使用的特征。其中包括位于显示数据图上相应荧光通道附近的可滑动补偿滚动条，易于使用的实验管理器，以及显示门控群(gated populations)和相应计数的改进的实验室报告。

优选的流式细胞分析系统包括可配置的检测荧光通道；1至5或6个激光器；优化的检测器条件，自动流体维护功能；注射泵取样流体系统；新颖的光学设计，具有增强的信号检测作为逐个细胞识别的强大分析工具。该系统允许可靠的定量测量和快速获取统计学上显著的数据，用于高密度、多重测定。

本文描述的许多改进部分地由于适用于检测荧光的多像素光子计数器(MPPC)芯片而实现。与广泛用于流式细胞仪的光电倍增管(PMT)相比，MPPC技术具有一些区别特征，例如尺寸更小的占地面积和更大的量子效率，允许测量低光信号。MPPC，也称为硅光电倍增管(SiPM)，是一种固态器件，具有在盖革模式下操作的雪崩光电二极管(APD)阵列。当在盖革模式下操作时，即使单个光子激发它，每个单个APD也会产生足够大的电荷输出。每个像素都是以盖革模式操作的雪崩光电二极管(APD)和电阻器(称为“降压电阻器”)的组合，其中APD与电阻器串联放置。在使用MPPC进行光检测的操作中，光束(荧光或散射光)被引导到MPPC表面。作为接收入射光束的结果的MPPC输出是电流的形式，然后将其转换为模拟电压信号。优选地，模拟电压信号使用模数转换器(ADC)转换为数字信号，并以数字形式处理，以提高精度和速度。虽然数字输出数据不直接来自MPPC检测器/设备，但为了简化本文件和发明，我们有时将来自ADC或来自ADC之后的数字电路的数字数据称为MPPC输出数据本身。值得指出的是，入射到MPPC表面的光束可能是恒定光束，或者在许多应用中包括流式细胞仪应用，入射光束可能是脉冲形式，因此，MPPC输出也采用脉冲的形式，即输出是时间相关的。这里MPPC输出包括来自MPPC的时间相关电流，或者电流-电压转换后的时间相关模拟电压，或者ADC之后的时间相关数字数据。

虽然MPPC理论上可用于流式细胞仪检测和测量荧光，但由于许多技术挑战，它尚未用于实际的细胞计数器中：

1)MPPC具有大的暗计数背景。如此大的暗计数背景提供了用于检测暗淡荧光信号的限制因素。此外，这种暗计数可能与温度有关。

2)取决于施加到MPPC的操作电压，MPPC增益非常依赖于温度。温度波动可导致光信号放大增益的变化。这与PMT不同，温度对PMT增益影响不大。

3)MPPC在检测和测量不同强度的光方面的线性动态范围是有限的，主要取决于MPPC中像素的数量。对于可用于流式细胞仪应用的检测器，需要覆盖许多个十进位光强度的宽动态范围。

通过设计和开发用于降低和/或稳定MPPC工作温度的装置，有效地减少和控制暗计数噪声，克服了与MPPC温度相关的大的暗计数相关的挑战。通过确保控制MPPC的工作温度，MPPC在运行期间的增益现已稳定下来。此外，降低MPPC的操作温度的不期望的“副产物”效应是我们已经实现了大的动态范围，因为低端光检测主要由暗计数确定。

虽然MPPC的线性动态范围在使用配置有传统光检测器(例如PMT)的传统流式细胞仪光学器件时受到限制，但我们已开发出一种方法来操纵MPPC传感器表面的光束尺寸，以针对所有过滤器通道最大限度地利用MPPC光检测区域并提供足够的光检测动态范围。

如上所述，还可以采用通常用于分离和分光的各种方法来分离、分开和收集来自流过流动池的颗粒的荧光和散射光。其中包括光束整形、转向和引导光学元件。

可以采用在相对于彼此和相对于流动池的精确位置处配置具有多个透镜的一组光学器件来收集来自颗粒的荧光和衍射光。然后根据特定的激发激光器并根据光波长将收集的光分成不同的通道。通过使用不同的光学透镜用于聚焦或扩展光束，可以利用具有适当光束尺寸的MPPC检测由于一个激发激光器和具有特定波长范围的每个荧光通道处的光束。

在一种光收集和分离方法中，使用不同的光纤电缆来收集从不同激光源激发的荧光/散射光。然后，通过使用不同的二向色镜和带通过滤器，来自每根光纤电缆的光被分成不同的荧光通道。通过使用不同的光学透镜用于聚焦或扩展光束，可以利用具有适当光束尺寸的MPPC检测具有特定波长范围的每个荧光通道处的光束。

在另一种方法中，特殊设计的物镜用于在粒子穿过不同的激光源时收集来自粒子的光，并且根据产生光的激光源将光分离成不同的光束。然后，根据不同的二向色镜和带通过滤器的使用，将源自一个激光源的每个分离的光束分离成不同的荧光通道。与上面类似，通过使用不同的光学透镜用于在通道处聚焦或扩展光，可以利用具有适当光束尺寸的MPPC检测具有特定波长范围的每个荧光通道处的光。

在本发明的一个实施例中，光学引擎包括一组光学器件，其包括收集光学器件和过滤光学器件，所述过滤光学器件根据激发荧光的激光器将相同波长范围的荧光分离到收集光学器件的焦平面中的不同位置。优选地，光学引擎还包括用于扩展来自收集光学器件的焦平面的每个不同位置的相同波长范围的荧光的光束尺寸的透镜，每个位置源自由单个激光器激发的荧光，扩展为在MPPC表面的尺寸大约在1毫米至3毫米之间。可选地，MPPC表面处的光束尺寸在1.5至2毫米之间。虽然希望在MPPC表面上利用可能的最大光束尺寸，但是为了定位公差/精度可能不得不形成折衷。另外，为了增加MPPC表面的线性动态范围，适当开发/设计的透镜将允许在MPPC表面上实现相对均匀的光束。

通过开发与先前由收集光学器件的焦平面的不同位置分离的荧光相匹配的光学透镜，可以在所选择的MPPC表面处实现具有合适尺寸的相对均匀的光束。令人惊讶的是，对于所有波长范围的荧光，即，对于光学收集系统的所有荧光通道和这里适当设计的光学透镜，都能够获得这种光束均匀性(光强度在整个光束尺寸上的变化小于10％)和这种光束尺寸(相对于MPPC宽度/长度，例如3mm或6mm，在单个维度约为70％)。与MPPC表面上的这种光束特性一起，在MPPC上适当施加的操作电压(影响MPPC的增益和暗计数)和适当控制的温度范围(影响暗计数)，可以观察到合理的线性动态范围。对于许多商业上可用的MPPC，我们已经能够在单个操作电压下针对不同的MPPC获得从大约3个十进位、大约4个十进位到大约5个十进位的线性范围。如此处所述，提供大约3个十进位、大约4个十进位或大于线性动态范围的MPPC的这种令人惊讶的积极结果只能通过开发允许合适的光束尺寸、均匀的光束分布、受控的暗计数等的相关光学器件来实现。为了清楚起见，在本发明中，每个十进位对应于十的倍数，因此3、4和5个十进位分别对应于1,000、10,000和100,000的倍数。换句话说，3个十进位、4个十进位和5个十进位的线性范围意味着MPPC输出与线性动态响应范围的入射光强度呈线性关系，其最大与其最小光强度值之比分别为1,000、10,000和100,000。

为了进一步改善MPPC的线性动态范围，需要其他技术方法。如上所述，MPPC在检测和测量不同强度(即，由于入射光的输出电子电流)的光方面的线性动态范围主要取决于MPPC中的像素数量。具体而言，MPPC内的给定像素可以通过入射光子激活(对于这种激活，概率小于1，这个概率是MPPC检测器的量子效率)，从而在输出电子电流中产生纳秒范围响应脉冲。在基本物理层面，MPPC像素中的这种激活是雪崩光电二极管(该像素中的APD)在操作偏置电压下以盖格模式操作的状态，与降压电阻器串联。在这样的纳秒范围响应时间期间(取决于像素电容和降压电阻)，到达相同像素的额外光子将不能激活像素。因此，在理论上和实践中，在任何给定时刻或在纳秒范围的短时间窗口内，可以被用于电子电流输出的入射光子激活(正被激活)的MPPC的最大像素数是MPPC内的像素数，并且到达MPPC表面的任何光子(超过MPPC的像素数)将不能激活更多像素，并且不会有助于额外的电子电流输出。这是限制与输入光(在MPPC表面)相关的MPPC电流输出的线性动态范围的主要原因。除了MPPC检测器的像素数以及MPPC用于光子检测的量子效率之外，可能影响动态范围的一些其他因素包括暗计数(或暗电流)、MPPC增益(由于一个入射光子从一个激活的像素产生的响应脉冲的电荷除以每个电子的电荷的电荷比率)、串扰因子(串扰指的是检测用于输出电荷脉冲的光子的激活像素可能影响其他像素使它们产生输出电荷脉冲的效应)。在实验水平上，MPPC上的工作偏电压将影响所有上述因子，包括量子效率、暗电流、增益以及串扰因子。

为了进一步改善MPPC的动态范围使得输出电流与宽强度范围内的光强度成线性比例，在本发明中已经开发了数字校准技术。该技术基于以下事实：在MPPC表面的入射光强度相对较高的情况下，来自MPPC的输出电流可能饱和并且将低于理想情况，其中所有入射光子都可以产生输出电荷脉冲。如果对于这些高亮度情况在每个和所有光强度下能够确定来自MPPC的实际输出电流与理论上理想的输出电流的比率，则可以使用这些比率通过将测量的MPPC输出数据除以这些比率来校准MPPC检测器输出。我们将这些比率称为“校准因子”。

已经开发了导出校准因子的方法，如下所述。对于给定的MPPC类型，通过选择和设计光源(例如，激光器、激光二极管、发光二极管)，光束整形光学器件(例如，球面、非球面、柱面透镜)，光强度衰减机构(例如，在可见波长范围内具有恒定衰减的中性密度过滤片、光束切割针孔，以及可调节光源输出强度水平的光源上的控制电压)，光波长范围(例如，带通过滤器、给定波长范围的光源)，光脉冲形状或波形来设计和产生许多标准光束。通过使用适当设计的光束整形光学器件可以可靠且一致地产生具有所需光束尺寸和光束均匀性的这些标准光束。包括光束尺寸和光束分布均匀性的光束质量参数应与本发明中的光学引擎或流式细胞仪中检测的荧光或散射光的光束质量参数相匹配或相同。标准光束可以具有不同的波长范围，例如，515-545nm、650-670nm等，其应当与光学引擎和流式细胞仪中用于光学检测(散射或荧光)的波长范围相匹配。可以调节标准光束的光强度，其强度范围从亚毫瓦到微瓦，到纳瓦或微微瓦，甚至是毫微微瓦范围，这应当与光强度范围相匹配，所述光强度范围将在本发明的光学引擎或流式细胞仪中由MPPC检测。设计和控制光脉冲形状或波形，使得它们匹配本发明的光学引擎或流式细胞仪中的MPPC处检测到的光脉冲波形。

使用具有良好宽动态范围和优异线性响应的某些光学检测器测量和确定这种数量的标准光束的光强度。这种光学检测器可以选自PMT(光子倍增管)和APD(雪崩光子二极管)。这些光学检测器可能没有足够的检测灵敏度或线性度来精确测量低光强度光束。为了确保准确确定覆盖宽强度范围的所有标准光束的光强度，可以通过一个或多个光衰减过滤器(例如，具有光密度(OD)0.5或OD 1的中性密度过滤器，光密度是透射系数的常用对数的负值)产生低强度级光束，然后可以基于过滤器的OD数以及在通过OD过滤器之前测量的光束强度来计算这种光束强度。因此，我们已经能够产生一系列具有量化光强度水平的标准光束。换句话说，对于一系列目标光强度水平，我们可以操作光源，改变光学路径并调整各种可能的条件(例如施加到光源的电压，或添加或移除某些光衰减过滤器)以产生(具有所需的尺寸、均匀度、波长)的光束以满足这些目标强度。

由于具有可靠地产生这种数量的标准光束的能力，所以感兴趣的MPPC用于以MPPC的给定操作偏电压测量这些标准光束。MPPC及其相关电路，包括电流-电压转换，以及模数转换器(ADC)和任何可能的模拟或数字过滤器器，将提供一系列输出数字数据，每个都对应于标准光束的光强度水平。因此，对于这样的多个标准光束，可以获得MPPC数字输出与光强度水平的关系图。在低光水平但仍比MPPC检测器的暗计数高几倍的强度范围，可以在MPPC输出数据和光强度水平之间获得(观察到，正如预期那样)极好的线性。基于该良好线性范围内的斜率(测量的MPPC数据在Y轴上，光强度在x轴上，斜率可以基于多个数据点的线性回归导出)，可以获得所有光强度光束的理论MPPC输出数据，作为斜率(在上述线性范围内)和每个标准光束的光强度值的乘积。

因此，通过将测量的MPPC数据除以每个标准光束的理论MPPC数据，可以获得每个测量的MPPC值的校准因子。然后可以进行数学建模或模拟以得出校准因子方程，使得对于任何测量的MPPC数据，确定校准因子并用于计算“理论的、校准的”MPPC输出数据。因此，可以校正或校准MPPC输出与输入光强度的非线性，从而可以实现扩展的宽动态范围。

在上面的段落中，我们已经描述了基于使用具有一系列强度的多个标准光束来导出用于校准MPPC输出数据的校准因子的过程。上述方法不旨在限制用于导出或利用这种校准因子来扩展MPPC检测器的动态范围的技术或方法。实际上，还有其他可能的方法来推导校准因子。无论采用何种方法，校准因子，为测量的线性限制MPPC值与理想的线性响应MPPC所期望的理论MPPC值之间的比率。

值得指出的是，校准因子或校准因子曲线将取决于MPPC类型——不同的MPPC类型将具有不同的校准因子曲线。校准因子曲线还取决于施加到MPPC的操作偏电压和操作温度。此外，校准曲线取决于MPPC表面上光束的尺寸和均匀性分布，以及取决于光束的波长范围。

在采用MPPC检测器的光学引擎的优选实施例中，为了改善MPPC检测器的线性动态范围，通过将数据与相应的校准因子相除来按比例放大每个MPPC输出数据。使用上述技术确定校准因子。优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约半个(0.5)十进位(decade)。更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约一个(1)十进位。甚至更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约一个半(1.5)十进位。甚至更优选地，校准因子允许线性动态范围改善至少约二个(2)十进位。

鉴于以上所述，参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。首先转到图1，泵16将鞘液驱动到流动池130，样品也通过其他已知机构，例如泵(例如注射泵)，输送到流动池130中。通常实施为颗粒(例如细胞)悬浮液的样品通过鞘液流体动力地聚焦到流动池的中心。细胞通过不同激发激光器的有序通道产生荧光，其通过光收集和分光光学器件之后的检测器检测，统称为一组光学器件。存在各种方法用于驱动和输送鞘液和含有细胞悬浮液的样品流体到流动池中以用于流体动力地聚焦样品流体。这些在流式细胞仪领域中是公知的，并且通常使用泵16、阀18和流动通道19的组合来实现。

流式细胞仪10可以手动操作，例如通过样品抽吸针14(图1)通过抽吸单独地将细胞悬浮液逐个管地提供给流式细胞仪10，这在流式细胞仪领域中是已知的，或者可以通过结合可选的模块化自动进样器来适应高通量。这种模块化自动进样器优选地与不同的装载管兼容。其中包括常规12x75毫米流量管架，1.5/2.0毫升管架，例如通常由EppendorfInternational制造的那些，多孔板，例如24孔、96孔、(甚至348孔)、平底、V底、圆底或任何其他合适的管或盘，用于维持细胞悬浮液。在优选的实施例中，自动进样器配备有用于样品搅拌的振荡器或用于样品混合的其他机构。在优选的实施例中，自动进样器包括自对准协议，以便于设置和维护，允许用户方便地安装。

在优选实施例中，流式细胞仪10包括微处理器(即一个或多个微处理器)以控制各种功能，例如流体或样品递送、细胞悬浮或摇动，以及样品器皿的自对准。微处理器通常设置在电路板上，耦合到存储器并电连接到电动机构，例如电动泵和致动器，以实现预期的功能。此外，微处理器可以调制到检测器、激光器、抽吸泵或其他电气部件的电压。微处理器可以包括模数转换器，用于将来自光检测器的模拟信号转换成数字信号。微处理器可以处理和分析不同散射通道和不同荧光通道的数字信号，以产生用于单个细胞或颗粒的数据集。微处理器通信地连接到计算机，计算机向微处理器提供各种控制命令，并从微处理器接收由开发的软件控制的数据。

优选实施例包括存储在微处理器的可执行控制程序，用于每次吸样后自动清洁样品抽吸针14(当从连接到流式细胞仪的计算机接收到清洁命令时)，以减少细胞悬浮液交叉污染的风险。使用自动进样器时，这仍然是更优选的。这是通过控制各种泵和阀来实现的，用于用鞘液或冲洗液清洁抽吸针14的外表面和内表面。优选地，在使用这种自动进样器的实施例中，这种特征应产生小于1％或0.5％，甚至更优选地小于0.1％或0.05％的遗留。

优选的实施例还包括自动去泡和疏通特征，其防止由于细胞悬浮液的流动流中的气泡或堵塞产生的错误结果，并进一步确保准确的直接绝对计数而无需昂贵的参考计数珠。在优选的实施例中，流式细胞仪10还包括在启动和关闭流式细胞仪10时的自动清洁功能。该编程改进了易用性并且消除了用户执行这些可能是繁琐且耗时的步骤的必要。在更进一步的实施例中，结合自动液位检测警报，例如以合适的液位传感器的形式，以在系统液位低时通知使用者。

转到图2，示出了提供示例性光学引擎100的概览的示意图。光学引擎100包括一至三个激光器110，以及用于每个激光器110的一组光束整形光学器件120，以独立地将每个激发光源整形并引导至流动池130。通过收集光学器件150收集荧光，并通过过滤光学器件140将荧光分离成不同的波长范围。对每个通道使用MPPC检测器160完成荧光检测。许多电子组件，包括用于操作流式细胞仪100的一个或多个微处理器，流式细胞仪100包括响应于来自所开发的控制软件、用于操作光检测器的电子电路以及用于将模拟信号转换成数字信号以及用于处理数字信号等的电子电路的命令的自动系统功能，为简单起见，在图2中未示出。此处也未示出在操作期间与流动池130流体连接的注射泵。

尽管光学引擎100可以使用单个激光器110，但是光学引擎100允许流式细胞仪10执行多色流式细胞分析，例如通过测量来自每个荧光标记的细胞的大量参数和许多荧光信号。这可以通过利用例如图2中的三个激光器110v、110b、110r来实现。方便地，激光器110由于单独分配的收集光学器件150而可以至少部分地添加、移除或互换。用于多色流式细胞仪的示例性配置示于图2中，包括发射波长为405nm的第一激光器110v(也称为紫色激光器)，发射波长为488nm的第二激光器110b(也称为蓝色激光器)，以及发射波长为640nm的第三激光器110r(也称为红色激光器)。本领域技术人员将理解，一个或多个激光器110的可互换性允许用户以基础流式细胞仪系统开始并且在实验中指示这种需要时添加额外的或不同的激光器110。在一个或多个激光器100的这种交换或更换期间，可以改变或调整相应的光束整形光学器件120，以实现激光束在流动池130的中心处的最佳输送。

图3提供了顶视图的简化示意图，示出了用于来自三个激光器(例如，110v、110b、110r)的三个激光束的三个示例性光学路径(P1、P2、P3)的光束整形光学器件120，其中第一柱面透镜112v用于第一激光器110v(例如405nm)沿X轴聚焦激发光，第二柱面透镜114v聚焦来自第一激光器110v沿Y轴的激发光。类似地，用于第二激光器114b(例如488nm)的第一柱面透镜112b沿X轴聚焦激发光，第二柱面透镜114b沿Y轴聚焦激发光。一组两个扩束透镜111r从第三激光器110r扩大激发光(例如640)，随后是第一柱面透镜112r沿X轴聚焦激发光和第二柱面透镜114r用于沿Y轴聚焦激发光。来自每个激光器110的光路P1、P2、P3聚焦到单个流动池130，通过流动池130细胞流动动力地聚焦成流动鞘液的中心区域中的窄流。

还示出了半球透镜152，用于收集在通过流动池130行进时从荧光标记的细胞发射的荧光和侧向散射光。还示出了遮挡条180，其遮挡从P2穿过流动池130并朝向前向散射(FSC)聚焦透镜182的原始激光束，该聚焦透镜182自身聚焦来自第二激光器110b(例如488nm)的FSC光。通过带通过滤器184(488/10nm)，用于由光电二极管186检测，光电二极管186接收FSC光并将其转换成电信号以进行数据采集。

图4是示出通过相应的第二透镜114v、114b、114r引导的三个光路(P1、P2、P3)的放大示意图，所述第二透镜114v、114b、114r沿着流动池130汇聚在共同/相同的聚焦位置H(中心线)，但聚焦激光束在沿着流动池130的不同的垂直位置Vv、Vb、Vr处。作为非限制性示例，可以通过调节第二柱面透镜114v、114b、114r以将一个光束指向上方并且将一个光束指向中心光束下方来实现差分垂直聚焦。例如，图3中所示的配置垂直聚焦Vv从第一激光器110v向上给定距离(例如80微米)的第一光路P1，相对于光路P2的垂直聚焦定位Vb，经由从第二激光器110b的第二柱面透镜114b。这导致流动池130中的第一激光束/光路P1的垂直聚焦Vv垂直地在第二光路P2的垂直聚焦Vb上方相同的距离(例如，80μm)。类似地，相对于第二激光器110b的第二柱面透镜114b的垂直位置Vb，将第三激光器110r的第二柱面透镜114r向下调整给定距离(例如80μm)使第三激光束P3的垂直聚焦Vr在流动池130中相对于第二激光束P2垂直下降相同的距离(例如，80μm)。本领域技术人员将理解，虽然该分离描述为相隔80μm，但可以进行比这些更多或更少的分离。在一些实施例中，光束P1-P3与相邻光束P1-P3分开70μm。在其他实施例中，分离为50μm、55μm、60μm、65μm、75μm、85μm、90μm、100μm、125μm、150μm、175μm或200μm。此外，调整上述三个第二柱面透镜114v、114b、114r的Z轴位置允许三个激光束的Z轴焦点与流动池130的中心线重合，从而导致激光束的Z轴焦点在聚焦样本窄流内重合。通过沿着流动池130聚焦在不同的垂直位置Vv、Vb、Vr，由在不同垂直位置处穿过三个聚焦激光束的粒子发射的荧光信号然后由收集光学器件收集，根据过滤光学器件过滤到不同的波长范围，根据激发荧光的激光源，可以在相邻光束之间的一两(a couple of)毫米到几(a few)毫米之间的相同平面上进一步分离成不同的位置。

共同参照图1-4，独立控制来自三个激光器110v、110b、110r的三个分开的光路P1、P2、P3具有独特的优点。首先，通过调节第一柱面透镜112的X轴位置，直接分别调节每个聚焦光束沿X轴与流体动力地聚焦的样品流的对准。这可以用于消除不同激光束之间以及不同光路P1、P2、P3之间的干扰，从而允许将每个激光束调节到最佳对准。

其次，可以针对每个激光束独立地调节第二柱面透镜114的Z轴位置，确保Y轴光束的焦平面与流动池130中的流体动力地聚焦的流体流重合或对准。同样，不同激光束之间以及不同光路P1、P2、P3之间没有干涉，因此允许每个激光束被调节到与流体的最佳对准。

第三，通过沿Y轴对每个激光束简单地调节和移动第二柱面透镜114的高度，可以容易地调节和控制流动池130中三个不同光束之间沿Y轴的分离距离。通过这种方法，可以在相对大的范围内连续地调整光束间隔距离。

第四，通过对每个激光器独立于其他提供单独的光束整形和光束引导光学器件，可以选择或使用具有相同或不同的原始光束的直径的激光器110，因为对于每个通道，不同的柱面透镜112、114具有不同的焦距，可以用于适应原始光束直径的差异。

第五，这种光学照明设计将允许容易配置和激光照明源可能的升级。例如，可以从具有单个激光器110作为激发源的系统开始。当需要提供不同波长的附加激光器110源时，新激光器110及其(它们)相应的光束整形和引导光学组件120可以容易地添加到系统中，而不会影响现有的激光器110及其光束整形光学器件120。这些独特的优点将允许每个激光束在流动池130中的最佳对准和聚焦，克服了与其他光照明设计相比的限制，其中不同的激光器共享用于光束整形和光束分离的相同光路，以及对需要妥协的不同激光器的聚焦和对准。

前向光散射(也称为前向散射或低角度散射)是指流式细胞仪中的测量，其涉及由于细胞通过激光束而向前折射的光并且大致与细胞的直径成比例。当没有细胞通过激光束的路径时，光束不间断地通过流动池130并被遮蔽条180阻挡，使得来自激光束本身的光不会到达检测器。然而，当细胞通过流动池130时，光在所有方向上折射。沿向前方向折射的光错过遮蔽条180到达前向散射检测器186。

在美国专利9,575,063中，我们通过引用将其全部内容并入本文，我们描述了新型光遮蔽条的开发。为此，本文的方法、装置和系统优选地包括光遮蔽条180，例如美国专利9,575,063中描述的那些。在优选实施例中，提供菱形遮蔽条180。在另一个实施例中，提供了矩形形状并且其水平尺寸与其垂直尺寸相同或更长的遮蔽条180，用于阻挡入射激光束。在又一个实施例中，遮蔽条180的周边遵循光强度分布图的轮廓，用于阻挡入射激光束。在又一实施例中，遮蔽条180遵循0.1％轮廓线内的光强度分布图的轮廓。0.1％轮廓线或边界对应于轮廓上每个点处的光强度为入射光的最大光强度的0.1％处的线。确定遵循在0.1％轮廓内的光强度分布图的轮廓的遮蔽条180，以阻挡来自FSC检测器的99％的未散射光束。因此，本发明还提供一种通常为菱形的遮蔽条180，其遵循0.1％、0.2％的光强度分布图的轮廓。0.5％、1.0％或2.0％轮廓线及其成形方法。

流式细胞仪通常包括具有一个或多个荧光团的细胞标记。这通常通过将荧光标记的试剂(例如针对表面标志物的荧光标记的抗体)添加至细胞悬浮液，然后洗去未结合的试剂来进行。当细胞通过激光束时，细胞上或细胞中存在的荧光团增加了来自细胞的累积信号。这种试剂在本领域中是公知的，可以从很多供应商获得。通过大致垂直于激光束路径定位的收集光学器件150收集两侧散射和荧光，然后使用诸如二向色镜的过滤光学器件140过滤和反射到不同的通道中。二向色镜允许通过某些波长范围并反射剩余的波长。

在本发明的上下文中，流式细胞仪10包括光学引擎100，其包括：一组激光器110，每个激光器发射适于激发荧光分子的特定波长的光；其中来自激光器的光沿x轴水平聚焦到相同的水平位置H并沿y轴垂直聚焦到沿相同激发平面的不同垂直位置Vv、Vb、Vr，其中该平面的特征在于通过流式细胞仪10的流动池130的流动路径；一组光学器件，包括用于收集来自流动池的粒子散射光和荧光的收集光学器件150，以及将收集的荧光从流动池130过滤到不同波长范围的过滤光学器件140，其中所述组的光学器件根据激发荧光的不同激光器110进一步分离相同波长范围的荧光至收集光学器件的焦平面中的不同位置；和检测器160，其在不同位置有选择地检测光，从而将相同波长范围内发射的荧光从该组激光器110内不同的激光器110v、110b、110r区分并将光转换成电信号。本发明中的光学检测器160的优选实施例实施为MPPC检测器160。因此，多个通道中的每个荧光或测量通道的特征在于属于使用来自激光器组110的单个激光器110v、110b、110r发射的波长范围。为此，多个通道提供多个用于样品分析的数据集。

更详细的概览显示在图5中，其中使用收集光学器件150收集来自流动池130的荧和SSC信号，然后利用过滤光学器件140分成不同的检测通道，主要包括长通和/或短通分色镜142和带通过滤器144。图中显示了许多用于检测以下荧光波长范围的MPPC模块(161a-161h)：725/40nm(161a)、697/58nm(161b)、661/20nm(161c)、780/60nm(161d)、615/20nm(161e)、586/20nm(161f)、445/45(161g)、530/43(161h)。每个MPPC模块161a-h包括至少一个MPPC检测器160，用于将光学光信号转换成电子信号。MPPC检测器160进一步电连接到用于模数转换的电路(为简单起见未示出)，然后转换的数字信号由与计算机(也未示出)通信的微处理器处理。此外，表1提供了用于进行21色(或21通道)流式细胞仪分析的相容荧光团的非限制性列表，其中每个MPPC检测器可用于从不同激光器获得荧光信号。为此，21通道流式细胞分析系统内的每个通道的特征在于特定的起始激光和波长范围。

表1

通过沿流动池130将激发激光束聚焦在不同的垂直位置并收集来自流动池130的光，来自每个垂直位置的光被收集并分成不同的波长范围，如图5所示。此外，根据激发荧光的激光源，当通过过滤光学器件收集和过滤时，来自每个垂直位置的光被分离到相邻光束之间约一两(a couple)毫米到几(a few)毫米。

图6A中示出了流动池中空间上不同位置的收集和测量的更详细的示意图。在该示例性实施例中，使用高折射率半球透镜152(例如，n约为1.5或更高)收集沿流动池130的四个不同垂直位置(Vv、Vr、Vg、Vb)的荧光。每个光路通过两组双合透镜154(具有大于或等于0.8的NA)进行准直荧光并通过一个或多个二向色镜142过滤。如已经提到的，半球透镜152优选地由高折射率材料制成。这种选择是为了使数值孔径(NA)最大化并且用于减小半球透镜152之后的荧光光束的总直径/尺寸。这种缩小的光束直径也允许对于双合透镜154更小的直径，使得这种双合透镜154稍微没那么困难地设计和制造。已经发现，高折射率半球透镜152和双合透镜154的组合产生了用于有效地收集荧光的高数值孔径物镜。这种设计不仅产生了高收集效率，而且还使设计和制造这些物镜的成本降低。然后光路通过带通过滤器144，并到达MPPC模块161。

如图6A所示，来自每个不同垂直位置Vv、Vr、Vg、Vb的光被聚焦成小的光束尺寸(例如，大约几毫米或更小)，间隔距离为一两毫米到几毫米之间。作为光的相邻光束通过收集光学系统(半球透镜152，两组双合透镜154)收集并行进通过过滤光学系统(二向色镜142，带通滤光器144)，到达MPPC检测模块161。在收集光学器件(半球透镜152、两组双合透镜154)的焦平面200处，相同波长范围的相邻光束间隔开一两(a couple)毫米到几(a few)毫米。需要说明的是，在这种情况下，包括半球透镜152和两组双合透镜154的收集光学器件从流动池的不同位置(Vv、Vr、Vg、Vb)收集散射光和荧光，并将光聚焦到焦平面200，其中每个聚焦光束尺寸的直径通常小于500微米。对于图6A所示的示例，MMPC模块161包括棱镜168，进一步将来自流动池130的两个中间垂直位置的光分隔开，使得每个光束通过MPPC检测器162、163、164、165独立地检测。注意，在一个特定实施例中，焦平面200与棱镜168的镜面反射点重合。在图6A中，共4个检测器162、163、164和165用于检测来自流动池130的四个不同垂直位置Vv、Vr、Vg、Vb的荧光，如激发每个单独的激光。

在优选实施例中，每个光束通过透镜以在到达MPPC检测器之前扩展光束。这在图6B中示出。来自流动池130中的四个不同垂直位置Vv、Vr、Vg、Vb的光束在以下列方式到达MPPC检测器表面之前行进通过该组光学器件内的不同光学组件。与图6A类似，来自流动池130中的两个中间垂直位置Vr、Vg的光被棱镜168进一步分隔开。由棱镜168的上表面反射的光到达反射镜172，然后在到达MPPC检测器163的表面之前通过透镜193，以检测。类似地，由棱镜168的下表面反射的光到达反射镜174，然后在到达MPPC检测器165的表面之前穿过透镜195。来自流动池130的顶部垂直位置Vv的光穿过透镜192并到达MPPC检测器162的表面，以进行检测。来自流动池130中的最低垂直位置Vb的光通过透镜194并到达MPPC检测器164的表面，以进行检测。利用透镜192、193、194和195扩展光束为改进的大小，用于在MPPC表面检测(通过设计和使用透镜192、193、194和195，一致且优化的光束尺寸是可能的)。此外，透镜192、193、194和195额外的设计功能为在MPPC表面产生均匀的光束分布。这样优化的光束尺寸和光束均匀性(通过透镜192、193、194和194的设计)有助于改善用于此处光检测的MPPC设备的线性动态检测范围。

本发明的另一个重要特征是用于检测荧光的多像素光子计数器(MPPC)芯片。与广泛用于流式细胞仪的PMT相比，MPPC具有一些区别特征，例如尺寸更小的占地面积和更大的量子效率，允许测量低光信号。尽管MPPC理论上可用于流式细胞仪来检测和测量荧光，但由于多种原因，例如大的暗计数背景、增益与温度相关、可能有限的动态范围等，它尚未用于实际的细胞计数器中。

为此，在本发明的另一个实施例中，提供了一种用于台式流式细胞仪的光学引擎，其包括激光器，调谐到适合于激发荧光分子的波长，其中来自激光器的光沿激发平面沿x轴水平地聚焦至一水平位置并沿y轴垂直地聚焦至一垂直位置，其中沿激发平面的水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交；一组光学器件，包括用于收集从流动池发射的荧光的收集光学器件和将收集的荧光从流动池过滤到不同的波长范围的过滤光学器件，从而提供不同的荧光通道；以及每个荧光通道上的MPPC检测器，用于检测荧光并将光转换为电信号。在优选发实施例中，光学引擎还包括一组激光器，其中每个激光器沿着y轴垂直聚焦到沿着相同激发平面的不同垂直位置，此外，该组光学器件将发射的荧光从流动池分离到不同的荧光通道，其中每个通道的特征在于不同的波长范围和激发荧光的不同激光器。

在上述光学引擎的优选实施例中，MPPC以高于30倍的线性动态范围操作。更优选地，MPPC以高于40倍的线性动态范围操作。

在上述光学引擎的一些实施例中，根据校准因子校正MPPC数字输出值。优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过50倍。更优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过10倍。甚至更优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过15倍。更进一步优选地，校准因子将MPPC的线性动态范围改善超过20倍。

在优选的实施例中，流动池的前向散射(FSC)特征包括FSC检测器、用于收集FSC光的FSC聚焦透镜，以及阻挡入射激光束进入FSC聚焦透镜和FSC检测器的遮蔽条。荧光检测器处的荧光信号的定时与FSC检测器处的前向散射信号的定时之间的关系提供了用于确定哪个激光器在检测通道中诱导激发检测到的荧光信号的方法。

通过使用改进的遮蔽条已经实现了前向散射(FSC)检测的进一步改进。在优选实施例中，提供了菱形遮蔽条。在另一个实施例中，提供了矩形形状并且其水平尺寸与其垂直尺寸相同或更长的遮蔽条，用于阻挡入射激光束。在又一个实施例中，遮蔽条的周边遵循用于阻挡入射激光束的光强度分布图的轮廓。在又一个实施例中，遮蔽条遵循0.1％轮廓线内的光强度分布图的轮廓。0.1％轮廓线或边界对应于轮廓上每个点处的光强度为入射光的最大光强度的0.1％处的线。确定遵循在0.1％轮廓内的光强度分布图的轮廓的遮蔽条，以阻挡来自FSC检测器的99％的未散射光束。因此，本发明还提供一种通常为菱形的遮蔽条，其遵循0.1％、0.2％的光强度分布图的轮廓。0.5％、1.0％或2.0％轮廓线及其成形方法。

光学引擎的组件优选地被容纳为单个单元，并且这些光学组件中的一些可以移除和互换,用其他组件修改。为此，还提供了一种用于容纳光学引擎组件的外壳。所述外壳包括光学引擎组件，例如激光器组，用于将激光束聚焦到激发平面的光学器件，收集光学器件，过滤光学器件，光电检测器或光检测器，其他过滤器(和/或透镜)，以及作为用于从光电检测器或光检测器到电路的电连接的电接口，所述电接口将连接到外部微处理器或远程计算机。在一些实施例中，每个激光器具有相应的一组光束整形光学器件，其中来自每个激光器的光沿x轴水平聚焦到相同的水平位置并且沿y轴垂直聚焦到沿相同激发平面的不同垂直位置，其中沿着激发平面的相同水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交。在其他实施例中，所有激光束可沿x轴水平独立可调且可沿y轴垂直独立可调，所有激光束通过适当放置的二向色镜组合在一起，并通过共同的消色差光束整形光学器件，以便所有激光束聚焦到相同的水平位置和聚焦到沿相同的激发平面的不同的垂直位置，其中激发平面上的水平位置通过流式细胞仪的流动池的流动路径。优选地，同一外壳内的组件配置用于不同激光器、聚焦透镜、长通和短通分色镜、过滤器、针孔通道和检测器的可互换性。这是通过标准化接合特征(例如将对准孔、按扣、螺钉或其他紧固件定位在不同的部件上以便互换)以及通过为每个激光器单独提供一组光束整形光学器件来实现的。优选地，光电检测器或光检测器是MPPC检测器。在一些实施例中，流动通道安装在外壳中并配置成用于耦合到流式细胞仪装置，用于通过管连接器对包括颗粒(例如珠子或细胞)的样品进行流体动力聚焦。

在进一步的实施例中，图7A示出了转换来自MPPC的电子模拟信号后数字输出对入射光的功率水平的依赖性。对于该测试，入射光以10kHz脉动，脉冲持续时间为4μs。从MMPC芯片输出的模拟电流通过电阻转换为电压。然后将电压数字化以提供数字输出。入射光束从大约115微米到1.1毫米变化。显然，光束尺寸越大，线性动态范围越宽。对于尺寸为约1.5mm×1.5mm的MPPC芯片，图7A示出对光束尺寸进行评估，1.1mm光束尺寸给出了比760μm、550um和115μm光束尺寸更好的动态范围。光束尺寸是指MPPC表面上入射光束的光点直径。

图7B示出了来自另一MPPC检测器的数字输出与图7A中使用的不同电阻器的依赖性。这里，电阻器用于将MPPC输出电流转换为模拟电压，然后通过ADC进一步转换为字MPPC输出。图7B中的电阻器大于图7A中使用的那些，来自图7B的数字输大于图7A中的数字输出。类似于图7A中的数据，1.1mm光束尺寸给出了比760μm、550μm和115μm的光束尺寸更好的动态范围。图7C示出了对于1.1mm的光束尺寸，MPPC数字输出与入射光强度的线性回归拟合。如图1中所示。在图7C中，入射光束尺寸的MPPC输出显示约3.5十倍的线性动态范围。也就是说，对于约10^-11W至约3×10^-8W之间的光强度，MPPC在数字输出方面表现出与光强度成比例的线性响应。

图8示出了转换来自MPPC的电子模拟电压信号后数字输出对入射光的功率水平的依赖性(虚线上的菱形符号)。对于该测试，入射光以10kHz脉动，脉冲持续时间为4μs。从MMPC芯片输出的模拟电流通过电阻转换为电压。然后将电压数字化以提供数字输出。对于该尺寸为约3mm×3mm的MPPC芯片，入射光束为1.9mm。光束尺寸是指MPPC表面上入射光束的光点直径。图8中的实线示出了对于测量的MPPC数据与光强度，MPPC数字输出与入射光强度的线性回归拟合。如图8所示，入射光束尺寸的MPPC输出显示出超过4个十进位的线性动态范围。也就是说，对于约2×10^-11W至约3.5×10^-7W之间的光强度，MPPC在数字输出方面表现出与光强度成比例的线性响应。

图9示出了对于波长范围在515-545nm之间的入射光束，在特定操作偏压和室温下针对尺寸为3mm×3mm的MPPC确定的校准因子与MPPC数字输出的关系图。使用本发明的上述部分中描述的技术确定每个校准因子。实线表示使用多项式方程对校准因子对MPPC数字输出的依赖性的理论建模。该导出的方程允许计算任何MPPC数字输出值的校准因子。通过将MPPC数字输出值除以相应的校准因子，对MPPC输出值进行校正，并且得到的输出数据将显示出显著改善的线性度。当校准因子用于校准或修正MPPC数字输出值时，图9中所示的MPPC数据的线性动态范围将改善超过1.5个十进位。

当入射光约为几pW或更低时，MPPC动态范围的下端受到系统的光学噪声和电子噪声以及非常重要的MPPC的暗计数的限制。在这方面，我们已经通过降低MPPC的工作温度来减少和控制暗计数噪声。图10示出了具有MPPC的暗计数噪声的直方图，MPPC不接受任何外部光线，左侧面板处于室温且右侧面板处于降低的温度。在此测试中，MPPC在某些工作电压下供电。输出的“暗计数”电流噪声通过电阻器转换为电压。然后通过模数转换器将输出电压数字化。然后通过算法处理数字输出，该算法在整个实验过程中识别每个小时间间隔内的最大值。这样，每个时间间隔将从MPPC电路引出一个输出值。然后以直方图格式绘制输出值。显然，直方图的平均值越大，暗计数噪声越大。随着MPPC芯片的温度降低，MPPC暗计数输出的分布平均值显著减小，从247到70的数字值，降低约70％。

因此，我们已经表明降低MPPC温度可以减少暗计数噪声。我们现在正在开发降低MPPC运行温度的特殊技术和方法。

图11示出了在530/43nm的荧光通道处检测到的6-pk珠子的初步数据，通过蓝色激光激发，通过MPPC检测器检测，左侧面板处于室温下，右侧面板处于降低的温度。在此测试中，MPPC在某些工作电压下供电。6-pk珠子穿过流动池中的流动通道，其中488nm、640nm和405nm的激光束聚焦到相同的水平位置，并且每个激光束聚焦到不同的垂直位置，在流动池的中心相隔80μm。由激光束激发的珠子产生的荧光通过收集光学器件收集，并过滤到约530nm/43nm的波长范围。然后用MPPC芯片检测由蓝色激光器引起的荧光。显然，在左侧面板上显示的室温下，检测器几乎无法区分出两个最暗的珠子。然而，通过降低右侧面板的温度，MPPC检测器可以轻松解析两个最暗的群体。这清楚地说明降低操作温度可以提高系统解析和荧光检测的动态范围。

使用通信地耦合到流式细胞仪的计算机来执行对用于设置和数据采集的流式细胞仪的控制和通信。因此，还开发了用于在计算机中加载的流式细胞分析软件。流式细胞分析软件优选地包括数据采集特征和数据分析特征。如在流式细胞仪领域中已知的，数据采集涉及从实验收集和存储数据。这还可以包括用于获取数据的设置特征，例如补偿调整，限定在特定门控群体内待计数的细胞数量，设置样本流速，以及在流式细胞仪领域中遇到的其他实验控制。数据分析特征可以包括绘制一种或多种荧光颜色的细胞亚群，确定特定细胞亚群的绝对计数，确定特定亚群的相对百分比，细胞周期分析，以及流式细胞分析程序中发现的其他数据分析特征。为此，该软件提供了多功能、用户友好和直观的绘图和选通工具(gatingtools)，其统计工具提供了卓越的统计数据分析功能。在优选实施例中，所有采集参数、实验和样本文件以及图表在一个窗口区域中是可见的和可访问的。

在一些实施例中，数据收集过程可以包括计算和处理不同检测器的相同波长的荧光信号到不同的荧光通道中(由激发平面的不同垂直位置处的不同激光器激发)；生成图形用户界面(GUI)，其显示具有一个参数与另一个参数(例如，FSC与SSC，FSC与荧光信号，或一个荧光信号与另一个荧光通道)的二维图，其中GUI还具有与比较图相邻的补偿滚动条，以调整一个或多个通道之间光谱重叠的补偿；从每个光散射通道和每个荧光通道收集数据；以及将数据保存到数据文件中。该软件还优选地包括门控功能，其允许用户从直方图之一或2D图之一选择亚群并生成另一个图(其可以是所选子群的单参数直方图或者是两参数2D图。可以重复这种“门控”和对“门控群”的进一步分析。

在另一个相关的实施例中，提供了流细胞计数法，其包括提供本文提供的流式细胞仪或流式细胞分析系统；用多个荧光标记标记细胞样本；将细胞样品泵入流动通道；收集流式细胞仪数据；分析流式细胞仪数据以确定样品细胞上或细胞中多个荧光标记中的一个或多个的存在、不存在或丰度。

Claims (43)

1.一种用于台式流式细胞仪的光学引擎，该光学引擎包括：

a)一组激光器，每个激光器调谐到适合激发荧光分子的波长，其中来自每个激光器的光沿x轴水平聚焦到相同的水平位置，并沿相同的激发平面沿y轴垂直聚焦到不同的垂直位置，其中沿激发平面的相同水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交；

b)一组光学器件，包括用于收集从流动池发射的荧光的收集光学器件和将来自流动池的发射的荧光过滤到不同的波长范围的过滤光学器件，其中该组光学器件根据激发荧光的不同激光器，进一步将收集光学器件的焦平面中相同波长范围的荧光分离到不同的位置；以及

c)检测器，其选择性地检测来自不同位置的光，从而区分在该组激光器内通过不同激光器激发的相同波长范围内发射的荧光，并将光转换成电信号。

2.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，该组激光器包括两个、三个、四个或五个单独的激光器，每个激光器被调谐到不同的波长并且被引导到激发平面的不同垂直位置，从而沿流动池分别提供两个、三个、四个或五个不同的垂直位置。

3.根据权利要求2所述的光学引擎，其中，所述流动池中的垂直位置分隔开60至120μm。

4.根据权利要求3所述的光学引擎，其中，所述流动池中的垂直位置分隔开约80μm。

5.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述收集光学器件包括半球透镜，后面是两组双合透镜。

6.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述过滤光学器件包括二向色反射镜和/或带通过滤器。

7.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述过滤光学器件过滤选自由780/60nm、615/20nm、530/43nm、445/45nm、586/20、661/20、697/58和725/40nm组成的组中的一个或多个波长范围。

8.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述收集光学器件的焦平面中的不同位置与相邻位置分隔开1毫米至4毫米，可选地2至3毫米。

9.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述收集光学器件的焦平面中的不同位置与所述收集光学器件的焦平面内的相邻位置分隔开1至4毫米。

10.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，该组光学器件还包括透镜，用于将来自所述收集光学器件的焦平面中的每个不同位置的光束扩展为大约1mm到大约3mm的尺寸，其中每个源自荧光的光束由单个激光器激发。

11.根据权利要求1所述的光学引擎，其中，所述检测器为多像素光子计数器(MPPC)或硅光电倍增器。

12.根据权利要求11所述的光学引擎，其中，所述MPPC以高于3个十进位的线性动态范围操作。

13.根据权利要求12所述的光学引擎，其中，所述MPPC以高于4个十进位的线性动态范围操作。

14.根据权利要求11所述的光学引擎，其中，MPPC的数字输出值根据校准因子校正。

15.根据权利要求14所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过半个十进位。

16.根据权利要求14所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过一个十进位。

17.根据权利要求14所述的光学引擎，其中，所述校准因子将MPPC的线性动态范围改进超过一个半十进位。

18.根据权利要求14所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过两个十进位。

19.根据权利要求1所述的光学引擎，还包括前向散射(FSC)检测器、FSC聚焦透镜和遮蔽条。

20.根据权利要求19所述的光学引擎，其中，所述遮蔽条是菱形的，或具有矩形形状，其水平尺寸等于或大于其垂直尺寸。

21.根据权利要求19所述的光学引擎，其中，所述遮蔽条的周长遵循光强度分布图的轮廓，可选地在0.1％的轮廓线内。

22.根据权利要求21所述的光学引擎，其中，所述遮蔽条阻挡99％的未散射光，防止FSC检测器的检测。

23.根据权利要求1所述的光学引擎，还包括：外壳，其配置为容纳光学引擎组件，所述光学引擎组件包括该组激光器，用于将激光束聚焦到激发平面的光学器件，所述收集光学器件，所述过滤光学器件和所述检测器，其中配置相同的外壳用于不同激光器、透镜、反射镜、过滤器和检测器的可互换性。

24.根据权利要求1所述的光学引擎，还包括所述流动池。

25.一种流式细胞仪，包括：

a)根据权利要求1所述的光学引擎；

b)流动池；和

c)与用于抽吸和输送细胞悬浮液通过流动池的抽吸针流体连通的泵。

26.根据权利要求25所述的流式细胞仪，其特征还在于：

a)该组激光器包括两个、三个、四个或五个激光器，每个激光器调谐到不同的波长并聚焦到沿流动池的不同垂直位置；和

b)该组光学器件在空间上区分在分别由两个、三个、四个或五个不同的激光器中的每一个分别激发的相同波长范围内的过滤荧光。

27.一种流式细胞分析系统，包括：

a)根据权利要求25所述的流式细胞仪；和

b)计算机，其可操作地加载有开发的流式细胞分析软件以获取和分析流式细胞分析数据。

28.根据权利要求27所述的流式细胞分析系统，其中，所述软件提供编程以执行以下功能：

a)从每个检测器获取荧光通道的数据，其中由不同检测器收集的荧光信号被转换成不同的数据系列，对应于在不同垂直位置的由激光器激发的荧光；

b)生成显示所获取数据的各种图的图形用户界面(GUI)，其中GUI还包括与比较图相邻的补偿滚动条，以调整一个或多个通道之间的光谱重叠的补偿；和

c)将获取的数据保存到数据文件中。

29.一种流式细胞分析方法，包括：

a)提供根据权利要求27所述的流式细胞分析系统；

b)用多个荧光标记标记细胞悬浮液；

c)通过流动通道泵送细胞悬浮液；

d)收集流式细胞分析数据；和

e)分析流式细胞分析数据以确定样品细胞上或样品细胞中多个荧光标记中的一个或多个的存在、不存在或丰度。

30.一种用于台式流式细胞仪的光学引擎，该光学引擎包括：

a)激光器，调谐到适合于激发荧光分子的波长，其中来自激光器的光沿x轴水平聚焦到水平位置并沿激发平面沿y轴垂直聚焦到垂直位置，其中沿激发平面的水平位置与通过流式细胞仪的流动池的流动路径相交；

b)一组光学器件，包括用于收集从流动池发射的荧光的收集光学器件和将收集的荧光从流动池过滤到不同的波长范围的过滤光学器件，从而提供不同的荧光通道；和

c)每个荧光通道处的MPPC检测器，用于检测荧光并将光转换为电信号。

31.根据权利要求30所述的光学引擎，还包括至少1到4个另外的激光器，其中每个激光器沿y轴垂直聚焦到沿相同激发平面的不同垂直位置，进一步，其中该组光学器件将来自流动池发射的荧光分隔开进入不同的荧光通道，其中每个通道的特征在于不同的波长范围和激发各自的荧光的不同的激光器。

32.根据权利要求30所述的光学引擎，其中，所述MPPC以高于3个十进位的线性动态范围操作。

33.根据权利要求32所述的光学引擎，其中，所述MPPC以高于4个十进位的线性动态范围操作。

34.根据权利要求30所述的光学引擎，其中，MPPC的数字输出值根据校准因子校正。

35.根据权利要求34所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过半个十进位。

36.根据权利要求35所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过一个十进位。

37.根据权利要求36所述的光学引擎，其中，校准因子将MPPC的线性动态范围赶紧超过一个半十进位。

38.根据权利要求37所述的光学引擎，其中，所述校准因子将所述MPPC的线性动态范围改进超过两个十进位。

39.一种流式细胞仪，包括：

a)根据权利要求30所述的光学引擎；

b)流动池；和

c)与用于抽吸和输送细胞悬浮液通过流动池的抽吸针流体连通的泵。

40.根据权利要求39所述的流式细胞仪，其特征还在于：

a)该组激光器包括两个、三个、四个或五个激光器，每个激光器调谐到不同的波长并聚焦到沿流动池的不同垂直位置；和

b)该组光学器件在空间上区分在由两个、三个、四个或五个不同的激光器中的每一个激发的相同波长范围内的过滤荧光。

41.一种流式细胞分析系统，包括：

c)根据权利要求39所述的流式细胞仪；和

d)计算机，其可操作地加载有开发的流式细胞分析软件以获取和分析流式细胞分析数据。

42.根据权利要求41所述的流式细胞分析系统，其中，所述软件提供编程以执行以下功能：

a)从每个检测器获取荧光通道的数据，其中由不同检测器收集的荧光信号被转换成不同的数据系列，对应于在不同垂直位置的由激光器激发的荧光；

b)生成显示所获取数据的各种图的图形用户界面(GUI)，其中GUI还包括与比较图相邻的补偿滚动条，以调整一个或多个通道之间的光谱重叠的补偿；

c)将获取的数据保存到数据文件中。

43.一种流式细胞分析方法，包括：

a)提供根据权利要求40所述的流式细胞分析系统；

b)用多个荧光标记标记细胞悬浮液；

c)通过流动通道泵送细胞悬浮液；

d)收集流式细胞分析数据；和

e)分析流式细胞分析数据以确定样品细胞上或样品细胞中多个荧光标记中的一个或多个的存在、不存在或丰度。