CN110117319A

CN110117319A - 细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用

Info

Publication number: CN110117319A
Application number: CN201910389360.8A
Authority: CN
Inventors: 徐宗昌; 李义强; 张成省; 任婷婷; 杜海娜; 王萌; 荆常亮; 袁源; 孟晨; 马斯琦; 尤祥伟; 赵栋霖; 邹平
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-08-13

Abstract

本发明公开了细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用，所述细胞膜定位罗布麻蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次鉴定得到罗布麻AvCESA1基因，并证实AvCESA1蛋白定位在质膜上，构建的融合表达载体可做为其它蛋白质膜定位的标记，以此实现的质膜定位法适用性强，容易操作，试验周期相对较短，且灵敏度高，可实现高通量的蛋白质亚细胞定位。

Description

细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用。

背景技术

蛋白质是一种生命大分子，结构复杂多样功能各异，在几乎所有的生命活动中起着非常重要的作用。

生命活动的基本单位是细胞。原生质体和细胞壁是构成植物细胞的两个主要部分组成。原生质体主要由细胞核和细胞质组成，是细胞壁内一切物质的总称。细胞质和细胞核中还有类型各异的的细胞器，例如高尔基体、线粒体、内质网、过氧化物酶体、核糖体、叶绿体、溶酶体以及液泡等。而亚细胞结构就是指这些包括细胞壁和质膜在内的不同细胞器。亚细胞结构中都散布各种类型的蛋白质。通常膜系统包括质膜以及各种细胞器内膜是蛋白质种类最为丰富的区域。在膜系统上分布的蛋白质主要有通道蛋白、与细胞活动相关的离子泵、载体蛋白受体蛋白以及合成酶等。

不同的亚细胞结构行使不同的功能，招募特定的蛋白质完成生命活动。同时各类亚细胞结构具有各自独特的物理空间和化学性质如pH值，能够为蛋白质参与生命体的各种活动提供稳定的环境和条件。研究蛋白质的亚细胞定位信息能够起到如下作用：（1）有利于推断蛋白质的功能。知道了蛋白质所处的亚细胞位置，便能够对蛋白质的功能、进化、与其它蛋白质之间的相互作用进行推断，初步明确蛋白质可能的功能作用；（2）了解基因功能表达的信息。生命体的核心物质是基因，基因通过一系列的生物作用生成蛋白质。生命体中基因所蕴含的遗传密码均是通过蛋白质来向生命体传达蛋白质的亚细胞定位信息可以为各种生命活动发生的机理提供理论依据。因此蛋白质亚细胞定位的研究具有重要价值和实际意义。

目前，植物蛋白质亚细胞定位方法主要包括:（1）免疫组织化学定位法；（2）共分离标记酶辅助定位法；（3）蛋白质组学定位技术；（4）生物信息学预测方法和（5）融合报告基因定位法。

免疫组织化学定位法一般需要结合切片技术、免疫杂交技术和显微镜技术对蛋白质亚细胞定位做出验证。具体做法为将目标材料进行切片制作，然后利用特异性抗体与切片中的目标蛋白进行杂交，最后借助显微镜观察抗体携带的荧光标记所在的位置，确定目标蛋白的亚细胞定位。该方法最大的特点是能够反映生物活体状态下蛋白的真实定位，可以在亚细胞水平检测多种抗原物质，比如激素、多肽以及受体等，反应灵敏。但是该方法也存在显著的缺点，并非所有的目的蛋白都能够找到合适的特异性抗体，并且操作繁琐，技术要求高。。共分离标记酶辅助定位法首先需要超速离心分离细胞组分，然后通过检测特定细胞器具有的特征蛋白酶活性确定具体的亚细胞结构，再利用目标蛋白的特异性抗体进行杂交，进而确定目标蛋白的有无和亚细胞位置。同免疫组织化学定位法一样，该方法的不足也在于需要目的蛋白的特异性抗体，并且并非所有的细胞器都有特征酶，因此其应用也受到限制。蛋白质组学定位技术结合细胞器组分分离技术、双向电泳技术和质谱技术实现蛋白质亚细胞定位的高通量研究。同过细胞器组分分离明确亚细胞结构，双向电泳实现各种蛋白质的分离，质谱分析确定蛋白种类。但高丰度蛋白对双向电泳结果的遮蔽作用以及细胞组分分离的混杂会对质谱检测的高灵敏度结果形成误导，影响结果的准确性。目前，随着基因组和蛋白组等组学技术以及生物信息学的发展，通过生物信息学手段对大数据进行整合分析的蛋白质亚细胞定位预测成为该领域的一个便捷手段。其原理在于对目前已知亚细胞定位的各类蛋白质进行氨基酸特征序列提取或描述，同过对未知定位蛋白的相关参数进行解析和比对进行亚细胞定位预测。该方法能够实现高通量预测，并且能够见底成本提高时效性，但大多数的预测程序都有局限性，其预测结果往往还需要实验验证。而融合报告基因定位法则是利用分子生物学手段，将编码目的蛋白的基因与报告基因（目前所用多为GUS和荧光蛋白基因，如GFP/RFP）进行融合，构建表达载体，然后通过观察报告基因产物所在的亚细胞位置确定目的蛋白的亚细胞定位。该方法操作简便，适用性强，且实验周期短结果可靠是目前进行蛋白质亚细胞定位的首选方法。

有实验证实，很多蛋白质可以在不同细胞器之间穿梭实现生物学功能，这类蛋白质被称为多标记蛋白。而有一些蛋白质只在单一细胞器上发挥作用，其位置固定，可以通过与荧光蛋白构建融合表达蛋白，做为一种工具蛋白，利用融合报告基因定位法来指示其它蛋白质的亚细胞位置。纤维素合成酶基因编码的纤维素合成酶蛋白就是一种定位在质膜上的蛋白质，能够在质膜上合成纤维素。拟南芥CESA蛋白在N端有一个保守的锌指蛋白结构域，包含“CXXC”氨基酸残基序列，长度在10~40个氨基酸残基左右，形成CX2CX12FXACX2PXCX2CXEX5GX3CX2C保守域。该保守域能在 CESA蛋白形成蛋白复合体时进行蛋白之间的相互识别，形成一个由6个CESA蛋白组合而成的蛋白复合体合成纤维素单元。而在拟南芥CESA蛋白的C端则具有6个相对保守的跨膜区，锚住质膜定位与细胞质膜上。但是根据CESA蛋白定位于质膜特性开发的膜定位荧光蛋白标记载体没有报道。

因此，现有技术还有待进一步发展。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用。本发明的技术方案如下：

一种细胞膜定位罗布麻蛋白，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的细胞膜定位罗布麻蛋白，其中，其氨基酸序列具有8个跨膜区，分别在N端有两个连续跨膜区，位于289-311和318-337氨基酸位置；在C端有6个连续跨膜区位于876-898，910-932，947-969，994-1016，1026-1048和1061-1081氨基酸位置。

一种如上所述细胞膜定位罗布麻蛋白的编码序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种融合表达载体，其中，利用如权利要求3所述的编码序列构建。

所述的融合表达载体，其中，利用Pcam35tlerfps2#4-RFP载体和罗布麻蛋白编码序列构建融合表达载体。

所述的融合表达载体，其中，以罗布麻cDNA为模板高保真酶Pfu进行全长扩增；载体Pcam35tlerfps2#4-RFP经XbaI单酶切后获得线性化载体；罗布麻蛋白的编码序列全长片段和线性化载体根据PCR产物回收试剂盒EasyPure PCR Purification Kit的步骤分别进行回收。

一种细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其中，所述应用为利用细胞膜定位罗布麻蛋白定位到细胞膜的应用。

所述的细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其中，利用如上所述的融合表达载体表达的融合蛋白作为细胞膜定位的标记。

有益效果

本发明提供一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用，本发明首次鉴定得到罗布麻AvCESA1基因，并证实AvCESA1蛋白定位在质膜上，构建的融合表达载体可做为其它蛋白质膜定位的标记，以此实现的质膜定位法适用性强，容易操作，试验周期相对较短，且灵敏度高，可实现高通量的蛋白质亚细胞定位。

附图说明

图1为罗布麻AvCESA1基因同源克隆产物片段，其中，泳道1为2 kb Marker，泳道2和3均为同源片段产物。

图2为罗布麻AvCESA1基因5’序列，其中，泳道1为2 kb Marker，泳道2和3均为扩增的5’序列。

图3为罗布麻AvCESA1基因3’序列，其中，泳道1为2 kb Marker，泳道2和3均为扩增的3’序列。

图4为罗布麻AvCESA1与拟南芥AtCESA基因聚类分析结果。

图5为罗布麻AvCESA1基因全长序列，其中泳道1为5 kb Marker，泳道2和3均为扩增的全长序列。

图6为融合表达载体Pcam35tlerfps2#4-AvCESA1-RFP质膜定位RFP荧光标记图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

1.材料、试剂及仪器

1.1 植物材料

本实验用的罗布麻种子采自东营黄河入海口，在植物培养间萌发培养，取4叶期幼苗进行总RNA提取。

1.2 菌株和载体

大肠杆菌感受态菌株Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌感受态GV3101由本实验室保存。RFP荧光标记载体Pcam35tlerfps2#4-RFP由本实验室保存。

1.3 酶试剂及相关试剂盒

限制性内切酶XbaI购自于宝生物工程（大连）有限公司；同源重组快速克隆试剂盒（ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit）、普通PCR Mix（Taq DNA Polymerase Mg2+plus Buffer）购自南京诺维赞生物科技有限公司；植物总RNA提取试剂盒（EasyPurePlantRNA Kit）、反转录试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix）、PCR产物回收试剂盒（EasyPure PCR Purification Kit）、质粒提取试剂盒（EasyPureHiPure Plasmid MaxiPrep Kit）、高保真酶Pfu购于北京全式金生物技术有限公司；RACE末端扩增试剂盒（SMARTer®RACE 5’/3’Kit）购自Takara公司（美国）。实验过程中涉及的其它化学试剂例如蔗糖、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨等均购自国药，为国产分析纯。引物合成及测序工作由青岛睿博生物科技有限公司完成。

1.4 主要实验仪器

PCR扩增仪T100 Thermocycle（Bio-Rad）；自动磨样机（Qiagen TissueLyser II）；Eppendorf-5424离心机；恒温水浴锅；恒温摇床；恒温培养箱；紫外分光光度计（Nanodrop_2000）电泳仪；凝胶成像系统；共聚焦显微镜（Leica SP8）等。

2.罗布麻纤维素合成酶蛋白基因AvCESA1的获取

根据植物总RNA提取试剂盒EasyPure PlantRNA Kit的说明书，提取罗布麻幼苗总RNA，并测定其浓度。根据反转录试剂盒TransScript II First-StrandcDNA SynthesisSuperMix的说明书将获得的罗布麻总RNA反转成cDNA备用。在拟南芥Tair网站（http://www.arabidopsis.org/）上下载拟南芥全部10个CESA基因，利用MEGA6软件进行序列比对，分别在近5’端和近3’端寻找基因高度同源序列区，设计同源扩增引物对：

Hm-F1: CAGCAGATTTTGCTAGGAAATG

HmR1: CAATAACCCAAAACTGTTCGTTT

以罗布麻cDNA为模板，使用高保真酶Pfu进行同源扩增。扩增体系为50 μL，各组分及用量如下：

5×Fast Pfu Fly Buffer 10 µL

dNTPs(2.5 mM) 5 µL

Forward Primer (10 μM) 1.5µL

Revers Primer(10 μM) 1.5 µL

cDNA 2 µL

ddH2O 30 µL

总体积 50µL

扩增条件为：94℃ 3分钟后进入扩增程序：94℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 2分钟, 36个循环后，72℃ 10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后获得一条1.5 kb左右大小的、条带明亮且单一的PCR条带（图1）。PCR产物直接进行测序，获得罗布麻AvCESA1基因部分序列。根据RACE试剂盒SMARTer®RACE 5’/3’Kit的说明书，分别扩增罗布麻AvCESA1基因的5’端和3’端序列。

5’端序列扩增步骤如下：

按照说明书步骤，首先准备5’RACE First-Strand cDNA Synthesis

在冰上配制Mix1备用，各组分和用量如下：

5X First-Strand Buffer 4.0μL

DTT (100 mM) 0.5 μL

dNTPs (20 mM) 1.0μL

总体积 5.5 μL

在冰上配制Mix2备用，各组分和用量如下：

RNA 1.0-10μL

5’-CDS Primer A 1.0μL

Sterile H2O 0-9μL

总体积 11μL

用移液枪混和均匀后离心，72°C孵育3分钟，然后在42 °C条件下冷却2分钟。向Mix2中加入1 μL SMARTer II A Oligonucleotide（24 μM）,冰上放置。

在冰上配制Mix3备用，各组分和用量如下：

Mix1 5.5μL

RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL

SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) 2 μL

总体积 8 μL

然后将全部8 μL Mix3加入Mix2中，混匀离心，42°C孵育90分钟，然后70°C加热10 分钟终止反应，此为5’-RACE-Ready cDNA。

配制5’端PCR扩增体系，各组分和用量如下：

PCR-Grade H2O 15.5μL

2X SeqAmp Buffer 25.0μL

SeqAmp DNA Polymerase 1.0μL

5’-RACE-Ready cDNA 2.5μL

10X UPM 5 μL

5’ GSP (10 μM) 1 μL

总体积 50 μL

其中，5’ GSP根据同源扩增获得的序列，在其近5’端设计反向引物，引物名称和序列如下：

HmR2: AGGCTCTTTCATTGGATCCACT（5’ GSP）

扩增条件为：94℃ 3分钟后进入扩增程序：94℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 2分钟, 36个循环后，72℃ 10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后获得一条1.2 kb左右大小的、条带明亮且单一的PCR条带（图2）。PCR产物直接进行测序，获得罗布麻AvCESA1基因5’部分序列。

3’端序列扩增步骤如下：

首先，对提取的罗布麻幼苗总RNA进行反转录，获得3’-RACE-Ready cDNA，各组分和用量如下：

总RNA 3 µg

3’Oligo (dT)18 Primer (10 μM) 1 µL

2×TS Reaction Mix 1 µL

TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 µL

gDNA Remover 1 µL

RNase-free H2O 补齐至20 µL

总体积 20 µL

将各组分轻轻混匀，42°C孵育30 min后85°C加热5秒失活TransScript RT/RI Enzyme和gDNA Remover，即完成3’-RACE-Ready cDNA的合成。

其中，3’Oligo (dT)18 Primer (10 μM)序列为：GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT

配制3’端PCR扩增体系，各组分和用量如下：

5×Fast Pfu Fly Buffer 10 µL

dNTPs(2.5 mM) 5 µL

3’RACE Primer (10 μM) 1.5µL

3’GSP(10 μM) 1.5 µL

3’-RACE-Ready cDNA 2 µL

ddH2O 30 µL

总体积 50µL

其中，3’ GSP根据同源扩增获得的序列，在其近3’端设计反向引物。引物序列如下：

3’ GSP：CTGGAAAGTTCATTGTTCCTGAG

3’RACE Primer：GACTCGAGTCGACATCGATTTT

扩增条件为：94℃ 3分钟后进入扩增程序：94℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 2分钟, 36个循环后，72℃ 10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后获得一条0.7 kb左右大小的、条带明亮且单一的PCR条带（图3）。PCR产物直接进行测序，获得罗布麻AvCESA1基因3’部分序列。

将三部分序列拼接，最终得到罗布麻AvCESA1基因，基因全长3300个碱基，编码1099个氨基酸。ProtParam预测该基因编码蛋白质的相对分子量为126.58KDa，等电点6.31。本发明中罗布麻AvCESA1蛋白与拟南芥AtCESA2、AtCESA5、AtCESA6和AtCESA9蛋白同源关系最近，氨基酸序列相似性分别为78.8%，76.64%，76.77%和76.86%，聚类到了一个进化分支上（图4）。用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）网站对AvCESA1蛋白的氨基酸序列进行跨膜结构预测发现AvCESA1蛋白具有8个跨膜区，分别在靠近N端位置有两个连续跨膜区（位于289-311和318-337氨基酸位置）；在C端有6个连续跨膜区位于876-898，910-932，947-969，994-1016，1026-1048和1061-1081氨基酸位置），与之前报道的拟南芥CESA蛋白跨膜结构类似，因此推断我们克隆得到的蛋白是一个CESA蛋白。

3.质膜定位融合表达载体Pcam35tlerfps2#4-AvCESA1-RFP的获取

根据上文获得的罗布麻AvCESA1基因序列，设计全长扩增引物如下：

AvCESA1-F：

GGCATGGACGAGCTGTACAAG TCTAGAATGGATACCACTGGAAGGCTG

AvCESA1-R：

CGACCGGCGCTCAGTTGGAAT TCTAGATTACTCACAGTCCAAACCACAA

（斜体部分是和载体Pcam35tlerfps2#4-RFP的同源臂，下划线是酶切位点），以罗布麻cDNA为模板高保真酶Pfu进行全长扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，条带单一明亮（图5）。载体Pcam35tlerfps2#4-RFP经XbaI单酶切后获得线性化载体。AvCESA1基因全长片段和线性化载体根据PCR产物回收试剂盒EasyPure PCR Purification Kit的步骤分别进行回收。连接反应体系为10 μL，各组分及用量如下：

2×Seamless Master Mix 5 µL

线性化Pcam35tlerfps2#4-RFP载体 100 ng

AvCESA1基因片段 100 ng

ddH2O 补齐至10µL

总体积 10µL

用移液枪晃匀并短暂离心后，置于PCR仪中在50 ℃温度下反应15分钟，后立即置于冰上5分钟。连接产物进行大肠杆菌转化。转化步骤如下：

（1）取大肠杆菌Trans1-T1感受态于冰上融化；

（2）取5 μL连接产物加入至50 μL感受态细胞中冰浴30分钟；

（3）42˚C热击45秒，迅速将离心管转移到冰上，冰浴静置5分钟；

（4）加入700 μL灭过菌的液体LB培养基，混匀后置于37˚C摇床，150 rpm震荡培养40分钟，使菌体复苏；

（5）取200 μL已转化的感受态细胞，涂到含有Kan抗性的LB固体培养基上，37˚C倒置培养过夜。

利用引物PV-F和PV-R进行菌落PCR鉴定，序列如下：

PV-F：CTACAACGTCAACATCAAGTTG

PV-R：TTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGC

将菌落PCR 检测呈阳性的单菌落进行测序，序列比对正确后提取质粒，完成表达载体的构建。将构建好的表达载体质粒采用电转化法转入农杆菌GV3101，采用农杆菌浸润法注射本生烟叶片（一般选择长有6-8片真叶的本生烟下部第2-3片叶进行注射），具体方法如下：

（1）-80°C取出带有Pcam35tlerfps2#4-AvCESA1-RFP载体的农杆菌和P19菌液，在含有相应抗生素（Rif+Kan）的LB固体培养基上划线，28°C培养2-3天；

（2）挑取单克隆于6-8 mL液体LB培养基中，28°C条件250 转/分钟过夜振荡培养；

（3）待菌液由暗红转至橙黄时，常温下7000转/分钟离心5分钟，弃上清；

（4）用烟草瞬转重悬液（10 mM MES，10 mM MgCl₂，150 μM乙酰丁香酮）重悬菌液，使目的基因的菌液OD600为0.5，P19菌液OD600为0.3；

（5）将目的基因菌液与P19菌液按照1:1的体积比混合，28°C静置3小时；

（6）用5 mL无针头的注射器吸取农杆菌悬浮液，从叶片背面将悬浮液注入叶片内。用手指抵在叶片正面，稍微用力将叶片堵住注射器的出液口，不让液体从出液口的边缘流出；

（7）将注射过的叶子做上标记，置于培养间正常生长2-3天后用共聚焦显微镜进行荧光观察。

在激光共聚焦显微镜下观察罗布麻AvCESA1 融合蛋白Pcam35tlerfps2#4-AvCESA1-RFP的定位。结果显示该红色融合荧光蛋白定位在质膜上（图6）。该融合蛋白可做为蛋白质细胞膜定位的Marker使用。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种细胞膜定位罗布麻蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的细胞膜定位罗布麻蛋白，其特征在于，其氨基酸序列具有8个跨膜区，分别在N端有两个连续跨膜区，位于289-311和318-337氨基酸位置；在C端有6个连续跨膜区位于876-898，910-932，947-969，994-1016，1026-1048和1061-1081氨基酸位置。

3.一种如权利要求1或2所述细胞膜定位罗布麻蛋白的编码序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种融合表达载体，其特征在于，利用如权利要求3所述的编码序列构建。

5.根据权利要求4所述的融合表达载体，其特征在于，利用Pcam35tlerfps2#4-RFP载体和罗布麻蛋白编码序列构建融合表达载体。

6.一种细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其特征在于，所述应用为利用细胞膜定位罗布麻蛋白定位到细胞膜的应用。

7.根据权利要求6所述的细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其特征在于，利用权利要求4所述的融合表达载体表达的融合蛋白作为细胞膜定位的标记。