CN106892969A - 鸭圆环病毒orf3蛋白核定位nls序列及其应用 - Google Patents
鸭圆环病毒orf3蛋白核定位nls序列及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种核定位信号多肽，其序列是RRLRTCNCRACRTLKH，两倍重复该信号多肽序列，可增加融合蛋白在真核细胞中的表达。
Description
技术领域
本发明涉及鸭圆环病毒ORF3蛋白核定位NLS序列，以及该NLS序列在表达载体领域的应用。
背景技术
将外源基因人工导入细胞的转基因技术是一种重要的技术，不仅仅因为它是一种分析各种生物现象的基本技术，而且因为其在诸如基因治疗和有益动物生产方面的应用。一般而言，转基因有两种方法。一种是利用具有外源基因的病毒的生物学方法，另一种用物理学方法将外源基因导入细胞的物理学方法。
鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)能引起鸭免疫抑制性疾病，感染的鸭子主要表现为羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻，胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏不同程度出血肿胀，淋巴细胞坏死等特征。DuCV于2003年由德国学者Hattermann发现，而后分别在匈牙利、美国、中国台湾地区及中国大陆等地被发现或报道，众多的病原学和血清学的检测表明我国鸭群中DuCV的感染普遍存在，感染率在6％-84％不等。值得注意的是DuCV感染会损害免疫系统，感染DuCV的病鸭常常伴发鸭疫里默氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒等的感染，并且感染鸭圆环病毒后，会显著提高这些病原感染的几率，提示DuCV在鸭传染病混合感染中扮演重要角色。
DuCV为单股环状DNA病毒，DuCV基因组约为1.99kb，编码三种病毒蛋白：Rep、Cap和ORF3蛋白。根据DuCV基因组序列和cap基因序列遗传进化分析，DuCV可划分为基因I型和基因II型2个基因型。ORF3蛋白是申请人于2012年新发现的DuCV病毒蛋白，对分属两基因型的不同DuCV代表毒株的ORF3基因序列进行同源性分析发现，基因I型和II型DuCV的ORF3核酸序列同源性存在较大差异。同基因型DuCV ORF3同源性为92.9％-100％，而基因I型与II型毒株间ORF3同源性仅为77.8％-81.8％。
本发明的目的之一是提供一个系统，该系统可将导入细胞中的基因送入核中。更具体地，本发明的目的是提供一种重组表达载体，其包含NLS序列RRLRTCNCRACRTLKH。
发明内容
对分属两基因型的不同DuCV代表毒株的ORF3基因序列进行同源性分析发现，基因I型和II型DuCV的ORF3核酸序列同源性存在较大差异，进一步分析发现与II型DuCV ORF3基因序列相比，I型毒株的ORF3第236位核苷酸发生T→A突变，密码子TTG(235-237)转变为终止密码子TAG，导致翻译提前终止，C端缺失了20个氨基酸，而此区域富含碱性氨基酸(R,H,K占35％)，提示此区域存在潜在的核定位信号(NLS)。定位分析也发现基因II型DuCV ORF3蛋白定位于细胞核中，而C端差异区域敲除后丧失了胞核定位能力，与基因I型DuCV ORF3蛋白一样，主要定位于胞浆中，说明C端差异区域存在NLS。
将ORF3C端差异区域进行突变，确定了精确的NLS序列:RRLRTCNCRACRTLKH
将C端差异区域的NLS信号与GFP蛋白融合表达，EGFP获得细胞核定位的能力。
本发明提供
(1).一种核定位信号多肽，其序列是RRLRTCNCRACRTLKH。
(2).编码(1)所述多肽的基因。
(3).如(2)所述的基因，其序列是5’-CGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACAT-3’。
(4).一种重组表达载体，包括如(2)或(3)所述的基因。
(5).如(4)所述的重组表达载体，所述基因包括两个拷贝。
(6).如(5)所述的重组表达载体，所述两个拷贝是无间断的连续两个拷贝。
(7).一种多肽在将目标蛋白定位于细胞核中的应用，所述多肽序列为RRLRTCNCRACRTLKH。
附图说明
图1 pEGFP-N3质粒图谱即MCS位点
图2本发明实施例EGFP的核浆表达分布结果
图3不同DuCV毒株ORF3核苷酸序列比对分析
图4不同DuCV毒株ORF3氨基酸序列比对分析
图5 C端差异区域影响ORF3蛋白核浆定位
图6 ORF3蛋白C端突变体质粒构建模式图
图7 C端差异区域NLS具有携带EGFP入核的能力
具体实施方式
核定位信号(NLS)是一段包含多个碱性氨基酸且靶向蛋白细胞核转位的氨基酸序列，在调控蛋白核定位过程发挥非常重要作用。细胞核内复制的病毒会编码多种存在NLS的病毒蛋白进入细胞核，协助完成子代病毒的复制，并影响宿主细胞基因表达、细胞凋亡和细胞周期调控等过程。
病毒与细胞：DuCV-2 WF0701毒株和DuCV-1 FJ0601毒株保存于山东农业大学动物分子病原学实验室，CHO、DF-1细胞购于中国科学院上海细胞保藏中心。
各种抗体：HRP标记山羊抗鸭IgG二抗购自美国KPL公司，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司；抗Flag单克隆抗体(M2)购自Sigma公司；抗DsRed单克隆抗体购自Santa Cruz公司，抗GAPDH单克隆抗体购自美国Protein Tech公司。
各种酶类和试剂：rTaq酶，dNTPs，6bp随机引物购自大连TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；各种限制性内切酶购自Fermentas(MBI)公司：Xfect转染试剂购于clontch公司；DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco公司；质粒DNA大提试剂盒购于Tiangen公司；蛋白质maker购自Fermentas(IVlBI)公司，DNA maker购自Tiangen公司；ECL发光试剂盒购于Pierce公司；二硫苏糖醇(DTT)，蛋白酶抑制剂PMSF、Leupeptin Aprotinin购于Sigma公司。其他普通试剂购自国产试剂公司。
质粒与细菌：真核表达质粒pEGFP-N3购自clotech公司，大肠杆菌DH5a菌种购自Tiangen公司。
实施例1将ORF3C端差异区域进行突变，确定了精确的NLS序列:RRLRTCNCRACRTLKH。
1材料和方法
1.1质粒
pEGFP-N3、pcDNA-FJ-ORF3和pcDNA-WF-ORF3质粒为市售产品或实验室自己制备，将质粒转化大肠杆菌株DH5α，提取质粒DNA，用DNA/RNA定量仪测定DNA浓度，置-20℃保存备用。
1.2主要试剂
Pfu Turbo DNA Polymerase购自Agilent公司；DpnI购自NEB公司；Lipo2000购自invitrogen公司。
1.3 pEGFP-FJ-ORF3和pEGFP-WF-ORF3定位分析
1.3.1基因I型和II型DuCV的ORF3序列分析
I型与II型DuCV ORF3基因序列相比，I型毒株的ORF3第236位核苷酸发生T→A突变，密码子TTG(235-237)转变为终止密码子TAG，导致翻译提前终止(如图3)，C端缺失了20个氨基酸，而此区域富含碱性氨基酸(R,H,K占35％)(如图4)，提示此区域存在潜在的核定位信号(NLS)。
1.3.2 pEGFP-FJ-ORF3、pEGFP-FJ-ORF3ΔC和pEGFP-WF-ORF3质粒构建：用pcDNA-FJ-ORF3和pcDNA-WF-ORF3质粒为模板，PCR扩增FJ-ORF3、FJ-ORF3ΔC和WF-ORF3基因，利用EcoRI和BamHI内切酶将基因克隆入pEGFP-N3载体。
质粒构建引物：
FJ-ORF3-F：CGGAATTCACCATGTCGCATCGGCGAACTGGG
FJ-ORF3-R:CGGGATCCCCTTTGAAGATTATGTTCATGT
FJ-ORF3-ΔC-R:CGGGATCCTCGTCGGAGAGGAAAAGGGCGC
WF-ORF3-F:CGGAATTCACCATGTCGCTTCGGCCAGATCAG
WF-ORF3-R:CGGGATCCTCGTCGGCGAGGAGAAGGGCGC
1.3.3 FJ-ORF3、FJ-ORF3ΔC和WF-ORF3定位分析：
将pEGFP-N3、pEGFP-FJ-ORF3、pEGFP-FJ-ORF3ΔC和pEGFP-WF-ORF3质粒转染DF-1细胞，转染后24h，4％多聚甲醛固定细胞，DAPI染核，进行荧光共聚焦分析，结果如图5所示。
1.4 NLS的精细定位
1.4.1 FJ-ORF3突变体构建：用突变PCR技术将FJ-ORF3C端区域进行缺失突变或点突变，突变PCR体系：Reaction Buffer(10*)5ul，引物(10μM)2ul，dNTP Mix(2.5mM each)4ul，待突变模板质粒0.2μg，用ddH2O补齐至50ul；反应程序：预变性95℃5min，95℃1min，68℃扩增1kb/min，反应18个循环，72℃10min后，4℃保存。扩增完后，每管加DpnI 1ul，37℃酶切1h后，转化DH5a感受态，挑取单克隆送公司测序。测序阳性克隆进行培养，提取质粒。
突变引物序列：
FJ-ORF3-ΔC-F：cccttttcctctccgacgaGGTACCGCGGGCCCGGGA
FJ-ORF3-ΔC-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgtcggagaggaaaaggg
FJ-ORF3-Δ81-98-F：：cctctccgacgattgcgaGGTACCGCGGGCCCGGGA
FJ-ORF3-Δ81-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgcaatcgtcggagagg
FJ-ORF3-R70A-F：ctgaaggtgaggtgtacgcttcgcgcccttttcctctc
FJ-ORF3-R70A-R：gagaggaaaagggcgcgaagcgtacacctcaccttcag
FJ-ORF3-Δ86-98-F：gcgaacttgcaattgtcgaGGTACCGCGGGCCCGGGA
FJ-ORF3-Δ86-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgacaattgcaagttcgc
FJ-ORF3-Δ89-98-F：caattgtcgagcgtgcagaGGTACCGCGGGCCCGGGA
FJ-ORF3-Δ89-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtctgcacgctcgacaattg
FJ-ORF3-Δ92-98-F：gcgtgcagaactctaaaaGGTACCGCGGGCCCGGGA
FJ-ORF3-Δ92-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCttttagagttctgcacgc
R72A-F:gtgaggtgtaccgttcggccccttttcctctccg
R72A-R:cggagaggaaaaggggccgaacggtacacctcac
FJ-ORF3-R77A-F:gcgcccttttcctctcGCacgattgcgaacttgc
FJ-ORF3-R77A-R:gcaagttcgcaatcgtGCgagaggaaaagggcgc
FJ-ORF3-R78A-F:gcccttttcctctccgaGCattgcgaacttgcaat
FJ-ORF3-R78A-R:attgcaagttcgcaatGCtcggagaggaaaagggc
FJ-ORF3-R77/78A-
F:cgcccttttcctctcGCaGCattgcgaacttgcaattg
FJ-ORF3-R77/78A-
R:caattgcaagttcgcaatGCtGCgagaggaaaagggcg
1.4.2 FJ-ORF3突变体定位分析：将FJ-ORF3野生型和突变型表达质粒转染DF-1细胞，转染后24h，4％多聚甲醛固定细胞，DAPI染核，进行荧光共聚焦分析。根据野生型和突变型的核浆定位变化，
定位到FJ-ORF3的精确核定位信号序列：RRLRTCNCRACRTLKH，
对应的核苷酸序列：cgacgattgcgaacttgcaattgtcgagcgtgcagaactctaaaacat
实施例2将C端差异区域的NLS信号与GFP蛋白融合表达，EGFP获得细胞核定位的能力
2.1 pNLS-GFP表达载体的构建及其表达测定
pNLS-GFP质粒构建：合成下面两个引物，斜线标记为NLS序列
引物NLS-F1：
AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG
引物NLS-R1：
GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG
将上下游退火，利用EcoRI和BamHI酶切位点将NLS克隆入pEGFP-N3(质粒图谱如图1所示)载体中，具体试验步骤按照常规试验进行。
2.2 NLS-GFP定位分析
2.2.1荧光试验
1.将飞片放置于培养板中
2.DF-1细胞传代于6孔细胞培养板，3*105细胞/孔
3.37℃培养12h后，用转染试剂脂质体2000分别将2ugpWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3质粒转染入DF-1细胞中
4.转染后24h，弃掉培养基，用PBS洗1-2遍后，用4％多聚甲醛室温固定30min
5.弃去固定液，用PBS洗3次
6.用打孔液(含1％NP40的PBS)室温穿孔10min
7.弃去打孔液，PBS洗3遍
8.用DAPI溶液室温避光孵育5min
9.PBS洗3遍后，将飞片取出用抗荧光淬灭剂进行封片
10.最后用荧光共聚焦扫描显微镜进行观察与分析
2.2.2免疫印迹试验(WB)
1.DF-1细胞传代于6孔细胞培养板，3*105细胞/孔
2.37℃培养12h后，用转染试剂lipofectamine 2000分别将2ug pWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3质粒转染入DF-1细胞中
3.转染后24h，刮取细胞，离心弃上清
4.细胞沉淀用WB及IP细胞裂解液冰上裂解5min，然后12000rpm 4℃离心5min，上清转移至另一新的EP管(当分析蛋白核浆分布时如图7，需分别提取胞浆和胞核蛋白，具体方法参照附件胞浆和胞核蛋白提取试剂盒，本实施例使用的是EnoGeneTMNuclear andCytoplasmic Protein Extraction Kit试剂盒)
5.上清用BCA试剂盒测定蛋白浓度(方法见附件BCA测定蛋白浓度步骤)，并加入蛋白上样缓冲液于100℃煮沸5min
6.取40ug蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，以EGFP单抗和GAPDH单抗为一抗，HRP-羊抗鼠lgG为二抗，ECL化学发光法曝光显色，分析目的蛋白表达变化。(分析核浆定位时，分别提取胞浆和胞核蛋白，用EGFP单抗检测ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作为胞核蛋白内参，GAPDH作为胞浆蛋白内参。目的条带用Image-Pro Plus软件进行灰度分析并用GraphPad软件分析ORF3蛋白胞核胞浆分布比例。
结果如图7所示，其中A:pEGFP-N3和pNLS-EGFP-N3质粒转染DF-1细胞24h后，荧光分析GFP定位变化，可以明显看出pNLS-EGFP-N3质粒转染的细胞，萤光集中于细胞核区；B:pEGFP-N3和pNLS-EGFP-N3质粒转染DF-1细胞24h后，提取胞浆和胞核蛋白，用EGFP单抗检测ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作为胞核蛋白内参，GAPDH作为胞浆蛋白内参，WB分析GFP蛋白核浆分布变化；C:免疫印迹结果的目的条带用Image-Pro Plus软件进行灰度分析并用GraphPad软件分析ORF3蛋白胞核胞浆分布比例。
实施例3不同拷贝数NLS序列的核定位效果
3.1 p2*NLS-GFP以及p3*NLS-GFP表达载体的构建
合成下面两组引物，斜线标记为NLS序列
引物NLS-F2：
AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG
引物NLS-R2：
GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG
引物NLS-F3：
AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG
引物NLS-R3：
GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG
将上下游退火，利用EcoRI和BamHI酶切位点将NLS克隆入pEGFP-N3(质粒图谱如图1所示)载体中，具体试验步骤按照常规试验进行。
3.2 NLS-GFP定位分析以及表达效果分析
3.2.1荧光试验
1.将飞片放置于培养板中
2.DF-1细胞传代于6孔细胞培养板，3*105细胞/孔
3.37℃培养12h后，用转染试剂脂质体2000分别将2ug pEGFP-N3-1*NLS、2ugpEGFP-N3-2*NLS、2ug pEGFP-N3-3*NLS质粒转染入DF-1细胞中
4.转染后24h，弃掉培养基，用PBS洗1-2遍后，用4％多聚甲醛室温固定30min
5.弃去固定液，用PBS洗3次
6.用打孔液(含1％NP40的PBS)室温穿孔10min
7.弃去打孔液，PBS洗3遍
8.用DAPI溶液室温避光孵育5min
9.PBS洗3遍后，将飞片取出用抗荧光淬灭剂进行封片
10.最后用荧光共聚焦扫描显微镜进行观察与分析
3.2.2免疫印迹试验(WB)
1.DF-1细胞传代于6孔细胞培养板，3*105细胞/孔
2.37℃培养12h后，用转染试剂lipofectamine 2000分别将2ug pWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3质粒转染入DF-1细胞中
3.转染后24h，刮取细胞，离心弃上清
4.细胞沉淀用WB及IP细胞裂解液冰上裂解5min，然后12000rpm 4℃离心5min，上清转移至另一新的EP管(当分析蛋白核浆分布时如图7，需分别提取胞浆和胞核蛋白，具体方法参照附件胞浆和胞核蛋白提取试剂盒，本实施例使用的是EnoGeneTMNuclear andCytoplasmic Protein Extraction Kit试剂盒)
5.上清用BCA试剂盒测定蛋白浓度(方法见附件BCA测定蛋白浓度步骤)，并加入蛋白上样缓冲液于100℃煮沸5min
6.取40ug蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，以EGFP单抗和GAPDH单抗为一抗，HRP-羊抗鼠lgG为二抗，ECL化学发光法曝光显色，分析目的蛋白表达变化。(分析核浆定位时，分别提取胞浆和胞核蛋白，用EGFP单抗检测ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作为胞核蛋白内参，GAPDH作为胞浆蛋白内参。目的条带用Image-Pro Plus软件进行灰度分析并用GraphPad软件分析ORF3蛋白胞核胞浆分布比例)
结果如图2所示，免疫印迹结果的目的条带用Image-Pro Plus软件进行灰度分析并用GraphPad软件分析ORF3蛋白胞核胞浆分布比例，图2的结果显示2倍NLS所引导的EGFP蛋白在细胞核中的比例远高于1倍或3倍NLS引导序列。
许多信号通路激活的最终结果都可引起细胞的基因表达发生改变，这通常需要在信号通路被激活时，该级联中的某种蛋白从细胞质移位到细胞核中，通过作用于其下游底物引起特异性的基因转录。真核细胞可以通过多种机制迅速诱导蛋白质从胞质移位入核。影响蛋白质在胞质和胞核中分布主要包括两个因素，即与核转运机器或锚定蛋白的相互作用。对于某种信号蛋白而言，如果其分布于胞质中，且核输入速率低于核输出速率，那么当其与输入受体-输入素的结合增加，与输出受体-输出素的结合降低，或两者同时存在时将迅速移位入核。
蛋白进出细胞核都必须通过NPC，小于50kD的分子能通过核孔自由扩散进出核，而大一些的分子则需要一个NLS。NLS一般具有如下特征：(1)长度一般小于20个氨基酸；(2)在蛋白入核内后不被移除；(3)通常富含带正电的(碱性)氨基酸。除此之外，NLS之间不存在一致的序列。核输入过程可分为三个步骤。首先，位于胞质中的货物(需要移位入核的蛋白质，具有NLS或与具有NLS的蛋白质结合)与输入素结合，形成的货物-输入素复合体，随后被靶向到NPC上。移位过程需要小分子量GTP酶Ran、GTP的参与和生理温度，目前该过程的具体机制尚未阐明。入核后，货物-输入素复合体在Ran GTP与输入素结合后解离。货物在核中被卸下，而输入素返回到胞质中进行下一轮的转运。因而，NLS对于蛋白质移位入核具有重要作用。
Seternes等利用三个串联重复NLS序列与EGFP融合的真核表达载体证实了p38通过与其下游底物MK5的结合和对其的激活来参与其核-胞质分布的调控。本发明人意外地发现两个串联重复的RRLRTCNCRACRTLKH增加了EGFP融合蛋白在细胞核中的表达，对其在重组表达载体中提供了新的用途。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 鸭圆环病毒ORF3蛋白核定位NLS序列及其应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223>根据实验要求而设计，作为质粒构建引物FJ-ORF3-F
<400> 1
cggaattcac catgtcgcat cggcgaactg gg 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223>根据实验要求而设计，作为质粒构建引物FJ-ORF3-R
<400> 2
cgggatcccc tttgaagatt atgttcatgt 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223>根据实验要求而设计，作为质粒构建引物FJ-ORF3-ΔC-R
<400> 3
cgggatcctc gtcggagagg aaaagggcgc 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223>根据实验要求而设计，作为质粒构建引物WF-ORF3-F
<400> 4
cggaattcac catgtcgctt cggccagatc ag 32
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223>根据实验要求而设计，作为质粒构建引物WF-ORF3-R
<400> 5
cgggatcctc gtcggcgagg agaagggcgc 30
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-ΔC-F
<400> 6
cccttttcct ctccgacgag gtaccgcggg cccggga 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-ΔC-R
<400> 7
tcccgggccc gcggtacctc gtcggagagg aaaaggg 37
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ81-98-F
<400> 8
cctctccgac gattgcgagg taccgcgggc ccggga 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ81-98-R
<400> 9
tcccgggccc gcggtacctc gcaatcgtcg gagagg 36
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R70A-F
<400> 10
ctgaaggtga ggtgtacgct tcgcgccctt ttcctctc 38
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R70A-R
<400> 11
gagaggaaaa gggcgcgaag cgtacacctc accttcag 38
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ86-98-F
<400> 12
gcgaacttgc aattgtcgag gtaccgcggg cccggga 37
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ86-98-R
<400> 13
tcccgggccc gcggtacctc gacaattgca agttcgc 37
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ89-98-F
<400> 14
caattgtcga gcgtgcagag gtaccgcggg cccggga 37
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ89-98-R
<400> 15
tcccgggccc gcggtacctc tgcacgctcg acaattg 37
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ92-98-F
<400> 16
gcgtgcagaa ctctaaaagg taccgcgggc ccggga 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-Δ92-98-R
<400> 17
tcccgggccc gcggtacctt ttagagttct gcacgc 36
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物R72A-F
<400> 18
gtgaggtgta ccgttcggcc ccttttcctc tccg 34
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物R72A-R
<400> 19
cggagaggaa aaggggccga acggtacacc tcac 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R77A-F
<400> 20
gcgccctttt cctctcgcac gattgcgaac ttgc 34
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R77A-R
<400> 21
gcaagttcgc aatcgtgcga gaggaaaagg gcgc 34
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R78A-F
<400> 22
gcccttttcc tctccgagca ttgcgaactt gcaat 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R78A-R
<400> 23
attgcaagtt cgcaatgctc ggagaggaaa agggc 35
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R77/78A-F
<400> 24
cgcccttttc ctctcgcagc attgcgaact tgcaattg 38
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223>根据实验要求而设计，作为突变引物FJ-ORF3-R77/78A-R
<400> 25
caattgcaag ttcgcaatgc tgcgagagga aaagggcg 38
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223>根据实验要求而设计，作为引物NLS-F1
<400> 26
aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatg 57
<210> 27
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223>根据实验要求而设计，作为引物NLS-R1
<400> 27
gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatg 57
<210> 28
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(108)
<223>根据实验要求而设计，作为引物NLS-F2
<400> 28
aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatatgc 60
gacgattgcg aacttgcaat tgtcgagcgt gcagaactct aaaacatg 108
<210> 29
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(108)
<223>根据实验要求而设计，作为引物NLS-R2
<400> 29
gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatatgt 60
tttagagttc tgcacgctcg acaattgcaa gttcgcaatc gtcgcatg 108
<210> 30
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(159)
<223>根据实验要求而设计，作为引物引物NLS-F3
<400> 30
aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatatgc 60
gacgattgcg aacttgcaat tgtcgagcgt gcagaactct aaaacatatg cgacgattgc 120
gaacttgcaa ttgtcgagcg tgcagaactc taaaacatg 159
<210> 31
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(159)
<223>根据实验要求而设计，作为引物NLS-R3
<400> 31
gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatatgt 60
tttagagttc tgcacgctcg acaattgcaa gttcgcaatc gtcgcatatg ttttagagtt 120
ctgcacgctc gacaattgca agttcgcaat cgtcgcatg 159
Claims (7)
1.一种核定位信号多肽，其序列是RRLRTCNCRACRTLKH。
2.编码权利要求1所述多肽的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其序列是5’-CGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACAT-3’。
4.一种重组表达载体，包括如权利要求2或3所述的基因。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，所述基因包括两个拷贝。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，所述两个拷贝是无间断的连续两个拷贝。
7.一种多肽在将目标蛋白定位于细胞核中的应用，所述多肽序列为RRLRTCNCRACRTLKH。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710093854.2A CN106892969A (zh) | 2017-02-21 | 2017-02-21 | 鸭圆环病毒orf3蛋白核定位nls序列及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710093854.2A CN106892969A (zh) | 2017-02-21 | 2017-02-21 | 鸭圆环病毒orf3蛋白核定位nls序列及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106892969A true CN106892969A (zh) | 2017-06-27 |
Family
ID=59185614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN201710093854.2A Pending CN106892969A (zh) | 2017-02-21 | 2017-02-21 | 鸭圆环病毒orf3蛋白核定位nls序列及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106892969A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334504A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-26 | 苏州系统医学研究所 | 一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用 |
| CN113491767A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-10-12 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法 |
-
2017
- 2017-02-21 CN CN201710093854.2A patent/CN106892969A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334504A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-26 | 苏州系统医学研究所 | 一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用 |
| CN113491767A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-10-12 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法 |
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Application publication date: 20170627 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |