CN110095421B - 一种胶原蛋白变性温度的测定方法 - Google Patents

一种胶原蛋白变性温度的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶原蛋白变性温度的测定方法，在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；通过本方法来判断胶原蛋白的变性温度，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品品质的检测。与其他检测技术相比，该方法具备操作简单、设备需求小的特点，非常适合作为胶原蛋白变性温度的常规检测手段。

Description

一种胶原蛋白变性温度的测定方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胶原蛋白变性温度的测定方法。
背景技术
胶原蛋白是由三条肽链形成的右手超螺旋纤维状蛋白质，是动物结缔组织中重要的蛋白质。结缔组织因为有较高含量的胶原蛋白，所以具有一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑和保护机体的作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质，使得这类生物高分子化合物的用途非常广泛，遍及医药、化工、食品等领域，其中生物材料与医药方面的应用是目前研究的主要课题。
胶原蛋白的热稳定性随胶原蛋白来源的不同有差异，尤其是目前研究广泛的水产Ⅰ型胶原，其最显著特点就是热稳定性比较低，呈现出鱼种的特异性。其热稳定性与水产动物的生存环境和体温有关，另外还与其亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)的含量有关，尤其是羟脯氨酸含量。因此在提取水产胶原蛋白时更需明确原料中胶原的变性温度并控制提取温度。而目前对胶原蛋白变性温度的测定方法有圆二色谱法、紫外光谱法、傅立叶变换红外光谱法、超灵敏差示扫描量热法、粘度法等，但该类方法操作繁琐且仪器设备需求高，因此对于胶原蛋白变性温度测定同样需要一种简便快捷的测定方法。
发明内容
本发明的目的是要建立一种胶原蛋白变性温度的测定方法，该方法可用于胶原蛋白变性温度的测定，具有操作简单，结果重现性好，特异性强等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种胶原蛋白变性温度的测定方法，在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；
本发明利用胶原蛋白热变性程度与天狼星红染色测得吸光值（OD）存在一定线性关系的特点，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于等量碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出较为准确地胶原蛋白变性温度。其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0。将吸光值下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程OD=a×T+c。将胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，即可计算得到胶原蛋白样品的变性温度，具体计算方法如下：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
一种胶原蛋白变性温度的测定方法具体方法如下：
（1）制备储备液：取待测胶原蛋白原料样品，加入预冷的0.1-1M醋酸溶液于0-10℃下溶解，并装于A瓶中；
（2）分装样品：从A瓶中取等量溶解后样品置于离心管B、C1、C2、C3、C4、……Cn中；
（3）变性处理：B管始终处于0-10℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不被热力破坏； C1、C2、C3、C4、……Cn管分别放入高温水浴处理2-30min后取出，并迅速置于冰水浴中；
（4）染色：步骤（3）中得到的B、C1、C2、C3、C4、……Cn离心管中加入17-600μg/mL的天狼星红染液0.1-5mL，染色1-60min；
（5）离心：等待染色完成后，3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，得到天狼星红-胶原蛋白复合沉淀；
（6）洗涤：再次于得到的天狼星红-胶原蛋白复合沉淀中加入预冷的0.1-1M醋酸溶液0.1-5mL，充分振荡；
（7）离心：3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，收集复合沉淀；
（8）溶解：于收集到的复合沉淀中加入0.1-1M NaOH 0.1-5mL，待沉淀完全溶解后于520-560nm处测定吸光值，并作散点图；
（9）计算变性温度：其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0；将吸光值线性下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程：
OD=a×T+c
（OD：吸光值，T：温度℃）
胶原蛋白变性温度定义为：当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度；
胶原蛋白样品变性温度（Td）的具体计算方法如下：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
进一步的，步骤（1）中胶原蛋白样品包括但不限于鱼皮、鱼鳞、猪皮、牛皮、牛筋腱来源的胶原蛋白。
进一步的，步骤（4）中选用的天狼星红染液包括但不限于单纯以天狼星红为溶质，酸液为溶剂的染液，还包括其他以天狼星红为原料配制的染料。
进一步的，所述步骤（3）设定高温状态的温度及维持时间应根据处理样品不同作具体调整，高温温度为10-70℃。
进一步的，步骤（6）中所使用的酸液包括但不限于醋酸；步骤（8）中所使用的碱液包括但不限于NaOH。
进一步的，所述步骤（9）中的拟合方程和具体计算方法包括但不限于线性拟合方程、多项式拟合方程以及指数拟合方程。
使用上述方法，可以得到以下有益效果：
通过本方法来进行胶原蛋白变性温度的测定，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品品质的检测。该方法能有效的测量不同来源胶原蛋白的变性温度。与其他检测技术相比，该方法由于操作简单、设备需求小的特点，非常适合作为胶原蛋白变性温度的常规检测手段。
该方法的独特之处在本方法适应性广，不仅可以用于检测鱼皮、鱼鳞等来源的胶原蛋白，还可以用于检测其他动物组织如猪皮、牛皮、牛筋腱等来源的胶原蛋白，其检测范围包括但不限于I型胶原蛋白。
该方法的独特之处在于C管高温状态设定的温度及维持时间应根据处理样品不同作具体调整。选用的天狼星红染液包括但不限于单纯以天狼星红为溶质，酸液为溶剂的染液。使用的固液分离手段包括但不限于离心，所使用的酸液包括但不限于醋酸。
该方法的独特之处在于对胶原蛋白变性温度的定义包括但不限于当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度。
附图说明
图1是天狼星红测定胶原蛋白Td流程图。
图2是牛筋腱胶原在不同温度下加热5min后天狼星红法测得吸光值，其中橙色正方形数据点为胶原蛋白天然态，蓝色菱形数据点为过渡态，灰色三角形数据点为变性态。
图3是白鲢鱼皮胶原在不同温度下加热5min后天狼星红法测得吸光值，橙色正方形数据点为胶原蛋白天然态，蓝色菱形数据点为过渡态，灰色三角形数据点为变性态。
具体实施方式
下面结合附图、实施例对本发明做进一步的说明：
如图1-3所示，一种胶原蛋白变性温度的测定方法，在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；
本发明利用胶原蛋白热变性程度与天狼星红染色测得吸光值（OD）存在一定线性关系的特点，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于等量碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出较为准确地胶原蛋白变性温度。其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0。将吸光值线性下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程OD=a×T+c。将胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，即可计算得到胶原蛋白样品的变性温度，具体计算方法如下：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
一种胶原蛋白变性温度的测定方法具体方法如下：
（1）制备储备液：取待测胶原蛋白原料样品，加入预冷的0.1-1M醋酸溶液于0-10℃下溶解，并装于A瓶中；
（2）分装样品：从A瓶中取等量溶解后样品置于离心管B、C1、C2、C3、C4、……Cn中；
（3）变性处理：B管始终处于0-15℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不被热力破坏； C1、C2、C3、C4、……Cn管分别放入高温水浴处理2-30min后取出，并迅速置于冰水浴中；
（4）染色：步骤（3）中得到的B、C1、C2、C3、C4、……Cn离心管中加入17-600μg/mL的天狼星红染液0.1-5mL，染色1-60min；
（5）离心：等待染色完成后，3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，得到天狼星红-胶原蛋白复合沉淀；
（6）洗涤：再次于得到的天狼星红-胶原蛋白复合沉淀中加入预冷的0.1-1M醋酸溶液0.1-5mL，充分振荡；
（7）离心：3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，收集复合沉淀；
（8）溶解：于收集到的复合沉淀中加入0.1-1M NaOH 0.1-5mL，待沉淀完全溶解后于520-560nm处测定吸光值，并作散点图；
（9）计算变性温度：其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0；将吸光值线性下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程：
OD=a×T+c
（OD：吸光值，T：温度℃）
胶原蛋白变性温度定义为：当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度；
胶原蛋白样品变性温度（Td）的具体计算方法如下：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
进一步的，步骤（1）中胶原蛋白样品包括但不限于鱼皮、鱼鳞、猪皮、牛皮、牛筋腱来源的胶原蛋白。
进一步的，步骤（4）中选用的天狼星红染液包括但不限于单纯以天狼星红为溶质，酸液为溶剂的染液，还包括其他以天狼星红为原料配制的染料。
进一步的，所述步骤（3）设定高温状态的温度及维持时间应根据处理样品不同作具体调整，高温温度为10-70℃。
进一步的，步骤（6）中所使用的酸液包括但不限于醋酸；步骤（8）中所使用的碱液包括但不限于NaOH。
进一步的，所述步骤（9）中的拟合方程包括但不限于线性拟合方程、多项式方程以及指数拟合方程。
本发明的工作原理与工作过程如下：
其基本原理为天狼星红染料对未变性的I、II、III、IV型胶原蛋白具有特异性染色，随胶原蛋白的变性，天狼星红对其染色能力下降，通过分光光度计对染色后胶原蛋白样品吸光值进行测定，并通过拟合曲线的计算可较为准确地得到胶原蛋白样品的变性温度。本发明还可以对胶原蛋白的变性程度进行判定，吸光值越高则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性较好。反之，如果吸光值降低，则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性变差；通过本方法来判断胶原蛋白的变性温度，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品品质的检测。与其他检测技术相比，该方法具备操作简单、设备需求小的特点，非常适合作为胶原蛋白变性温度的常规检测手段。
实施例1：
（1）取待测牛筋腱胶原蛋白样品，加入预冷0.5M的醋酸溶液于5℃下溶解置于A瓶中；
（2）于A瓶中取出100mg样品分别放于B、C1-C11管中；B管始终处于5℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不再被热力破坏；
（3）C管分别于25、33、37、38、39、40、41、43、45、50、60℃处理5 min后取出，迅速置于冰水浴中至溶液冷却；该高温状态使得胶原蛋白变性，使得B管与C管形成对比；
（4）于得到的B、C1-C11样品中加入1mL天狼星红染液，并染色30min；
（5）等待染色完成后，12000r/min离心20min，弃去上清液；
（6）再次加入1mL预冷的0.5M醋酸溶液，充分振荡以除去多余染料；
（7）12000r/min离心20min，弃去上清液；
（8）加入1mL 1M 氢氧化钠溶液，待沉淀完全溶解后于550nm处测定吸光值，并作散点图，如图1所示；
（9）其中OD0=1.546，过渡态数据点进行线性拟合得到拟合方程OD=-0.0699T+4.0633。将胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，具体计算方法如下：Td=（90%×1.546-4.0633）÷-0.0699=38.22℃。
实施例2：
（1）取待测白鲢鱼鱼皮胶原蛋白样品，加入预冷0.5M的醋酸溶液于5℃下溶解置于A瓶中；
（2）于A瓶中取出100mg样品于B、C1-C11管中；B管始终处于5℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不再被热力破坏；
（3）C管分别于25、30、31、32、33、34、35、37、39、40、45℃处理5 min后取出，迅速置于冰水浴中至溶液冷却；该高温状态使得胶原蛋白变性，使得B管与C管形成对比；
（4）于得到的B、C1-C11样品中加入1mL天狼星红染液，并染色30min；
（5）等待染色完成后，12000r/min离心20min，弃去上清液；
（6）再次加入1mL预冷的0.5M醋酸溶液，充分振荡以除去多余染料；
（7）12000r/min离心20min，弃去上清液；
（8）加入1mL 1M 氢氧化钠溶液，待沉淀完全溶解后于550nm处测定吸光值，并作散点图，如图2所示；
（9）其中OD0=1.3245，过渡态数据点进行线性拟合得到拟合方程OD= -0.2204 T+8.3717。胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，即可计算得到胶原蛋白样品的变性温度，具体计算方法如下：Td=（90%×1.3245-8.3717）÷-0.2204=32.58℃。
试验结果如附图1、2所示，其中附图1为牛筋腱胶原在不同温度下加热5min后天狼星红法测得吸光值，其中橙色正方形数据点为胶原蛋白天然态，蓝色菱形数据点为过渡态，灰色三角形数据点为变性态，附图2为白鲢鱼皮胶原在不同温度下加热5min后天狼星红法测得吸光值，橙色正方形数据点为胶原蛋白天然态，蓝色菱形数据点为过渡态，灰色三角形数据点为变性态。
在进行变性温度计算时，将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0。将吸光值线性下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程OD=a×T+c。将胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，即可计算得到胶原蛋白样品的变性温度，具体计算方法如下：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
通过本方法来进行胶原蛋白变性温度的测定，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品的性能检测。该方法能有效的测量不同来源胶原蛋白的变性温度。与其他检测技术相比，该方法由于操作简单、设备需求小的特点，非常适合作为胶原蛋白变性温度的常规检测手段。
该方法的独特之处在本方法适应性广，不仅可以用于检测鱼皮、鱼鳞等来源的胶原蛋白，还可以用于检测其他动物组织如猪皮、牛皮、牛筋腱等来源的胶原蛋白，其检测范围包括但不限于I型胶原蛋白。
该方法的独特之处在于C管高温状态设定的温度及维持时间应根据处理样品不同作具体调整。选用的天狼星红染液包括但不限于单纯以天狼星红为溶质，酸液为溶剂的染液。使用的固液分离手段包括但不限于离心，所使用的酸液包括但不限于醋酸。
该方法的独特之处在于对胶原蛋白变性温度吸光值的定义包括但不限于当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，对胶原蛋白变性温度的计算包括但不限于Td=（90%×OD0-c）÷a。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种胶原蛋白变性温度的测定方法，其特征在于：在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；
所述方法具体如下：
（1）制备储备液：取待测胶原蛋白原料样品，加入预冷的0.1-1M醋酸溶液于0-10℃下溶解，并装于A瓶中；
（2）分装样品：从A瓶中取等量溶解后样品置于离心管B、C1、C2、C3、C4、……Cn中；
（3）变性处理：B管始终处于0-10℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不被热力破坏； C1、C2、C3、C4、……Cn管分别放入高温水浴处理2-30min后取出，并迅速置于冰水浴中；
（4）染色：步骤（3）中得到的B、C1、C2、C3、C4、……Cn离心管中加入17-600μg/mL的天狼星红染液0.1-5mL，染色1-60min；
（5）离心：等待染色完成后，3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，得到天狼星红-胶原蛋白复合沉淀；
（6）洗涤：再次于得到的天狼星红-胶原蛋白复合沉淀中加入预冷的0.1-1M醋酸溶液0.1-5mL，充分振荡；
（7）离心：3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，收集复合沉淀；
（8）溶解：于收集到的复合沉淀中加入0.1-1M NaOH 0.1-5mL，待沉淀完全溶解后于520-560nm处测定吸光值，并作散点图；
（9）计算变性温度：其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD0；将吸光值线性下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程如下；
OD=a×T+c
OD：吸光值，T：温度℃;
胶原蛋白变性温度定义包括但不限于当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度；
胶原蛋白样品变性温度Td的具体计算式：
Td=（90%×OD0-c）÷a。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白变性温度的测定方法，其特征在于：步骤（1）中胶原蛋白样品包括但不限于鱼皮、鱼鳞、猪皮、牛皮、牛筋腱来源的胶原蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白变性温度的测定方法，其特征在于：步骤（4）中选用的天狼星红染液包括但不限于单纯以天狼星红为溶质，酸液为溶剂的染液，还包括其他以天狼星红为原料配制的染料。
4.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白变性温度的测定方法, 其特征在于：所述步骤（3）设定高温状态的温度及维持时间应根据处理样品不同作具体调整，高温温度为10-70℃。
5.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白变性温度的测定方法，其特征在于：步骤（6）中所使用的酸液包括但不限于醋酸；步骤（8）中所使用的碱液包括但不限于NaOH。
6.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白变性温度的测定方法，其特征在于：所述步骤（9）中的拟合方程包括但不限于线性拟合方程、多项式拟合方程以及指数拟合方程。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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温度对牛胶原聚集态的影响;王香梅 等;《高分子通报》;20100615;第82-86页 *

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