CN105572208A - 一种鉴定新生牛血清质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定新生牛血清质量的方法，包括以下步骤：按照《中国药典》三部附录的方法对待鉴定样品全检均合格；按《中国药典》三部附录，“蛋白质测定法”中的“Lowry法”检测待鉴定样品中的总蛋白含量；按照《中国药典》三部附录，“电泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”对待鉴定样品进行非还原电泳检测，将电泳结果进行定量扫描分析，计算待鉴定样品中的白蛋白含量；采用香草醛显色法测定待鉴定样品的脂含量；所测总蛋白含量为4.0-4.5g/100ml；白蛋白含量定量扫描结果为1.0~1.5；脂含量为5.5-6.5mg/ml的待鉴定样品为质量合格的新生牛血清。本发明可快速有效的筛选出质量好的新生牛血清，解决了现有筛选方法费时费力的问题。

Description

一种鉴定新生牛血清质量的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定方法，具体涉及一种鉴定新生牛血清质量的方法。

背景技术

现代生物技术的发展离不开细胞培养，培养基的质量是细胞培养的关键。作为细胞培养中用量最大的天然培养基，牛血清含有丰富的细胞生长所必需的营养成分，它不仅为细胞提供贴壁铺展所需的因子，还起着缓冲酸碱度、保护细胞不受伤害、解毒等作用，因此牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。在抗原的生产过程中，常添加新生牛血清进行CHO细胞的生长及表达，若血清质量不好，不仅影响细胞的生长和表达，而且会影响后续纯化收率及抗原原液质量，所以对于新生牛血清的质量控制尤为关键。

新生牛血清是指从出生14小时内未进食的新生牛体上采血，分离血清，并经除菌过滤后制成的犊牛血清，也有人称之为小牛血清。《中华人民共和国药典》(以下简称《药典》)三部附录中规定，新生牛血清的各项检测指标应符合以下标准：①总蛋白含量：3.5％-5.0％；②血红蛋白：不高于0.02％；③大肠杆菌噬菌体：不得有噬菌体污染；④渗透压摩尔浓度：250-400mOsmol/kg；⑤无菌检查：阴性；⑥支原体检查：阴性；⑦细菌内毒素：不高于10EU/ml；⑧病毒检查：阴性；⑨支持细胞增殖检查-(Sp2/0-Ag14)：生长曲线(接种浓度)最大增殖浓度≥1.0×10⁶个/ml，细胞倍增时间≤20h，克隆率≥70％。

但是，仅通过《药典》三部附录中的方法，不能够对新生牛血清质量进行严格精确的控制。例如当一些不法商家将新生牛血清兑水稀释；或使用价格较为低廉、采血牛龄相对较长的牛血清充当新生牛血清；抑或将价格低廉、质量较差的小牛血清掺入到新生牛血清中时，检测结果虽然合格，但实际应用时不仅会影响细胞的增殖和表达，而且对下游纯化的原液质量、介质寿命等均有严重影响，甚至会危害产品使用者的健康和安全。很明显，药典中的检测指标无法准确鉴定新生牛血清是否满足实际使用的要求。

鉴于前述问题，实际使用中对牛血清进行鉴定时采用的传统方法是，在药典规定的检测项目合格的基础上，再使用表达本产品的工作细胞做支持细胞增殖检查，观察细胞的生长周期，绘制生长曲线、计算倍增时间以及统计维持期的表达水平等，以确保新生牛血清质量的准确鉴定。但是这至少需要7天的时间，费时费力，操作繁琐，且由于需要多次细胞计数而易出现因人为因素导致结果不准确、重复性差等问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种鉴定新生牛血清质量的方法，以解决现有鉴定方法操作繁琐、耗时长且鉴定结果准确度低、重复性差的问题。

本发明的目的是这样实现的，一种鉴定新生牛血清质量的方法，包括以下步骤：在按照《中国药典》三部附录的方法对牛血清样品进行各指标全检的基础上，进行总蛋白含量、白蛋白含量以及脂含量的检测；总蛋白含量为4.0-4.5g/100ml；白蛋白含量定量扫描结果为1.0～1.5；脂含量为5.5-6.5mg/ml的待鉴定样品为质量合格的新生牛血清。

本发明方法中，按照《中国药典》三部附录，“蛋白质测定法”中的“Lowry法”检测待鉴定样品中的总蛋白含量。

本发明方法中，按照《中国药典》三部附录，“电泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”对待鉴定样品进行非还原电泳检测，将电泳结果进行定量扫描分析，计算待鉴定样品中的白蛋白含量。

本发明方法中，采用香草醛显色法测定待鉴定样品的脂含量。

本发明方法中，白蛋白含量检测的具体步骤为：

凝胶的配制：分离胶凝胶浓度为15％，浓缩胶凝胶浓度为4.5％；

加样：使用BIO-RADMINI2电泳槽和10孔样品梳；待浓缩胶聚合后拔去样品梳，加入待鉴定样品，每孔加样20μL；

电泳及染色：接通电源，开始电泳；待电泳结束后，使用考马斯亮蓝法过夜染色后，取出脱色，直至凝胶底色几乎无色，得电泳胶片；

扫描及分析：使用BIO-RAD光密度扫描仪GS-800CalibratedDensitometer对所得电泳胶片进行扫描后，使用分析软件“QuantityOne”中的条带分析方法“BandAttributes—TraceQty”进行电泳条带的定量分析，计算血清中的白蛋白含量。

上述测定方法的测定结果与所用试剂、仪器和加样量有关，使用其他不同试剂、仪器或加样量测定的结果经等量换算之后亦可采用上述指标范围来判定样品质量的好坏。

本发明方法中，脂含量检测的具体步骤为：

首先，将待鉴定样品用生理盐水稀释3倍，得到样品待测液；

然后，以橄榄油为标准品，用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的脂含量测定标准溶液，再用乙醇配制浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml的溶液，绘制标准曲线；

接着，吸取样品待测液和标准溶液各500μl于玻璃试管中，各加入2ml硫酸并煮沸10min，室温放置30min使其完全冷却后，再向每试管中加入4ml磷酸—香草醛试剂反应40min；

最后，在530nm测定吸收值并乘以稀释倍数，代入标准曲线中计算待鉴定样品的脂含量。

本发明方法中，还包括评定杂蛋白含量的步骤，通过杂蛋白含量来更进一步确定待鉴定样品的质量，具体步骤为：

选择对照品，选取胎牛血清作为质量好的合格对照品，小牛血清作为质量差的不合格对照品；

杂蛋白检测，按照《中国药典》三部附录，“电泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”对胎牛血清和小牛血清分别进行非还原电泳检测，得到胎牛血清的电泳胶片和小牛血清的电泳胶片；

结果评定，通过电泳胶片上杂蛋白条带的深浅度来评定杂蛋白的含量，杂蛋白条带越深说明该样品中杂蛋白含量越高。杂蛋白条带深浅度的等级划分方法为：将胎牛血清电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度定义为1级，小牛血清电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度定义为4级，将待鉴定清样品电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度在1，2，3，4级之间进行评定，深浅度在1级与4级之间且更接近1级的定义为2级，深浅度在1级与4级之间且更接近4级的定义为3级。在总蛋白含量、脂含量和白蛋白含量均合格的前提下，杂蛋白条带深浅度为1级或2级的牛血清样品为质量好的新生牛血清。

本发明方法可以精确的鉴别出哪些样品是经过稀释的、哪些样品是采血牛龄延长或者掺入其它杂质成分的。若血脂含量、白蛋白含量均较低，且杂蛋白条带较浅，说明此样品较稀，可能为经过稀释后的新生牛血清；若总蛋白含量在正常范围内，但血脂含量、白蛋白含量均较高，杂蛋白条带很深，说明牛龄较长，血清中杂质含量较高。

本发明采用电泳检查法、血脂含量检查法结合原有的总蛋白检查法，能够快速有效的筛选出符合后续使用要求的新生牛血清，解决了现有筛选方法费时费力的问题。

通过本发明方法，可对血清中的主要杂质成分(脂类、杂蛋白等)进行严格控制，这不仅为细胞的生长和表达提供了保障，而且杂质引入量的减少对纯化原液质量的提高、纯化介质寿命的延长均有帮助，从而保证了生物制品的质量，使生物制品使用者的健康安全得到了保障。

本发明方法简单，操作简便，结果准确有效，重复性好，且所用设备均为常规实验设备，便于推广和应用。

附图说明

图1是实施例1中各样品的电泳胶片结果，图中，由左向右依次为新生牛血清、胎牛血清、小牛血清的电泳胶片结果。

图2是实施例2中1#～10#样品的电泳胶片结果。

图3是实施例2中11#～18#样品的电泳胶片结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂为市售分析纯或化学纯。

以下实施例中的牛血清样品是按照《中国药典》三部附录中的方法对其全检均合格的样品。

实施例1

样品：A厂家的经常年使用认定为在细胞培养阶段表现较好和质量较好的新生牛血清；胎牛血清；小牛血清。

所用试剂：

总蛋白含量检测所用试剂：NaOH、NaCl、Na2CO3、CuSO4、酒石酸钾钠(国药化学试剂公司AR)，酚试剂(SIGMAAR),标准品：血清白蛋白(牛)(中国食品药品检定研究院)；

电泳检测所用试剂：30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺37.5:1(翊圣生物)，TEMED(GE)，SDS(SIGMA)，考马斯亮蓝染色液(SIGMA)；

脂含量检测所用试剂：乙醇、硫酸、磷酸、香兰素(国药化学试剂公司AR)。

所用仪器：

紫外分光光度计：PerkinElmerLambda25；电泳槽：BIO-RADMINI2；光密度扫描仪：BIO-RADGS-800CalibratedDensitometer。

按照如下方法对各样品进行测试。

总蛋白含量检测：按《中国药典》三部附录，“蛋白质测定法”中的“Lowry法”检测牛血清样品中的总蛋白含量。

白蛋白含量检测：

凝胶的配制：分离胶凝胶浓度为15％，浓缩胶凝胶浓度为4.5％。

加样：使用BIO-RADMINI2电泳槽和10孔样品梳；待浓缩胶聚合后拔去样品梳，加入牛血清样品，每孔加样20μL。

电泳及染色：接通电源，开始电泳；待电泳结束后，使用考马斯亮蓝法过夜染色后，取出脱色，直至凝胶底色几乎无色。

扫描及分析：使用BIO-RAD光密度扫描仪GS-800CalibratedDensitometer对电泳胶片进行扫描后，使用分析软件“QuantityOne”中的条带分析方法“BandAttributes—TraceQty”进行电泳条带的定量分析，计算血清中白蛋白含量。

脂含量检测：

首先将血清样品用生理盐水稀释3倍，得到牛血清样品待测液；

然后以橄榄油为标准品，用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的脂含量测定标准溶液，再用乙醇配制浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml的溶液，绘制标准曲线；

接着吸取牛血清样品待测液和标准溶液各500μl于玻璃试管中，各加入2ml硫酸并煮沸10min，室温放置30min使其完全冷却后，再于每试管中加入4ml磷酸—香草醛试剂反应40min；

最后在530nm测定吸收值并乘以稀释倍数，代入标准曲线中计算牛血清样品中的脂含量。

检测结果如表1所示，各样品的电泳胶片如图1所示。

表1各样品检测结果

注：表中的白蛋白含量为电泳条带定量扫描结果。

理论上讲，与新生牛血清质量相比，胎牛血清质量更好，而小牛血清质量较差。表1中数据证明，该测定结果准确，与理论相符。

表1中，杂蛋白条带深浅度一栏中的数字表示杂蛋白条带的深浅度，按照由浅至深的顺序依次为1、2、3、4。杂蛋白条带的深浅度可用于表示杂蛋白含量的高低，杂蛋白条带越深说明该样品中杂蛋白含量越高。杂蛋白条带深浅度的等级划分方法为：将胎牛血清的杂蛋白条带的深浅度定义为1级，将小牛血清的杂蛋白条带的深浅度定义为4级，深浅度在1级与4级之间且更接近1级的定义为2级，深浅度在1级与4级之间且更接近4级的定义为3级。

实施例2

牛血清样品：选取国内7个不同厂家的16批牛血清以及选自国外1个厂家的2批牛血清，共计8个厂家18批血清，并从1～18依次进行编号。

所用试剂和仪器同实施例1。

按照如下方法对各样品进行检测：

总蛋白含量检测：同实施例1。

白蛋白及杂蛋白含量检测：

凝胶的配制：分离胶凝胶浓度为15％，浓缩胶凝胶浓度为4.5％。

加样：使用BIO-RADMINI2电泳槽和10孔样品梳；待浓缩胶聚合后拔去样品梳，加入牛血清样品，每孔加样20μL。

电泳及染色：接通电源，开始电泳；待电泳结束后，使用考马斯亮蓝法过夜染色后，取出脱色，直至凝胶底色几乎无色。

扫描及分析：使用BIO-RAD光密度扫描仪GS-800CalibratedDensitometer对电泳胶片进行扫描后，使用分析软件“QuantityOne”中的条带分析方法“BandAttributes—TraceQty”进行电泳条带的定量分析，计算血清中白蛋白含量；并按照实施例1中所说方法评定各样品杂蛋白条带的深浅度。

脂含量检测：同实施例1。

检测结果如表2所示，各样品的电泳胶片分别如图2和图3所示。

表21#～18#样品检测结果

注：表中的白蛋白含量为电泳条带定量扫描结果。

将上述18个牛血清样品用于CHO细胞培养，并对细胞收液进行纯化，观察细胞生长状态及纯化效果。

结果发现：在使用3#、5#样品进行细胞培养时，发现细胞生长较慢、状态不好，不能满足传代时间间隔和传代比例，该两批样品可能为经过稀释后的牛血清。使用7#、8#、9#牛血清样品的细胞收液进行纯化时，发现抗原原液的HPLC谱图有较多杂蛋白峰，说明此四批牛血清的采血牛龄长，杂质含量高。使用17#、18#样品的细胞收液进行纯化时，发现纯化收率和纯化介质寿命均受到严重影响，且抗原原液的HPLC谱图除了有较多小分子蛋白峰以外，抗原峰严重拖尾。而1#、2#、4#、6#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#样品的细胞培养及纯化效果均较优，说明前述样品为质量合格的新生牛血清，这与本发明方法鉴定的结果完全吻合。

Claims (7)

1.一种鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在按照《中国药典》三部附录的方法对牛血清样品进行各指标全检的基础上，进行总蛋白含量、白蛋白含量以及脂含量的检测；总蛋白含量为4.0-4.5g/100ml；白蛋白含量定量扫描结果为1.0~1.5；脂含量为5.5-6.5mg/ml的待鉴定样品为质量合格的新生牛血清。

2.根据权利要求1所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，按照《中国药典》三部附录，“电泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”对待鉴定样品进行非还原电泳检测，将电泳结果进行定量扫描分析，计算待鉴定样品中的白蛋白含量。

3.根据权利要求1所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，采用香草醛显色法测定待鉴定样品的脂含量。

4.根据权利要求2所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，所述白蛋白含量检测包括以下步骤：

凝胶的配制：分离胶凝胶浓度为15%，浓缩胶凝胶浓度为4.5%；

加样：使用BIO-RADMINI2电泳槽和10孔样品梳；待浓缩胶聚合后拔去样品梳，加入待鉴定样品，每孔加样20μL；

电泳及染色：接通电源，开始电泳；待电泳结束后，使用考马斯亮蓝法过夜染色后，取出脱色，直至凝胶底色几乎无色，得电泳胶片；

扫描及分析：使用BIO-RAD光密度扫描仪GS-800CalibratedDensitometer对所得电泳胶片进行扫描后，使用分析软件“QuantityOne”中的条带分析方法“BandAttributes—TraceQty”进行电泳条带的定量分析，计算血清中的白蛋白含量。

5.根据权利要求1所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，还包括评定杂蛋白含量的步骤。

6.根据权利要求5所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，按以下步骤评定杂蛋白含量：

按照《中国药典》三部附录，“电泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”对胎牛血清和小牛血清分别进行非还原电泳检测，将胎牛血清电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度定义为1级，小牛血清电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度定义为4级，将待测牛血清样品电泳胶片上的杂蛋白条带的深浅度在1，2，3，4级之间进行评定，杂蛋白条带深浅度为1级或2级的为质量合格的新生牛血清。

7.根据权利要求3所述的鉴定新生牛血清质量的方法，其特征在于，所述脂含量检测包括以下步骤：

首先，将待鉴定样品用生理盐水稀释3倍，得到样品待测液；

然后，以橄榄油为标准品，用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的脂含量测定标准溶液，再用乙醇配制浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml的溶液，绘制标准曲线；

接着，吸取样品待测液和标准溶液各500μl于玻璃试管中，各加入2ml硫酸并煮沸10min，室温放置30min使其完全冷却后，再向每试管中加入4ml磷酸—香草醛试剂反应40min；

最后，在530nm测定吸收值并乘以稀释倍数，代入标准曲线中计算待鉴定样品的脂含量。