CN110088264A - 贴壁细胞培养基质取样装置 - Google Patents

Abstract

一种用于从贴壁细胞培养生物反应器中无菌地获得贴壁细胞培养基质的物理样品的装置。这使得操作员能够在不污染细胞培养的情况下直接评估例如基质上的细胞密度/融合度。

Description

贴壁细胞培养基质取样装置

政府利益：

无

相关申请：

本申请要求2016年11月9日提交的申请号为62/419613的美国临时专利的优先权，其内容通过引用的方式并入本文。

在先公开：

无

联合研究协议：

不适用

背景技术

本领域教导了使用悬浮或贴壁细胞培养的大规模细胞培养。通常参见Merten，Otto-Wilhelm等人的“用于基因治疗的病毒载体的制造：第1部分——上游处理，第2部分——药物生物处理183-203(2014)”。例如，悬浮细胞培养需要在液体细胞培养基中培养自由漂浮的细胞。替代地，能够培养被附着到微珠(micro-beads)的细胞，这些微珠在培养基中自由漂浮。为了本专利的目，我使用术语“悬浮”细胞培养来涵盖这两种细胞培养方法。

替代地，能够培养被附着到固体基质的细胞，该固体基质是如此大体积或高密度，以至于其不能在细胞培养基中自由悬浮。这种基质例如包括密实合成纤维。替代地，能够使用纸状的纤维片材(其可能被切成较小的片)。

工业上一致的细胞培养通常需要不时地对细胞培养物进行取样，以获得用于分析的细胞样品。从悬浮细胞培养物中获得样品是相对容易的。因为细胞(单独的或在微珠上)悬浮在液体培养基中，所以仅需要取出其中悬浮有细胞的培养基的样品。这能够使用移液管经由生物反应器取样端口来完成。

相比之下，在细胞作为附着物被培养到非悬浮细胞培养基质的情况下，使用移液管只能获得液体细胞培养基的样品，而不能获得其上附着有细胞的基质的样品。因此，虽然能够针对来自细胞培养物的代谢物来评估培养基，但不能直接检查所培养的细胞。

本领域教导了通过将蛋白酶添加到细胞培养基中来获得贴壁细胞的样品。这从基质上移除了附着的细胞，所以细胞在液体培养基中自由漂浮。因此，能够使用移液管来吸取培养基的样品，并获得细胞的样品。然而，蛋白酶会扰乱细胞培养物。此外，通过蛋白酶释放的细胞不能提供某些重要的信息，所述信息例如包括当细胞附着到固体基质时融合程度如何。因此，蛋白酶提供了一种在细胞培养完成之后移除附着的细胞的有效方法，但蛋白酶不是一种可接受的、在贴壁培养过程期间移除贴壁细胞样品的方法。

因此，本领域需要一种在贴壁细胞培养系统中获得附着到非悬浮基质的细胞的样品的方法，其中，人们能够在不显著扰乱或改变剩余(未被取样的)细胞的情况下获得细胞的样品。

我已经研发了一种简单的解决方案。它容易制造。尽管如此，即使在大规模和商业规模的贴壁式生物反应器中，该解决方案也能保持无菌环境。(在本专利中，我使用术语“无菌”来表示没有非期望的微生物。)

发明内容

我的设备包括无菌的取样容器或套(例如无菌取样管)，所述无菌的取样容器或套被无菌地连接到生物反应器细胞培养器皿上的端口。该器皿包含细胞培养基和固体贴壁细胞培养基质。所述无菌套(aseptic housing)包含用于获得附着有贴壁细胞的细胞培养基质的样品的装置。所述无菌套然后被密封并从细胞培养器皿移除，使得：即使在移除所述无菌套之后，该器皿仍保持无菌状态。然后，可以分析所述无菌套中包含的细胞培养基质样品上的贴壁细胞。

附图说明

图1示出了我的取样装置的一个版本(镊子被无菌地容纳在生物反应器取样管中)，并示出了该取样装置的使用方法。

图2示出了我的取样装置的另一个版本(钳子被无菌地容纳在无菌取样袋中)。

图3是根据图1的其中镊子被容纳在取样管中的示例的照片。

图4是示出了镊子被插入到生物反应器器皿中以接近并获得固体细胞培养基质的照片。

图5是示出了操作员操纵被容纳在取样管中的镊子的照片。

图6是示出了所述镊子从生物反应器中获得一块固体细胞培养基质的照片。

具体实施方式

生物反应器、发酵罐和组织培养容器在本文中被称为生物反应器。生物反应器为各种培养的微生物(在本文中被称为细胞)提供合适的生长条件。在大多数情况下，人们只想在生物反应器中培养特定类型的细胞，而任何其它细胞(例如细菌)的生长都是非常不希望的。因此，采用复杂的程序以使生物反应器和所有使用的溶液不受来自环境的细胞污染。

贴壁细胞培养生物反应器器皿包含液体细胞培养基和固体基质，在该液体培养基中，所述固体基质提供了所培养的细胞能够附着并生长的表面。这为贴壁细胞培养提供了封闭的无菌环境。

本领域教导了各种合适的固体基质，所述固体基质能够提供所培养的细胞能够附着于其上的固体支撑物。该基质通常是纤维(因为纤维便宜而均匀)，并且提供了高的表面积与体积之比。本领域教导了该纤维可以是聚合物纤维，例如聚酯或聚丙烯纤维。也可以使用其它纤维，例如硅酸盐或乳酸盐静电纺丝纳米纤维。该基质可以用作密实纤维或松散纤维。

替代地，所述基质可以是片材，基质片材可以是整体的。片材也能够由纤维制成，就像纸是由纤维素纤维制成的一样。在本领域中已知各种贴壁细胞培养基质和“固定床”载体。在我的发明中，它们在很大程度上是可互换的等价物。

用于细胞计数和分析的生物反应器取样在生物加工中是至关重要的。迄今为止，通常已知在固定床生物反应器中的细胞(或在其顶部上生长细胞的载体)的无菌取样是困难的或不可能的。参见上文的Merten等人的著作(2014)。因此，只能通过使用生物量探针，或通过测量溶解在液体培养基中的营养物消耗或代谢物副产物来跟踪和估计细胞的生长。然而，基质载体上的细胞分布仍然是一个未知变量。因此，细胞融合度、实际上贴壁细胞本身还不能被进一步分析。

这对于某些类型的细胞培养来说是一个重要问题。例如，在质粒转染(plasmidtransfection)中，局部细胞密度或融合度是影响转染功效和效率的主要决定因素。代替实际的融合度观察，本领域教导了使用所计算出的平均细胞数目。然而，该平均数目可能无法准确描述细胞的实际生长模式。在局部，细胞不是均匀地散布，而是可能在一个区域中以紧密簇群(tight clumps)的方式生长，而在另一个区域完全不存在。

因此，在本领域中需要一种对细胞附着于其上的固体基质载体进行取样的方法。这将允许更有效的过程优化。例如，通过示出转染混合物被细胞内化(internalized)的良好程度以及转染混合物在何处被细胞内化，能够对转染功效进行精确分析。而且，这使得能够使用一些基于细胞的试验，如蛋白质组学和基因表达分析。因此，固定床生物反应器缺少细胞取样选项已经是工业级生物处理中的一个重大缺陷。

我已经找到了一种简单、经济且准确的解决方案。通过查看图1，可能最容易理解我的发明。

图1示出了我的发明的一个示例的结构和暂时操作。图1示出了填充有液体细胞培养基的贴壁培养生物反应器器皿[1]。该液体培养基中有固体细胞培养基质[2](图1示出了纤维片材的小条)。生物反应器器皿[1]带有一个或多个无菌端口[3]。商用的生物反应器通常具有几个端口，以允许输入新鲜培养基、输出已使用过的培养基、输入新鲜氧气或其它气体等。

至少一个端口被无菌地连接到取样装置套[4]。如图1中所示，该取样装置套是柔性管。替代地，可以使用如图2中所示的无菌袋，该无菌袋具有的可伸缩端[8]，能够通过该可伸缩端[8]将取样装置[5](例如钳子)装入该袋中，然后无菌地密封该袋[4]。替代地，也可以例如使用刚性塑料管或玻璃管。

取样装置套[4]包含固体基质取样装置[5]，该固体基质取样装置[5]能够获得用于贴壁细胞培养的固体基质[2]的样品。例如，图1示出了镊子。图2替代地示出了钳子。也可以替代地使用在末端上带有鱼钩型钩子的杆。替代地，可以使用能够获得用于贴壁细胞培养的固体基质的样品的抽吸装置。

如果使用镊子或钳子，我希望所述套[4]是足够柔性的，以使操作员能够通过操纵该套而简单地手动操纵所述镊子或钳子。如果固体基质取样装置[5]是黑色金属的，则可以使用磁铁[7]以使取样装置[5]在套[4]内移动。

套[4]能够被密封，以使其与生物反应器分离。如果这样，我希望连接到该生物反应器的套端部上的密封件能够容易地被打开，以使操作者能够将镊子从所述开口移开。注意，套[4]能够包括袋，该袋允许用于操作大型工具(例如切割钳)(图2)的扩展空间。

为了制作我的装置，能够组装该套[4]，将取样装置[5]放置在套[4]中，密封该组件，然后通过例如高压灭菌或辐射对该组件进行灭菌。然后，带有取样装置[5]的无菌密封套[4]能够被无菌地附接到生物反应器端口[3]。这可以是在标准商用版本的生物反应器上设置的标准端口。替代地，能够将专门用于基质取样的新端口添加到生物反应器。这样做使得操作者能够继续将现有的标准端口用于他们的预期用途(如培养基输入和输出、气体输入等)。我希望提供多个端口，因为这样使得这些端口在使用之后能够被永久地密封，从而使污染风险最小化。替代地，能够多次重复使用同一端口[3]。

图1还示出了获取固体基质样品的方法。为了获取基质样品，首先将套[4]附接到端口[A]。然后打开端口[B](如果需要)，之后使该取样装置穿过打开的端口[B]，以进入包含固体细胞培养基质[2]的生物反应器内部。该操纵可以借助于磁铁[7]来完成。然后，使用取样装置[5]来获得固体细胞培养基质[2]的样品；如果使用柔性管中的镊子，则能够通过压缩该柔性管以操纵所述镊子来简单地完成此操作。然后，通过例如使用磁铁或操纵所述套，使保持所述固体细胞培养基质[2]样品的取样装置[5]经由打开的端口[C]返回到该套中。然后，将该套从生物反应器密封[6]。然后，可以在不污染生物反应器[1]的情况下将取样装置[5]从套[4]移出。

生物安全性是本发明的一个重要方面。一旦套[4]被从生物反应器[1]密封[6]，则套[4]的包含取样装置[5]和样品[2]的部分能够从端口[3]被完全拆下，并且被输送到层流罩中并在该层流罩中打开，从而使得能够无菌地移除样品[2]。因此，取样的材料不在实验室中被开放地处理。这避免了对取样的材料的开放处理以及伴随的污染风险。此外，如果生物反应器中的材料对操作员造成健康风险，则不允许开放处理样品。

在临床制造运行期间(其中生物反应器正在制作供人类使用的生物产品)，在细胞培养基中不能使用抗生素，生物反应器外壳中不允许有舱口(hatch)，并且良好的制造实践禁止打开该生物反应器。因此，我的发明是从我所面对的这些限制开始的，并尝试弄清楚在不能打开生物反应器且不能在培养基中使用抗生素来防止意外污染的情况下、如何更深入地了解生物反应器中的贴壁细胞培养中发生了什么情况。因此，我开始致力于这一点，其构思是：在商用生物反应器外壳中使用现有端口，以无菌方式对反应器基质进行取样。然而，这些相同的原理也适用于带有专门旨在用于基质取样的附加端口的定制式生物反应器。通常，我的构思是提供一种机制，以在不扰乱整个细胞培养的可行性的情况下无菌地对固体细胞培养基质进行取样。

鉴于我的基本构思，能够容易地制作出其它等效的版本。例如，能够使用带倒钩的金属杆来代替镊子，在该带倒钩的金属杆中，所述倒钩可以捕捉并保留纤维基质样品。该倒钩能够通过外部磁铁被升高和降低。替代地，所述套能够是柔性的塑料片材或塑料袋，在所述塑料片材或塑料袋中，操作员通过该塑料套手动地保持所述杆的远端，从而根据需要来操纵所述杆。

在某些生物反应器中，载体被固定在环形篮(doughnut shaped basket)内。在载体层的顶部上有网状物和顶部格栅，所述网状物和顶部格栅将载体物质压缩到所述篮中。然而，在篮壁和顶部格栅之间有开口，能够使用上文所述的镊子或线方法从该开口对载体床进行取样。在没有这种开口可用的情况下，能够使用切割镊子，以为载体取样创建一个开口。在该应用中，如果取样装置套是由管和袋组成的袋组件(如图2中所示)，这是特别实用的。

示例1

为了测试我的设备，我在标准的iCELLis^TM 500一次性生物反应器中对其进行了评估。我提供了这件产品的照片，如图3-6所示。在取样的准备阶段期间，将取样装置(在本实施例中为镊子)插入(首先是取样尖端)到其直径与生物反应器端口相对应的取样装置套的第一端。这在图3中示出。我使用一根3/4英寸的管子以配合3/4英寸的气体输出端口。在本示例中，我使用了适配器(MPX适配器)，该适配器被放置在该管的第一端。能够密封该管的第二端，或者能够将适配器放置到第二端中。然后我对该取样设备进行高压蒸汽处理，所述取样设备具有适合于所述适配器的盖子(在这种情况下，MPX盖子配合到MPX接头上)。在我对所述设备进行高压蒸汽处理之后，我使用MPX盖子将该套以无菌方式封闭在层流罩内。

在取样时，我在取样期间停止了到反应器中的气流。然后，将取样装置套的第二端焊接到气体输出端口。然后使取样装置向下滑过所述管到端口中。这在图4中示出。利用iCELLis^TM 500生物反应器，然后能够引导该取样装置穿过在生物反应器的固定床篮与顶部格栅之间的开口，使得该取样装置能够从固定床上抓取一个或多个载体。可以使用强磁铁来辅助该过程。可以将润滑脂或乙醇喷射到载体容器中以减少摩擦，除非认为这些对该过程有害。在取样装置容器上使用薄而柔性的材料使得操作员能够手动地操纵容器内的镊子。这在图5中示出。图6演示了成功地获得了一片贴壁细胞培养基质。

然后将该取样装置连同其所保持的载体/基质一起移除，使得取样的材料和该取样装置被从生物反应器中移出并进入所述套中。在本示例中，我提供了足够长的管子的套，用于将原始的管焊接回去。基本上，使取样装置缩回到原始取样装置套中是有利的。然后，该管被密封和/或将新的管焊接到气体输出管线中。

作为最终的结果，镊子和取样载体能够以无菌方式被封闭或密封到取样装置保持管中。我的设备的结构使得人们能够做到这一点，而不会对操作员造成生物安全性风险，也没有污染反应器的风险。

然后，能够将取样装置套管输送到层流罩中并在层流罩中打开，用于载体样品制备和分析。

Claims (17)

1.一种贴壁细胞培养生物反应器，包括：

生物反应器容器，所述生物反应器容器具有限定生物反应器容器外部和生物反应器容器内部的生物反应器容器壁，所述生物反应器容器内部能够无菌地包含液体细胞培养基和用于贴壁细胞培养的固体基质，

所述生物反应器容器壁具有端口，所述端口被布置成贯穿所述生物反应器容器壁，以使所述生物反应器容器外部和所述生物反应器容器内部之间能够连通，

所述端口被无菌地连接到取样装置套，所述取样装置套具有取样装置套外部和取样装置套内部，所述取样装置套被布置在所述端口上，使得所述取样装置套内部能够与所述生物反应器容器内部处于无菌连通，

所述取样装置套内部无菌地容纳固体基质取样装置，所述固体基质取样装置能够获得所述生物反应器容器内部中包含的用于贴壁细胞培养的固体基质的样品，

所述固体基质取样装置被布置在所述取样装置套内部中，由此，所述固体基质取样装置能够无菌地获得所述生物反应器容器内部中包含的用于贴壁细胞培养的固体基质的样品。

2.根据权利要求1所述的生物反应器，其中，所述取样装置选自包括镊子、钳子、抽吸装置以及钩子的组。

3.根据权利要求2所述的生物反应器，其中，所述取样装置套包括管，并且所述取样装置包括镊子。

4.根据权利要求2所述的生物反应器，其中，所述取样装置套包括袋，并且所述取样装置包括异物钳子。

5.根据权利要求1所述的生物反应器，还包括磁铁，所述磁铁被布置在所述取样装置套外部，所述磁铁能够操纵在所述取样装置套内部布置的所述取样装置。

6.根据权利要求1所述的生物反应器，还包括布置在所述生物反应器容器内部与所述取样装置套内部之间的膜。

7.根据权利要求1所述的生物反应器，其中，所述取样装置套能够从所述端口被无菌地拆下。

8.一种用于无菌地获得在生物反应器容器内部中包含的用于贴壁细胞培养的固体基质的样品的设备，所述设备包括：

取样装置套，所述取样装置套具有取样装置套外部和取样装置套内部，所述取样装置套被构造成能够布置在贴壁细胞培养生物反应器的端口上，使得取样装置套内部能够经由所述端口与所述生物反应器容器内部处于无菌连通，

所述取样装置套内部容纳固体基质取样装置，所述固体基质取样装置能够获得在所述生物反应器容器内部中包含的用于贴壁细胞培养的固体基质的样品，

所述固体基质取样装置，所述固体基质取样装置被布置在所述取样装置套内部，由此，所述固体基质取样装置能够无菌地获得在所述生物反应器容器内部中包含的用于贴壁细胞培养的固体基质的样品。

9.根据权利要求8所述的设备，其中，所述取样装置选自包括镊子、钳子、抽吸装置以及钩子的组。

10.根据权利要求9所述的设备，其中，所述取样装置套包括管，并且所述取样装置包括镊子。

11.根据权利要求9所述的生物反应器，其中，所述取样装置套包括袋，并且所述取样装置包括异物钳子。

12.一种用于无菌地获取贴壁细胞培养基质的样品的方法，所述方法包括：

获得权利要求1所述的生物反应器，所述生物反应器容器内部无菌地包含液体细胞培养基和用于贴壁细胞培养的固体基质，然后

使用所述取样装置无菌地获得用于贴壁细胞培养的所述固体基质的样品。

13.一种用于无菌地获取贴壁细胞培养基质的样品的方法，所述方法包括：

获得权利要求7所述的生物反应器，所述生物反应器容器内部无菌地包含液体细胞培养基和用于贴壁细胞培养的固体基质，然后

使用所述取样装置无菌地获得用于贴壁细胞培养的所述固体基质的样品，然后

无菌地将所述取样装置套从所述端口拆下。

14.一种用于生产细胞培养产物的方法，所述方法包括：

获得权利要求1所述的生物反应器，所述生物反应器容器内部无菌地包含液体细胞培养基和用于贴壁细胞培养的固体基质，然后

在所述液体细胞培养基中培养细胞培养物，然后

使用所述取样装置无菌地获得用于贴壁细胞培养的所述固体基质的样品，然后

分析所述样品，以确认所述细胞培养产物的存在。

15.一种用于生产细胞培养产物的方法，所述方法包括：

获得权利要求7所述的生物反应器，所述生物反应器容器内部无菌地包含液体细胞培养基和用于贴壁细胞培养的固体基质，然后

在所述液体细胞培养基中培养细胞培养物，然后

使用所述取样装置无菌地获得用于贴壁细胞培养的所述固体基质的样品，然后

分析所述样品，以确认所述细胞培养产物的存在。

16.通过权利要求14所述的方法获得的细胞培养产物。

17.通过权利要求15所述的方法获得的细胞培养产物。