CN110074112A - 小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用，所述的小分子化合物包括：旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素。一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素中至少两种以上。本发明小分子化合物或其组合物对Xcc 8004的hrp T3SS的表达具有非常明显的抑制作用，几乎能抑制到不表达的程度，同时对生防作用有较好的效果并且不会在寄主植物中抑制病原菌的生长。

Description

小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用。
背景技术
植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。目前对作物病害的治理主要是通过选育、栽培抗性品种和使用化学农药。但是选育、栽培抗性品种主要受抗源不足或地域限制或由于病原物的快速进化变异使抗性品种抗性丧失。化学农药的广泛应用造成环境严重污染，生态遭到破坏，引起有害生物抗药性大增和人畜中毒伤亡。以往的无公害抗菌药物通常是一些抗生素类，而抗生素的长久使用会使细菌逐渐产生抗药性。因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。新型的抗菌药物以T3SS为抗病的重要靶标，以达到抑制T3SS防止病害而又不杀死病原菌的目的，能避免细菌产生抗药性。
十字花科黑腐病菌，也称野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌(Qian,2005)。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等(Rudolph,1993)。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重(Williams,1980)。过敏性反应与致病性基因(hypersensitive reaction and pathogenicity,hrp)所编码的III型分泌系统(type IIIsecretion system,T3SS)及其所释放的III型效应物(type III secretion effectors,T3SE)是十字花科黑腐病菌的关键致病因子。该菌通过III型分泌系统释放毒性效应物因子，与寄主植物发生分子互作，从而引起植物致病或过敏反应。十字花科黑腐病菌hrp基因的表达受植物信号诱导和关键调控蛋白HrpX的控制。然而抑制十字花科黑腐病菌关键致病系统hrp T3SS的物质未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与十字花科黑腐病菌致病相关的小分子化合物或组合物，用于抑制十字花科黑腐病菌hrp III型分泌系统。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用，所述的小分子化合物包括：旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素，其结构式分别如下：
发明所提供的三种小分子化合物筛选自国家小分子化合物库和植物里，都是天然植物提取物，绿色环保，可作为将来新一代生防药物的研究对象。
一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素中至少两种以上。
优选的，一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括旱生香茶菜素G和木糖，所述的旱生香茶菜素G和木糖的质量比为1:6。
优选的，一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括旱生香茶菜素G和香茶菜乙素，所述的旱生香茶菜素G和香茶菜乙素的质量比为1:1。
优选的，一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括木糖或香茶菜乙素，所述的木糖或香茶菜乙素的质量比为6:1。
优选的，一种小分子化合物组合物，所述的组合物包括旱生香茶菜素G、木糖和香茶菜乙素，所述的旱生香茶菜素G、木糖和香茶菜乙素的质量比为1:6:1。
上述所述的小分子化合物组合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述的旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素中之一种及多种在作为制备防治十字花科黑腐病菌农药制剂中的应用。
本发明的小分子化合物或其组合物可以由使用者在使用前经稀释或直接使用。也可由通常的本领域技术人员所公知的加工方法制备为农药上可接受的制剂，即将活性物质与液体溶剂或固体载体混合后，再加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种。
通常农药制剂中活性组分的重量百分含量为总重量的0.1％～90％，较佳的为5％～70％。根据不同的制剂类型，活性组分含量范围有所不同。通常，液体制剂含有按重量计1％～70％的活性物质，较佳地为5％～50％；固体制剂含有按重量计5％～70％的活性物质，较佳地为10％～70％。
本发明的小分子化合物或其组合物，可以按需要加工成任何农药上可接受的剂型，其中较优选的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、悬乳剂、水乳剂、微乳剂或微囊悬浮剂。
本发明的有益效果为：
本发明小分子化合物或其组合物对Xcc 8004的hrp T3SS的表达具有非常明显的抑制作用，几乎能抑制到不表达的程度，同时对生防作用有较好的效果并且不会在寄主植物中抑制病原菌的生长。
附图说明
图1是通过荧光系统验证这三种化合物及其两两组合和三种组合在一起对Xcc8004的III型分泌系统的抑制作用；
图2是添加了三种单独化合物及其组合对Xcc 8004致病力的影响。
图3是对三种化合物及其组合的病斑长度的检测；
图4是叶内生长曲线的检测。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中所用到的材料包括十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株、Xcc8004/0241lux菌株，ΔhrpX/0241lux菌株均为本研究室保存；各种化合物均来自于国家小分子化合物库和植物里，所涉及的植物实验植株有满身红萝卜(Raphanus sativusvar.radicula cv.Manshenhong)成都市种子总公司。
实施例1化合物对三型荧光活性的检测
供试菌株Xcc 8004/0241lux和ΔhrpX/0241lux过夜培养好之后，测定OD600收集菌液，然后用XZM培养基洗涤并重悬菌体先将OD600调至1。按起始菌体OD600＝0.15的浓度转接至XZM培养基中，然后将菌液分装加到96孔板中，每孔加100μL菌液。以DMSO为对照，每个小分子按一定量添加到96孔板中(旱生香茶菜素G和香茶菜乙素均为5μM，木糖终浓度为80μM，三种小分子组合为按它们各自的量分别加至一起)。每个样品3个重复，添加完之后将96孔板盖好，并用封口胶将板的边沿密封好，放到水平摇床中，28℃恒温，600rpm培养20h。测定96孔板的菌体密度OD600，再把菌液转移到96孔生物发光检测板中，每孔加入0.5μL的0.5％的Decanal，使用Synergy H1全功能酶标仪(Biotek)检测发光强度，并计算每个孔Lux酶活的相对值，对数据进行统计学分析。
荧光检测表明，三种化合物均能对III型效应物基因XC_0241有极其显著的抑制作用，两两组合会使这抑制效果更明显，三种加在一起的话更能使XC_0241的受抑制程度达到几乎不表达，和ΔhrpX的XC_0241表达量相当(见图1)。
实施例2致病性的检测
实验所用寄主植物为满身红萝卜苗(种名为Raphanus sativus var.radiculacv.Manshenhong)，所用接种方法为剪叶法。Xcc 8004野生型菌株在28℃下用NYGB培养基进行液体培养15-18h，用添加了一定浓度化合物的NYGB稀释到OD600＝0.001，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5s后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5s，被接种的植物在25-30℃培养10d后观察结果。
致病试验表明，添加了这三种化合物的Xcc 8004与没添加的相比，致病性显著降低(见图2与图3)。而添加了组合的比起三种单独的，效果要更好一点。
实施例3叶内生长曲线的测量
本实验采用的是涂板数菌落法进行检测，选择长势良好，叶片大小基本一致的满身红萝卜进行剪叶接种。每个样品至少接种50片叶子以上，以保证后期实验的采用。接种完之后，分别于第1、3、5、7、9天进行一次采样，随机摘取9片叶子，每3片叶子作为一组，至少3次重复。
每次采样都是每个样品随机取9片大小差不多的叶子，然后分成3组并做好标记，每组3片叶子。采回来的叶子在超净台中使用医用消毒酒精对叶片进行消毒，主要是擦拭掉叶片表面的粉尘物质(拭擦时要小心，尽量轻，避免人为对叶片造成的损伤)。将叶片晾干，再分别将每组叶片放到灭过菌的研钵中并对其进行充分的研磨，一直到研磨液呈现匀浆状。然后加入5mL的NYGB培养基或者灭菌的ddH2O，吸取1mL的研磨液到1.5mL的无菌离心管中，并进行10×梯度稀释(每次的稀释倍数根据取样的天数来确定)。将稀释好的研磨液涂布到含有相应抗生素的平板中，每个样品的每组叶片做3个稀释浓度的重复，每个浓度涂3块板，每块板取100μL的研磨液，分别做好标记。涂板之后将平板放置到28℃培养箱中培养3d，对板上的菌落数进行计数，按公式X＝A×C/5B(A：平板的平均菌落数(个)；B：涂板菌液的体积(ml)；C：稀释的倍数)对每片叶子中的菌落数X进行统计。
通过公式得到的每个样品每天3个浓度平均值的log值当作纵坐标，取样的时间(天数)作为横坐标。绘制细菌在叶内生长的生长曲线(见图4)。
生长试验表明，这三种小分子化合物和其组合在寄主植物叶内的对于Xcc 8004动态生长情况几乎是没有影响，与对照组相比基本没差异。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种小分子化合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用，其特征在于，所述的小分子化合物包括：旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素。
2.一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的组合物包括旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素中两种及以上。
3.根据权利要求2所述的一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的组合物包括旱生香茶菜素G和木糖，所述的旱生香茶菜素G和木糖的质量比为1:6。
4.根据权利要求2所述的一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的组合物包括旱生香茶菜素G和香茶菜乙素，所述的旱生香茶菜素G和香茶菜乙素的质量比为1:1。
5.根据权利要求2所述的一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的组合物包括木糖或香茶菜乙素，所述的木糖或香茶菜乙素的质量比为6:1。
6.根据权利要求2所述的一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的组合物包括旱生香茶菜素G、木糖和香茶菜乙素，所述的旱生香茶菜素G、木糖和香茶菜乙素的质量比为1:6:1。
7.权利要求2所述的小分子化合物组合物在抑制黑腐病菌hrp III型分泌系统中的应用。
8.旱生香茶菜素G、木糖或香茶菜乙素中之一种及多种在作为制备防治十字花科黑腐病菌农药制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的农药制剂选自可湿性粉剂、水分散粒剂、悬乳剂、水乳剂、微乳剂或微囊悬浮剂。
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