CN110066812A - 植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2‑2，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；一种表达载体，它插入了序列表SEQ NO.1所示的基因；所述的植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2‑2提高植物物亚麻酸的含量的应用；以亚麻芥cDNA为模板，利用反转录PCR技术克隆CsFAD2‑2基因；该基因可以能够将植物体内的油酸及亚油酸催化生成亚麻酸，其过表达的转基因植株中亚麻酸含量较野生型植株高1.56倍；为基因工程育种以提高作物亚麻酸含量提供优质的候选基因。

Description

植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2及其在转基因植物中的应用。
背景技术
多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFAs）是指含有两个及两个以上双键，碳原子数为16-22个的直链脂肪酸，其不饱和度与包含的不饱和C=C双键数有关。PUFAs分为ω-6和ω-3两类。其中，ω-3多不饱和脂肪酸对人体代谢及发育有重要的生物学意义。研究表明，人体摄入鱼油或 ω-3 PUFAs 可以有效抑制炎症的发生，产生免疫作用。ω-3多不饱和脂肪酸有利于提升人体内钙的水平，预防骨质流失，骨质疏松症的患者大多是由于体内缺乏必要的脂肪酸，其中，γ-亚麻酸（Gamma linolenic Acid,GLA）尤为重要。同样，摄入GLA可以在一定程度上预防动脉硬化症的产生，其原理是GLA可降低血液中的胆固醇水平。PUFAs的产生需要脂肪酸脱氢酶（fatty acid desaturase，FAD）与脂肪酸延长酶共同作用。而FAD主要包括7种（FAD2、FAD3、FAD4、FAD5、FAD6、FAD7和FAD8），不同的FADs基因在底物、催化机理、亚细胞定位、结构和拷贝数等方面存在差异，它们相互协调共同完成高等植物不饱和脂肪酸的合成。研究发现△12-脂肪酸脱氢酶基因（FAD2）是植物脂肪酸生物合成代谢过程中催化油酸向亚油酸转化的主效酶基因，植物中不饱和脂肪酸的含量与比例都由其直接进行控制。FAD2催化不饱和脂肪酸油酸(18:1△9)生成不饱和脂肪酸亚油酸(18:2△9,12)的主要功能，是通过催化碳链上的C12和C13的脱氢反应实现的。
油脂品质取决于植物油脂中脂肪酸的不饱和程度，因此FAD2基因受到科学家的广泛关注。对FAD2进行基因工程操作，进而调整植物种子中油酸和亚油酸的比例，以改变植物油脂的品质具有广阔前景。目前已在蓖麻、油菜、棉花等作物的相关研究中取得成果。将转化蓖麻FAD2基因的拟南芥突变体进行种子脂肪酸成分分析，结果显示，亚油酸含量下降，表明带有基因补偿的拟南芥蓖麻油酸含量明显提高，改良了蓖麻油脂组成。Wagner等对大豆种子中的FAD2-1基因进行表达调控的遗传操作抑制了其表达，使大豆油中油酸含量增加到了85%以上。利用RNA干扰技术沉默棉籽中的FAD2基因，能使亚油酸含量显著下降，从60%降低到了4%，同时棉籽油中油酸含量从15%增加到77%。研究表明，食用油品质受制于油酸和亚油酸的含量，为人体提供必需脂肪酸。但是，由于人体内缺乏必要的脱氢酶，不能合成亚油酸等基本的脂肪酸，所以只能从日常饮食中摄取。因此通过提高油酸含量，进而提高农作物及食用油的营养及功用价值具有巨大的应用与研究前景。
亚麻芥[Camelina sativa (L.)Crantz]是十字花科植物，也译作亚麻荠，属亚麻芥属（Camelina），与其他油料作物相比，亚麻芥的农艺性状较为优良。其具有较强的抗旱性以及抗病虫害的能力，并且生长过程中需肥量低，这使其作为一种低投入的生物能源材料而备受关注。亚麻芥种子中约含有油脂43%,其中90%以上是对人体有益的多种不饱和脂肪酸，长期食用亚麻芥油可以起到降低血液中低密度脂蛋白及胆固醇的作用，保证机体健康。近年来，随着社会高速发展和生活品质的提高，使市场对植物油脂的需求开始向高品质、保健品转变。因此，亚麻育种亦须向着高品质且更有益于健康的方向发展，深入研究亚麻芥中的脂肪酸脱氢酶，通过基因工程手段调控亚麻芥种子的脂肪酸组成，对改良亚麻芥油的品质具有主要意义。本专利公开了一种植物亚麻酸合成关键酶CsFAD2-2，该酶能够催化油酸及亚油酸合成亚麻酸，以提高植物体内亚麻酸的含量。
发明内容
本发明目的是提供植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2及其应用。
植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
一种表达载体，它插入了序列表SEQ NO.1所示的基因。
所述的植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2提高植物物亚麻酸的含量的应用；
所述的植物为烟草。
本发明提供了植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示；一种表达载体，它插入了序列表SEQ NO.1所示的基因；所述的植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2提高植物物亚麻酸的含量的应用；以亚麻芥cDNA为模板，利用反转录PCR技术克隆CsFAD2-2基因；该基因可以能够将植物体内的油酸及亚油酸催化生成亚麻酸，其过表达的转基因植株中亚麻酸含量较野生型植株高1.56倍；为基因工程育种以提高作物亚麻酸含量提供优质的候选基因。
附图说明
图1 亚麻芥CsFAD2-2基因的PCR检测，M：DNA Marker DL2000；1、2：目的基因PCR产物；
图2 CsFAD2-2植物表达载体构建示意图；
图3 转CsFAD2-2基因植物油脂含量分析。
具体实施方式
实施例1 亚麻芥总RNA的提取
1）冻存的拟南芥材料（50-100mg）在液氮下充分研磨半小时，此时研磨成的细粉呈白色无明显颗粒感；
2）加入适量的RNAiso后匀浆，室温静置5分钟后，12,000g,4℃离心5分钟；
3）将上清转移到新的1.5ml离心管中，加入200ml氯仿，震荡混匀，室温静置5分钟后，12,000g，4℃离心15分钟；
4）将上清液转移到新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10分钟，12,000g，4℃离心10分钟；
5）弃去上层清液，沿离心管壁缓的加入75%的乙醇1ml,轻柔缓慢的颠倒离心管混匀，12,000g，4℃ 离心5分钟后倒掉上层乙醇；
6）抽真空干燥机干燥沉淀2~5分钟，加入50ul的Rnase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存备用。
实施例2 RNA反转录成cDNA第一条链
1.取4 μL的RNA样品作为反转录的模板；
2.依次加入以下各成分：
65℃ 5分钟，然后冰上急冷后加入第二步反应液，成分如下：
30℃反应10分钟，42℃反应45分钟，最后95℃反应5分钟。
实施例3 亚麻芥CsFAD2-2基因的克隆
根据亚麻芥CsFAD2基因（GenBank登录号：JN831156）序列设计扩增编码区的引物，并在引物5'端分别引入Sma I和Sac I酶切位点和保护碱基（CsFAD2-F：5'-CCCCGGGATGGGTGCAGGTGGAAGAAT-3'，CsFAD2-R：5'-CGAGCTCTCATAACTTATTGTTGTACCA -3'）。以亚麻芥cDNA为模板，进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标基因片段。随后将回收片段与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，涂于含50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，挑单克隆进行PCR检测，并对阳性克隆进行测序分析，测序结果见SEQ ID No.1。
实施例4 亚麻芥CsFAD2-2基因植物表达载体的构建及转化烟草
1.表达载体的构建
将克隆质粒与pBI121质粒分别用SmaI与Sac I进行双酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在DNA连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pBI121-CsFAD2-2。将空载体即pBI121-CaMV 35S与pBI121- CsFAD2-2分别转化至农杆菌EHA105中，用于浸染烟草。
2.农杆菌介导的烟草转化
按照叶盘转化法（Horsch et al.1988）进行。农杆菌菌液用灭菌水稀释至106-107cells/mL（一般稀释30倍左右）。取无菌烟草叶片，去掉主脉将叶片切成四方形状，然后将其浸入到稀释后的菌液中，侵染8-10分钟。
1）共培养
取出叶片外植体后在灭菌滤纸上吸干菌液，将其叶表面向下倒置于MS培养基的表面，24°C-25°C暗培养2天；
2）选择培养
将共培养叶片转移到选择分化培养基（含250 mg/L头孢；100 mg/L卡那霉素）上，28°C，每日光照16小时，15-20天换一次培养基；
3）生根培养
当分化的抗性芽长到1 cm左右，切下（最好不带任何愈伤组织）转移到生根培养基上，28°C，每日光照16小时；
4）土壤培养
当根长出约1-3 cm长，且密度较大时，去除封口膜，室温环境中进行炼苗2-3天，取出植株彻底洗净培养基，同时注意尽量减少根的损伤，移入温室土壤中培养。前2-3天需要遮阴培养；
5）烟草的繁种
将转基因烟草播种与人工气候室中，繁种至T2代后，收取种子用于脂肪酸含量分析。
实施例5 转基因烟草种子脂肪酸含量分析
称取2g烟草种子，粉碎后加入4 ml的甲醇/CH2Cl2(1:3)混合溶液，摇匀；恒温在30 ℃以下超声抽提10 min。取出离心管，放于离心机中离心(1800 rpm,10 min)，收集上清液，重复3次；将萃取液在柔和氮气流下吹干；
加入3 mL 6% KOH的甲醇溶液，超声10 min,放置30 min,重复3次，室温放置过夜(瓶盖盖紧)进行碱水解；加入2 mL正己烷，超声10 min,摇匀，震荡离心，弃除上层正己烷萃取液，重复3次。在上述萃取完剩下的溶液中，加入约1 mL 4N的HCl使pH<2,再用2 mL正已烷萃取3次；
将上述萃取液，转移到带盖玻璃管中，用氮气吹干后，加入约2 mL BF3-MeoH,玻璃管上空间冲入氮气后盖盖密闭，于90 ℃下加热2 h；待样品冷却后，加入5% NaCl溶液约1 ml,用2 ml正己烷萃取3次，并将萃取液转移到2 mL进样瓶中，氮气吹干，产物利用ThermoTrace1310气相色谱质谱联用仪分析各样品脂肪酸含量；
结果如图3显示，对照组样品中油酸、亚油酸及亚麻酸含量分别为264.77 mg/kg、344.5567 mg/kg与40.14 mg/kg。转CsFAD2-2基因烟草种子中油酸、亚油酸及亚麻酸含量分别为203.4 mg/kg、287.95 mg/kg与62.433 mg/kg。油酸与亚油酸的含量分别降低了23.2%与16.4%，而亚麻酸含量提高了1.55倍；这说明CsFAD2-2能够催化油酸和亚油酸生成亚麻酸，该酶的应用能够为提高作物亚麻酸的含量提供优质候选基因。

Claims (4)

1. 植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2. 一种表达载体，它插入了序列表SEQ NO.1所示的基因。
3.权利要求1所述的植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2提高植物物亚麻酸的含量的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述的植物为烟草。
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Citations (1)

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CN108795898A (zh) * 2018-06-14 2018-11-13 华中科技大学 一种促进植物种子亚麻酸积累的基因的应用

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