CN110062599A - 利用光源阵列的透射照明成像 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于透射照明成像的方法和系统。在示例性方法中，在井中辐照样品。样品可以包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基。辐照步骤可以利用光源阵列进行，光源产生以彼此不同的取向入射到弯月面上的各个光束的光。可以检测一个或多个图像。可以通过光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自两个或更多子组的光对一个或多个图像的比例贡献，以补偿由弯月面产生的折射并改善对比度。

Description

利用光源阵列的透射照明成像

相关申请

本申请要求2016年12月12日提交的美国申请No.15/375512的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

可以用成像显微镜目测观察支撑在平面基底上的一层生物细胞。显微镜可以设计成执行透射照明成像(trans-illumination imaging)，在透射照明成像中光透射通过细胞到达成像检测器上。可以在细胞成像之前将细胞染色或保持不染色。

通常在多井(multi-well)样品保持器的井中以高处理量形式执行基于细胞的测定。每个井通常具有平坦的底板，一组细胞附接至该平坦的底板。因此，样品保持器提供了空间隔离的隔室阵列，该阵列能够保持细胞组的对应的阵列。可以对该细胞组进行不同处理，例如暴露于不同的化合物，以测试每种处理对细胞组中的至少一个细胞组的影响。例如，细胞组可以用于筛选化合物库的成员以获得期望的生物活性。

低放大率下的透射照明成像可以在执行基于细胞的测定之前、期间和/或之后捕获每个细胞组(可选地为全部细胞组)的相应图像。该成像可以例如读取测定的结果，和/或可以检查或监测细胞的数量、密度、健康、表型等。在一些测定中，重要的是知道井中存在多少细胞。例如，当产生新的细胞系(cell lines)(例如，杂交瘤(hybridomas))时，可以使用成像来验证最初在给定井中仅存在一个细胞。否则，源自井的任何细胞系的克隆纯度是不确定的。然而，图像内的细胞的可视性可能随着它们在井的底板上的位置而变化。需要低放大率下对细胞进行透射照明成像的改进的方法。

发明内容

本公开提供了用于透射照明成像的方法和系统。在示例性方法中，在井中辐照样品。样品可以包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基。辐照步骤可以利用光源阵列进行，光源产生以彼此不同的取向入射到弯月面上的各个光束的光。可以检测一个或多个图像。可以通过光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自两个或更多子组的光对一个或多个图像的比例贡献，以补偿由弯月面产生的折射并改善对比度。

附图说明

图1是现有技术的透射照明成像系统的选定方面的示意性局部剖视图，该系统用仅单个光源所产生的光来辐照样品，其中样品包括生物细胞并被容纳在井中，否则该井是空的，并且示出了中心光线和两条旁侧光线。

图2是如图1中那样取得的图1的现有技术的透射照明成像系统的另一视图，除了向井中添加液体或半固体培养基，以在细胞上方形成弯月面，弯月面不成比例地减少了井下方的物镜对两条旁侧光线的收集。

图3是整体沿着图1的线3-3截取的图1的井的平面图，但是不存在细胞。

图4是根据本公开多个方面的透射照明成像系统的选定方面的示意性局部剖视图，该系统用可独立激励光源阵列所产生的光来辐照图2的样品，其中仅示出了来自每个光源的中心光线。

图5至图7是根据本公开多个方面的图4的透射照明成像系统的示意性局部剖视图，示出了从对应的光源穿过样品到达物镜的旁侧光线、中心光线以及另一旁侧光线。

图8是根据本公开多个方面的具有可独立激励光源阵列的示例性透射照明成像系统的示意图。

图9是根据本公开多个方面的用于图8的成像系统的示例性光学构造的示意图。

图10是根据本公开多个方面的用于图8的成像系统的示例性光源阵列的视图，该图是垂直于由阵列限定的平面取得的。

图11是示出根据本公开多个方面的使用光源阵列的透射照明成像的示例性方法的流程图。

图12至图15是示意性地示出根据本公开多个方面的图11的方法中的辐照步骤与检测步骤之间的示例性关系的时间线，其中辐照步骤包括用于检测单个图像的光源子组的差别激励。

具体实施方式

本公开提供了用于透射照明成像的方法和系统。在示例性方法中，在井中辐照样品。样品可以包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基。辐照步骤可以利用光源阵列进行，光源产生以彼此不同的取向入射到弯月面上的各个光束的光。可以检测一个或多个图像。可以通过光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自两个或更多子组的光对一个或多个图像的比例贡献，以补偿由弯月面产生的折射并改善对比度。

本公开的方法和系统提供了优于现有技术的各种优点。优点可以包括在低放大率(和/或低数值孔径(NA))图像中横跨井的底板具有更高和更均一的对比度。另外或替代地，优点可以包括通过使用不同的激励程序，在不同样品和井构造的情况下具有一致的图像质量。在一些实施例中，用户可以输入用于一个或多个样品参数的值，以允许成像系统为样品选择合适的激励程序。

在以下部分中描述了本公开的其它方面：(I)液体或半固体弯月面对透射照明成像的光学影响，(II)具有弯月面补偿的透射照明成像，(III)用于弯月面补偿的示例性系统构造，(IV)利用光源阵列成像的方法，和(V)选择的实施例。

I.液体或半固体弯月面对透射照明成像的光学影响

该部分解释了液体或半固体弯月面对由现有技术的透射照明成像系统50检测到的图像质量的有害影响；参见图1至图3。

成像系统50可以用于检测容纳在井54中的样品52的透射照明图像。样品可以包括一层生物细胞56，该层生物细胞56布置在井的底板58上且位于成像系统的样品平面60中(参见图1和图3)。一个或多个侧壁62可以从底板58的外周64向上延伸，以完全包围井的中心轴线66。底板58具有包括中心轴线66的中心区域67a、以及包围中心区域并位于侧壁62附近的边缘区域67b。底板和侧壁共同构成了容积部，该容积部用于保持样品52的生物细胞56以及液体或半固体培养基68，其中细胞浸没在该液体或半固体培养基68中。图2中存在培养基，但图1中不存在培养基，以示出由培养基68形成的弯月面70的光学影响。半固体培养基可以包括含水凝胶。因此，培养基可以包括胶凝剂(例如，琼脂、琼脂糖、瓜尔胶或类似物)。

用单个光源74所产生的光72辐照样品52。可以利用至少一个光学元件76将光从光源引导到样品，至少一个光学元件76形成光的光束78，该光束78可以由或可以不由至少一个光学元件准直。示出了光束78的中心光线80和一对旁侧光线82、84。中心光线遵循系统的光轴，而旁侧光线82、84相对于光轴在侧向上偏移。

光72透射通过样品52并由位于样品下游的物镜86收集。物镜将收集到的光聚焦到成像检测器(未示出)上，该成像检测器检测利用收集到的光形成的样品(特别是其细胞)的图像。

物镜86可以具有小的数值孔径(即，小的受光角(acceptance angle)88)，以产生放大率相对低的图像，该图像表示底板58的至少大部分区域。然而，培养基68，特别是弯月面70，的存在可能会不成比例地影响旁侧光线82、84相对于中心光线80而言的收集效果。

图1和图2比较了培养基68的不存在和存在分别如何影响光线80、82和84。在图1中，在没有弯月面的情况下，光线没有被折射并在相应的直线路径上行进通过样品52和井54的底部到达物镜86。(对于该讨论，忽略了由生物细胞56产生的任何折射。)相比之下，在图2中，弯月面70选择性地影响旁侧光线82、84。中心光线80在垂直于弯月面的路径上入射到弯月面上，因此没有被折射。旁侧光线82、84在更靠近井的侧壁的位置处入射到弯月面70上，在该位置处弯月面不是水平的，这导致当每条光线从空气入射到液体时旁侧光线被折射而远离中心光线。结果，旁侧光线不再落在物镜86的受光角88内。因此，检测到的图像在底板的中心区域67a处更亮并且在边缘区域67b处更暗(参见图3)。另外，对比度不会是均一的，而是基于图像检测的持续时间而在中心或旁侧处更好。需要一种产生具有更均一对比度的图像的改进的透射照明成像系统。

样品52可以具有任何合适的性质。样品可以是有机的和/无机的，并且可以包括任何合适的组件、材料、物质、分离物、提取物、颗粒或类似物。在示例性实施例中，样品包括待成像的生物细胞。生物细胞可以是真核细胞或原核细胞，并且可以是活的或死的(例如，固定的)。示例性生物细胞包括已建立的细胞(细胞系)、原代细胞、组织样品的细胞、来自临床样品(例如，血液样品、流体吸出物(fluid aspirate)、组织切片等)的细胞、细菌细胞或类似物。样品还可以包括任何合适的培养基，通常为水性培养基，其可以包括水、盐、缓冲剂、葡萄糖、去污剂、染料、蛋白质、氨基酸或其任何组合，等等。培养基可以是或可以不是用于生物细胞的生长培养基。

样品可以由样品保持器保持，样品保持器是用于保持至少一个样品或任何空间隔离的样品阵列的任何装置。样品保持器可以包括至少一个井。井可以具有任何合适的用于流体的总容量，如小于约10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL、0.2mL或0.1mL，和/或大于约0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL或1mL，等等。井的内径可以是恒定的，或者可以从井的顶部到底板是变化的(例如，可以减小)。如果内径朝向底板减小，则直径可以平滑地、分级地或以其组合的方式减小。在一些实施例中，内径可以线性地或平滑但非线性地减小。井的形状(如在水平横截面中所限定的形状)可以是恒定的，或者可以从井的顶部到底板是变化的。该形状和/或底板的外周可以为圆形、椭圆形、多边形(例如，矩形，如正方形)或类似形状。井可以由任何合适的材料形成，但是聚合物可以是优选的。井的底板和/或侧壁可以涂覆有另一种材料，如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或类似物，以促进细胞粘附。

井可以由具有井阵列的样品保持器(例如，多井板)提供。样品保持器的井可以彼此附接(例如，彼此形成为一体，如通过注射成型形成为一体)，以形成具有水平井阵列的多井样品保持器，井阵列具有基本上共面的底板。样品保持器可以具有任何合适数量的井，如至少或恰好6个、12个、24个、48个、96个或384个井，等等。井可以布置成矩形阵列，如用于具有96个井的多井板的8×12阵列，或用于具有384个井的多井板的16×24阵列。如下面进一步描述的，成像系统可以构造为自动地收集存在于样品保持器的多个井中的每个井内的样品的图像。此外，成像系统可以构造为自动地收集共同代表井的整个底板区域的一个或多个图像。如果井充分地小(例如，384井板的井)，则可以以用于井的单个视场收集这些图像，或者如果井较大，则可以以两个或更多视场(例如，用于96井板的井的四个视场)来收集这些图像。

II.具有弯月面补偿的透射照明成像

该部分描述了光源阵列如何能够补偿液体或半固体弯月面对图像质量的有害影响，参见图4至图7。使用可独立控制的多个光源允许检测具有更均一亮度和对比度的图像。

图4示出了改进的透射照明成像系统90，其用光源94、96、98的阵列92所产生的光来辐照样品52。仅表示了来自每个光源的中心光线100、102、104，其中每个相应光线具有不同长度(长、中或短)的虚线。中心的轴上光源96位于成像系统的光轴106上；来自轴上光源的中心光线102遵循由系统光学器件限定的光轴106到达物镜86。旁侧的轴外光源94、98相对于成像系统的光轴106在侧向上偏移。结果，来自三个光源的中心光线100、102、104以彼此不同的取向入射到弯月面70上。

在图5至图7中对于每个光源单独地示出了这些不同辐照取向的益处。每个图示出了来自各个光束108、110、112的五条光线，这些光束108、110、112利用由光源94、96、98中的仅一个产生的光而形成。每组五条光线包括中心光线100、102、104中的一条和从对应的中心光线偏移的四条旁侧光线。在每个组内，光线可以彼此平行，直到它们被弯月面70差别地折射。图6的光线对应于图2的光线，除了添加两条中间光线之外。这里示出图6是为了与图5和图7进行比较，并且将不再进一步讨论。

图5示出了利用来自光源94的光产生的倾斜光束108。在光束108的左边缘附近的旁侧光线114被折射为法线取向并且垂直于样品平面地穿过样品52并到达物镜86。然而，在光束的右边缘附近的对应的旁侧光线116错过物镜。因此，光束108使井底板(和上面的细胞)的亮度朝向底板的一侧(即，图5中的底板的左侧)偏斜。

图7示出了利用来自光源98的光产生的倾斜光束112。光束112产生类似于光束108的效果，但在相反的方向上。在光束112的右边缘附近的旁侧光线118被折射为法线取向并且垂直于样品平面地穿过样品52并到达物镜86。然而，在光束的左边缘附近的对应的旁侧光线120错过物镜。因此，光束112使井底板(和上面的细胞)的亮度相对于图5中的光束108朝向底板的相反侧偏斜。可以选择和控制来自每个光源的光对检测到的样品图像的比例贡献，以更好地均衡来自井底板(和上面的细胞)的中心区域和旁侧区域的检测光强。

III.用于弯月面补偿的示例性系统构造

该部分描述了具有光源阵列92以实现弯月面补偿的示例性透射照明成像系统130；参见图8至图10。成像系统130在图8和图9中举例示出为仅具有三个光源94、96、98和三条光线100、102、104，如图4所示，但可以具有光源的任何合适数量和布置，如图10中举例示出的。

成像系统130可以包括平台132，以将至少一个样品保持器134支撑在样品平面60中，样品平面60可以是水平的。样品保持器134可以保持容纳在由样品保持器提供的一个或多个井54中的一个或多个样品52。在一些实施例中，样品保持器可以在相应的井中将多个样品在空间上彼此隔离。平台132可以将每个井54的底板支撑在样品平面60中或附近，并且可以在井下方限定窗口(例如，开口)，该窗口对于用于透射照明成像的光的波长而言可以是透射性的。每个样品保持器、井和样品可以具有上文在部分I或本文其它地方描述的特征的任何合适的组合。

成像系统还可以包括各种子系统(可互换地称为模块)，这些子系统彼此协作以提供样品保持器134的每个样品52的透射照明成像。这些子系统可以包括辐照子系统136、检测子系统138、驱动子系统140和控制/处理子系统142。

辐照子系统136可以包括用于产生光的光源阵列92以及用于收集光并将光引导至样品的聚光器144。在图8中标识出阵列92的三个光源94、96、98以及对应的中心光线100、102、104，以便于与图4进行比较。然而，阵列可以包括任何合适数量的光源，如至少4个、5个、6个、8个、10个、15个或20个，等等(例如，参见图10)。阵列的光源中的至少一个子组(例如，每个光源)可以独立于阵列的其它光源被激励。激励包括向光源施加足以引起光的产生(即，打开光源)的电压和/或供应电流，以及可选地，选择或调节所供应的功率水平(例如，电压/电流的量)以从光源产生期望的光强度。换句话说，每个光源(和/或光源的子组)的开/关状态和强度可以独立于其它光源(和/或光源的至少一个其它子组)而改变。可互换地供应至给定光源的功率水平可以称为光源的激励水平。

阵列92可以具有任何合适的特性。其中的光源可以布置成一维、二维或三维阵列。然而，二维阵列可能是优选的，以简化结构并降低冷凝器的复杂性。每个光源可以是相同类型的，可以产生相同波长的光，和/或可以具有相同的最大强度。例如，光源可以是彼此的复制品。每个光源可以通过任何合适的机制产生光，包括电致发光、受激发射、热辐照和/或光致发光，等等。因此，光源可以包括固态器件、激光器、弧光灯或类似物。示例性固态器件包括半导体光源，如发光二极管(LED)、超发光二极管和激光二极管，等等。

聚光器144可以包括布置在光源阵列与样品之间的光路中的任何合适数量的光学元件。光学元件可以是收集、引导和/或聚焦光和/或至少部分地阻挡光的任何装置或结构。光学元件可以通过任何合适的机制起作用，如反射、折射、散射、衍射、吸收和/或滤光，等等。示例性光学元件包括透镜、反射镜、漫射器、光栅、棱镜、滤光器、孔径、掩模、分束器、透射光纤(光纤)和类似物。在一些实施例中，聚光器可以将来自每个光源的光进行准直，以利用来自每个光源的准直光束提供样品的科勒照明(illumination)。

光源阵列和聚光器可以协作以利用多个光束辐照样品，多个光束可以沿着从光源到样品(以及到成像检测器)的光路在任何位置处彼此重叠。每个光束可以利用来自阵列的不同光源的光产生，并且可以具有与其它光束不同的取向。每个光束在弯月面(或样品平面)处的取向可以通过每个光束相对于竖直轴线(或一些其它基准轴线)的角度偏移(或没有角度偏移)以及每个光束围绕聚光器的光轴的旋转位置来限定。独立于其它光束的每个光束可以具有相对于竖直轴线的任何合适的偏移，如0度，或者小于或大于约1度、2度、3度、4度、5度、7度或10度，等等。光束可以共同具有相对于竖直轴线的至少1个、2个、3个或4个不同的角度偏移值。光束可以另外或替代地具有围绕光轴的至少3个、4个或5个不同的旋转位置(例如，参见图10)。

辐照子系统136和检测子系统138可以布置成从样品平面60上方辐照每个样品52并检测在样品平面60下方收集到的光。在其它情况下，成像系统可以具有倒置构造，其中子系统136、138的相对位置被反转，使得从下方发生辐照并且在样品平面上方收集用于检测的光。

检测子系统138可以包括物镜86和成像检测器146。物镜收集穿过井的底板的光并将光聚焦到成像探测器的光敏区域上。为了简化说明，中心光线100、102、104被示出为在样品的下游组合起来，并且在样品下方共同由非虚线竖直箭头表示。物镜86可以包括任何合适数量的光学元件，如安装在壳体中的一组透镜。物镜可以是低放大率物镜(例如，提供不超过约5倍、10倍或20倍的放大率)，并且可以具有不大于约0.4、0.3或0.2等等的数值孔径。

成像检测器是能够检测光在整个检测区域上的空间变化(例如，强度变化)的任何装置。成像检测器可以是阵列检测器，如电荷耦合器件(CCD)传感器、有源像素传感器(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、N型金属氧化物半导体(NMOS)传感器等)，或类似物。成像检测器可以检测图像的像素，如矩形阵列的像素，并且可以被构造为检测彩色图像、灰度(单色)图像或两者。

驱动子系统140可以包括一个或多个驱动机构，以使成像系统130的部件相对于彼此移动。每个驱动机构可以包括马达(例如，伺服马达)和将马达连接到至少一个系统部件的连杆。驱动子系统可以提供平台和物镜相对于彼此(例如，平行于竖直轴线和/或样品平面处的光轴)的运动，以改变平台与物镜之间的距离，这可以将样品的图像聚焦在成像检测器处。驱动子系统的驱动机构可以另外或替代地使平台和光轴在水平平面和/或与样品平面处的光轴垂直的平面中二维地相对于彼此移动，以相对于样品移动视场(例如，选择样品或底板的区域来成像和/或将样品保持器的不同样品(和井)放置在视场中)。

控制/处理子系统142可以与成像系统130的任何合适的装置组合进行通信和/或可以控制上述装置组合的操作。子系统142可以包括处理器148，也称为控制器，其可以是计算机的形式。

处理器148可以控制光源94、96、98的激励，即激励的定时/序列和激励的水平。该激励可以基于从存储在处理器的存储器中的一组预定义成像协议150中选择的成像协议。每个成像协议可以包括激励程序，激励程序限定了在一个或多个辐照间隔期间对于光源的激励的时间间隔(一个或多个)和水平(一个或多个)。成像协议还可以包括检测程序，检测程序指定了相对于光源的激励，成像检测器146对光进行检测的时间段(一个或多个)。每个成像协议可以针对一个或多个样品参数的特定值或值范围进行设计，一个或多个样品参数可以与弯月面的形状和/或位置相关。成像协议可以基于来自用户的关于样品和/或样品保持器的构造的输入由处理器来选择，其中输入经由用户界面152(例如，显示器、键盘、鼠标、触摸屏或其任何组合，等等)传送到处理器。

处理器148可以与成像检测器146进行通信。该通信可以允许处理器控制成像检测器的操作，如基于激励程序控制图像检测相对于光源激励的定时。处理器还可以从成像检测器146接收图像数据并对图像数据进行处理。

成像系统130还具有电源，电源驱动每个器件(例如，每个光源、成像检测器、处理器、驱动机构等)的操作。例如，电源可以是线路电源、电池电源或其组合。

图9示出了实现样品52的柯勒照明的成像系统130的示例性光学构造。该光学构造示出为仅具有三个光源94、96、98，但是在其它实施例中，可以将光从任何合适数量的光源传输到样品。仅描绘了来自光源的中心光线100、102、104。每条光线由平凸透镜160折射、由反射镜162反射、透射通过一对平凸透镜164和166、穿过弯月面70和样品52的细胞56、并由物镜86收集以传输到成像探测器。

图10示出了用于成像系统130的示例性光源模块170。光源模块170形成光源172的阵列92，光源172可以是例如固态光源，如发光二极管(LED)。光源172安装到支撑构件174上，支撑构件174将光源保持在可以限定平面的固定布置中。成像系统的光轴176可以居中地穿过阵列92，如垂直于阵列的平面穿过阵列92。阵列92的用附图标记178标识的中心光源172可以位于光轴176上，或者所有光源可以位于轴外(即，相对于光轴在侧向上偏移)。光源可以布置成任何合适的形状，如圆形/辐射状阵列(如这里所示)、矩形阵列、不规则阵列或类似形状阵列。阵列的形状可以对应于每个井的底板的形状。例如，光源可以布置在以光轴176为中心的一个或多个环中。每个环可以由3个、4个、5个、6个或更多个光源形成。在所描绘的实施例中，阵列92的轴外光源围绕中心的轴上光源178布置在六个光源172的内环180以及十二个光源的外环182中。在一些实施例中，每个环的光源可以作为单元被激励。通过适当选择每个环内光源的数量和间距、环的数量和大小以及来自每个环的光对检测到的图像的比例贡献，可以实现检测到的样品图像的亮度和对比度的所需均一性。

IV.利用光源阵列成像的方法

该部分描述了利用光源阵列进行透射照明成像的示例性方法200，以及用于辐照和图像检测的示例性时间线和构造；参见图11至图15。

图11示出了列出方法200的示例性步骤的流程图。可以使用本公开的任何系统组件和特征以任何合适的顺序和组合来执行图11中呈现的和/或本文其它地方描述的步骤。

可以从用户接收输入，如202所示。输入可以为一个或多个样品参数中的每一个指定相应的值。值可以是字符(一个或多个)、文本字符串、数字和/或类似物。如本文所用，样品参数是与样品相关的任何参数。每个样品参数可以影响弯月面的形状/位置、由弯月面处的气液界面产生的光的折射量、待成像的样品/底板面积的大小和/或类似参数。参数可以描述样品本身，如细胞类型、近似细胞密度(例如，井的底板的覆盖百分比)或类似参数。参数可以另外或替代地描述浸没样品生物细胞的培养基的一方面。培养基的该方面可以涉及培养基的体积、高度、组成、温度和/或类似参数。参数可以另外或替代地涉及容纳样品的样品保持器和/或井。例如，参数可以涉及井的容积、形状和/或高度；井的底板的形状、面积和/或直径；和/或井的侧壁的表面能，如由样品保持器的组成、侧壁上的涂层的组成和/或样品保持器的制造商/型号所反映的；等等。可以通过用户界面(例如，图形用户界面)来接收输入，如部分III中所述。

可以获得成像协议，如204所示。可以基于在步骤202中从用户接收的关于一个或多个样品参数的输入(例如，一个或多个值)来获得成像协议。例如，可以从存储在成像系统处理器的存储器中的一组预定义成像协议中选择成像协议。在一些实施例中，可以利用一个或多个自定义设置来动态地制定成像协议的至少一部分，例如，可以基于来自用户的输入来计算(例如，通过内插或外推)所获得的成像协议的至少一个值。

成像协议可以包括激励程序和检测程序。激励程序产生样品的辐照，如206所示，并且可以在辐照进行时限定以下各项中的一个或多个：(a)光源阵列的每个光源的相应的激励水平(一个或多个)，(b)每个光源被激励期间的时间间隔，(c)用于激励每个光源的脉冲调制(如果有的话)，(d)光源的子组被激励的顺序，如果整个光源阵列不是同时被激励的话，以及(e)在没有光源被激励的激励程序内的激励暂停(如果有的话)。

可以通过用至少一个样品参数的不同值校准成像系统来创建一组激励程序。例如，可以利用井中不同体积的培养基、井中相同体积的培养基的不同组成、不同样品保持器和/或类似情况进行成像测试来执行校准。在利用给定样品构造的示例性校准中，每个光源(或光源的两个或更多子组中的每个子组)可以自激励，并且利用通过每个单独光源(或子组)产生的辐照来检测样品的单独图像。得到的图像将每个光源或光源的子组映射到图像空间中，并允许针对特定样品构造计算每个光源(或光源的子组)的合适比例贡献，以便均衡在整个井底板上检测到的强度。校准可以由制造商或用户执行。

成像协议的检测程序可以限定何时检测一个或多个图像，如208所示。如本文所用，检测图像的步骤可以包括将光检测为二维像素阵列的步骤，以及创建表示像素的信号的步骤。

对于步骤208，检测程序可以限定相对于光源阵列的光源激励由成像检测器进行的一个或多个光检测周期。在一些实施例中，使用单个检测周期，并且可以在相同组的光源(例如，光源阵列的每个光源)保持被激励的同时在检测周期期间检测样品的图像的基本上所有光。如由成像协议的激励程序所限定的，可以在组内以两个或更多不同的激励水平来激励光源的两个或更多子组。一旦光源被激励，可以在检测周期期间，使各个激励水平保持恒定。在其它实施例中，可以在单个检测周期的不同时间或者在产生图像的两个或更多检测周期期间，打开和/或关闭光源阵列的光源的两个或更多不同子组中的每一个子组。例如，可以一起打开光源阵列的所有光源，然后可以首先关闭光源阵列的更中心的光源子组，以选择性地使从井底板的边缘检测到的光的量相对于井底板的中心而言得到增加。作为另一实例，光检测可以仅利用被激励的更中心的光源子组来进行，然后仅利用被激励的更外周的光源子组来进行，反之亦然(见下文)。

检测程序还可以限定将要在步骤208中用相同视场和相同焦点检测的样品的图像的数量，和/或将要执行图像检测的样品的不同视场的数量。可以针对给定视场检测单个图像。换句话说，步骤208可以产生具有样品的均一对比度的图像。替代地且任选地，如210处用虚线所示，可以用相同的视场检测两个或更多图像，然后进行处理以产生单个图像。例如，可以利用光源阵列的各自不同的激励构造来检测对比度不太均一的两个或更多低质量图像，然后进行合并(例如，拼接在一起)，以形成对比度更均一的单个更高质量的图像。例如，利用仅来自光源阵列的一组中心光源的辐照所产生的第一图像可能对于井底板的更中心的区域具有良好的对比度，但在底板的外周附近太暗，而第二图像可能对于底板的外周区域具有良好的对比度，但对于井底板的更中心区域太暗。将两个图像合并可以产生对比度更均一的改善的图像。在一些情况下，可以将利用相同样品和井的不同视场检测到的图像合并，以形成单个图像。

图12至图15显示了时间线，其示意性地示出图11的方法200中的辐照和检测步骤之间的示例性关系。利用光源(用光源94、96、98示意性地示出)的阵列来执行辐照步骤。出于本讨论的目的，光源96表示阵列中的一个或多个相对更中心的光源，并且光源94、98表示阵列中的多个相对更旁侧或更外周的光源。例如，并且参考图10，光源96可以是布置在光轴176上的单个中心光源178、布置在内环180中的一组光源或者它们的组合。另外，光源94、98可以对应于外环182的光源，或者，如果光源96对应于中心光源178，则光源94、98可以对应于内环180(或两个环)。

图12至图15中的每个图示出了执行辐照期间的一个或多个辐照间隔220、222，以及检测图像期间的重叠的检测周期224。辐照间隔可以是相等长度或不等长度。在每个辐照间隔期间被激励(即，被打开且产生光)的光源94、96、98被示出为没有阴影或有阴影，其中阴影线的数量/密度的增加表示较低的激励水平(和因此的较低的强度/辐照通量)。例如，在图15的较早间隔220期间，光源96被较少激励且产生比光源94、98少的光。另外，在图15中，光源94、98在较早间隔220期间比在较晚间隔222期间产生更少的光。在给定辐照间隔期间没有被激励(即，被关闭且不产生光)的光源94、96、98用“X”来标记。例如，在图12中，光源96在较早间隔220期间被打开并且在较晚间隔222期间被关闭。

在图12至图15的每个图中，在检测周期224期间仅检测一个图像。然而，在其它实施例中，可以在每个辐照间隔220、222期间检测相应图像，如图12中的一对虚线检测周期226、228所示。

光源94、96、98的子组230、232可以相对于彼此差别地激励。每个子组可以由仅一个光源或多个光源组成。在图12至图15中，子组230由中心光源96组成，并且子组232由旁侧光源94、98组成。子组的差别激励可以包括时间差别和/或激励水平差别。时间差别可以包括相对于彼此在不同时间打开和/或关闭子组。例如，在图12中，子组230在子组232之前打开，并且当子组232打开时关闭。作为另一实例，在图13中，两个子组230、232同时打开，但是在不同时间关闭(子组230在间隔220结束时关闭，并且子组232在间隔222结束时关闭)。激励水平差别可以在光源打开时建立，并且在辐照步骤期间保持基本恒定，使得仅使用单个辐照间隔(例如，参见图14)。替代地，在辐照步骤期间，可以将至少一个子组的激励水平从较低水平调节到较高水平，或反之亦然，而不关闭子组(例如，子组232在图15中的间隔222的开始处被激励到更高水平)。

V.选择的实施例

该部分将本公开的选择的实施例描述为一系列有编号的段落。

第1段.一种透射照明成像的方法，方法包括：(A)辐照位于井中的样品，样品包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基，辐照步骤利用光源的阵列来执行，光源产生以彼此不同的取向入射到弯月面上的各个光束的光；以及(B)检测一个或多个图像，该一个或多个图像利用各个光束的光形成并表示包括井的底板的外周的至少一部分在内的视场；其中，通过光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自两个或更多子组的光对一个或多个图像的比例贡献，以补偿由弯月面产生的折射并改善对比度。

第2段.根据第1段的方法，其中，辐照步骤包括在彼此不同的时间打开和/或关闭光源的两个或更多子组以至少部分地产生两个或更多子组的差别激励的步骤。

第3段.根据第1或2段的方法，其中，辐照步骤包括将不同的功率水平供应至光源的两个或更多子组中的每个子组以至少部分地产生两个或更多子组的差别激励的步骤。

第4段.根据第1至3段中任一段的方法，其中，光源的两个或更多子组包括第一子组和第二子组，并且第一子组居中地定位在阵列中，且第二子组在阵列中定位在旁侧。

第5段.根据第1至4段中任一段的方法，其中，光源的阵列包括第一光源和第二光源，底板具有边缘区域和中心区域，并且检测步骤包括如下步骤：对于边缘区域和中心区域的每单元面积，检测到的从第一光源通过边缘区域的光比通过中心区域的光更多，并且检测到的从第二光源通过中心区域的光比通过边缘区域的光更多。

第6段.根据第1至5段中任一段的方法，其中，在一个或多个图像的图像检测期间，各个光束中的第一光束比辐照底板的旁侧区域更强烈地辐照底板的中心区域，并且各个光束中的第二光束比辐照底板的中心区域更强烈地辐照旁侧区域。

第7段.根据第1至6段中任一段的方法，其中，各个光束包括第一光束和第二光束，并且第一光束以比第二光束更竖直的取向入射到弯月面上。

第8段.根据第1至7段中任一段的方法，进一步包括利用物镜收集光的步骤，物镜位于样品与成像检测器之间的光路中，其中，各个光束中的至少一个光束取向为使得：在其它一切都相同的情况下，与不存在弯月面时收集到的来自至少一个光束的光量相比，在收集步骤期间由于存在弯月面而收集到更多的来自至少一个光束的光量。

第9段.根据第8段的方法，其中，至少一个光束取向为使得：在其它一切都相同的情况下，如果去除弯月面，则至少一个光束中的大部分将错过物镜。

第10段.根据第1至9段中任一段的方法，进一步包括利用物镜收集光的步骤，物镜位于样品与成像检测器之间的光路中，其中，物镜限定用于收集光的受光角，并且各个光束中的至少一个光束相对于竖向以比受光角的一半大的角度偏移入射到弯月面上。

第11段.根据第1至10段中任一段的方法，进一步包括利用物镜收集光的步骤，物镜位于样品与成像检测器之间的光路中，其中，利用数值孔径不大于约0.3的物镜来执行收集光的步骤。

第12段.根据第1至11段中任一段的方法，其中，视场包括底板的整个外周。

第13段.根据第1至12段中任一段的方法，其中，在检测步骤期间检测仅一个图像，光源的阵列包括第一光源和第二光源，辐照步骤包括将第一功率水平供应至第一光源并将第二功率水平供应至第二光源的步骤，并且第一功率水平和第二功率水平彼此不同，并且任选地，第一功率水平以第一电流为特征，第二功率水平以第二电流为特征，且第一和第二电流彼此不同。

第14段.根据第13段的方法，其中，在检测仅一个图像时，来自光源的阵列中的每个光源的辐照通量基本上是恒定的。

第15段.根据第1至14段中任一段的方法，其中，在检测步骤期间检测仅一个图像，并且在相对于检测步骤的开始和结束的中间时间点改变光源的两个或更多子组中的至少一个子组的激励。

第16段.根据第15段的方法，其中，在检测步骤的一部分期间，两个或更多光源中的仅一个子组产生光，并且在检测步骤的另一部分期间，光源中的仅第二子组或所有光源产生光。

第17段.根据第1至16段中任一段的方法，其中，检测步骤包括检测两个或更多图像的步骤，方法进一步包括对两个或更多图像进行处理以从两个或更多图像形成单个图像的步骤。

第18段.根据第17段的方法，其中，与两个或更多图像中每一个单独的对比度相比，单个图像具有更好的对比度。

第19段.根据第17段的方法，其中，对于两个或更多图像中的每一个的检测而言，光源的激励是不同的。

第20段.根据第1至19段中任一段的方法，进一步包括从用户接收样品参数的输入的步骤，其中，辐照步骤包括基于输入差别地激励光源的两个或更多子组的步骤。

第21段.根据第20段的方法，其中，样品参数与形成弯月面的培养基有关。

第22段.根据第21段的方法，其中，样品参数涉及培养基的体积、高度和/或组分。

第23段.根据第20至22段中任一段的方法，进一步包括从一组预定义激励程序中选择用于辐照步骤的激励程序的步骤，一组预定义激励程序各对应于样品和/或井的不同构造，其中，利用处理器来执行选择步骤。

第24段.一种用于透射照明成像的系统，包括：(A)多井样品保持器，其包括多个井，多个井中的一个井具有底板并容纳有样品，样品包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基；(B)平台，其支撑样品保持器；(C)辐照子系统，其包括光源的阵列，光源中的至少一个相对于系统的光轴在侧向上偏移，光源构造为产生以彼此不同的取向入射到弯月面上的各个光束的光；(D)物镜，其收集光；(E)成像检测器，其构造为检测一个或多个图像，一个或多个图像利用收集到的光形成并表示包括底板的外周的至少一部分在内的相同视场；以及(F)处理器，其构造为通过光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自两个或更多子组的光对一个或多个图像的比例贡献，以补偿由弯月面产生的折射并改善对比度。

上述公开内容可以涵盖具有独立效用的多个不同发明。尽管已经以其优选形式(一个或多个)公开了这些发明中的每一个，但是如本文所公开和说明的本发明的具体实施例不应被视为具有限制意义，因为许多变化是可能的。发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或性质的所有新的和非显而易见的组合和子组合。以下权利要求特别指出了被视为新的和非显而易见的某些组合和子组合。在要求来自该申请或相关申请的优先权的申请中可以要求保护在特征、功能、元件和/或性质的其它组合和子组合中体现的发明。这些权利要求，无论是针对不同的发明还是针对相同的发明，以及与原始权利要求的范围相比无论是否更宽、更窄、相同还是不同，也被认为包括在本公开的发明的主题内。此外，除非另有具体说明，否则用于所识别元件的诸如第一、第二或第三的序数指示符用于在元件之间进行区分，并且不指示这些元件的特定位置或顺序。

Claims (21)

1.一种透射照明成像的方法，所述方法包括：

辐照位于井中的样品，所述样品包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体的培养基，辐照步骤利用光源的阵列来执行，所述光源产生以彼此不同的取向入射到所述弯月面上的各个光束的光；以及

检测一个或多个图像，所述一个或多个图像利用所述各个光束的所述光形成并表示包括所述井的底板的外周的至少一部分在内的视场；

其中，通过所述光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自所述两个或更多子组的光对所述一个或多个图像的比例贡献，以补偿由所述弯月面产生的折射并改善对比度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐照步骤包括在彼此不同的时间打开和/或关闭所述光源的所述两个或更多子组以至少部分地产生所述两个或更多子组的所述差别激励的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐照步骤包括将不同的功率水平供应至所述光源的所述两个或更多子组中的每个子组以至少部分地产生所述两个或更多子组的所述差别激励的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光源的所述两个或更多子组包括第一子组和第二子组，并且所述第一子组居中地定位在所述阵列中，且所述第二子组在所述阵列中定位在旁侧。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光源的阵列包括第一光源和第二光源，所述底板具有边缘区域和中心区域，并且检测步骤包括如下步骤：对于所述边缘区域和所述中心区域的每单元面积，检测到的从所述第一光源通过所述边缘区域的光比通过所述中心区域的光更多，并且检测到的从所述第二光源通过所述中心区域的光比通过所述边缘区域的光更多。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，对于相同井的两个或更多不同视场中的每一个视场，执行检测一个或多个图像的步骤，所述方法进一步包括将对应于不同视场的图像合并以形成表示所述井的整个底板的单个图像的步骤。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述各个光束包括第一光束和第二光束，并且所述第一光束以比所述第二光束更竖直的取向入射到所述弯月面上。

8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括利用物镜收集光的步骤，所述物镜位于所述样品与成像检测器之间的光路中，其中，所述物镜限定用于收集光的受光角，并且所述各个光束中的至少一个光束相对于竖向以比所述受光角的一半大的角度偏移入射到所述弯月面上。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括利用物镜收集光的步骤，所述物镜位于所述样品与成像检测器之间的光路中，其中，利用数值孔径不大于约0.3的物镜来执行所述收集光的步骤。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述视场包括所述底板的整个外周。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，在检测步骤期间检测仅一个图像，所述光源的阵列包括第一光源和第二光源，所述辐照步骤包括将第一电流供应至所述第一光源并将第二电流供应至所述第二光源的步骤，并且所述第一电流和所述第二电流彼此不同。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在检测所述仅一个图像时，来自所述光源的阵列中的每个光源的辐照通量基本上是恒定的。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，在检测步骤期间检测仅一个图像，并且在相对于所述检测步骤的开始和结束的中间时间点改变所述光源的所述两个或更多子组中的至少一个子组的激励。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述检测步骤的一部分期间，所述两个或更多光源中的仅一个子组产生光，并且在所述检测步骤的另一部分期间，所述光源中的仅第二子组或所有所述光源产生光。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，检测步骤包括检测两个或更多图像的步骤，所述方法进一步包括对所述两个或更多图像进行处理以从所述两个或更多图像形成单个图像的步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，对于所述两个或更多图像中的每一个的检测而言，所述光源的激励是不同的。

17.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从用户接收样品参数的输入的步骤，其中，所述辐照步骤包括基于所述输入差别地激励所述光源的所述两个或更多子组的步骤。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样品参数与形成所述弯月面的所述培养基有关。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述样品参数涉及所述培养基的体积、高度和/或组分。

20.根据权利要求17所述的方法，进一步包括从一组预定义激励程序中选择用于所述辐照步骤的激励程序的步骤，所述一组预定义激励程序各对应于所述样品和/或井的不同构造，其中，利用处理器来执行选择步骤。

21.一种用于透射照明成像的系统，包括：

多井样品保持器，其包括多个井，所述多个井中的一个井具有底板并容纳有样品，所述样品包括生物细胞和形成弯月面的液体或半固体培养基；

平台，其支撑所述多井样品保持器；

辐照子系统，其包括光源的阵列，所述光源中的至少一个相对于所述系统的光轴在侧向上偏移，所述光源构造为产生以彼此不同的取向入射到所述弯月面上的各个光束的光；

物镜，其收集光；

成像检测器，其构造为检测一个或多个图像，所述一个或多个图像利用收集到的光形成并表示包括所述底板的外周的至少一部分在内的相同视场；以及

处理器，其构造为通过所述光源的两个或更多子组的相对于彼此的差别激励，来控制来自所述两个或更多子组的光对所述一个或多个图像的比例贡献，以补偿由所述弯月面产生的折射并改善对比度。