CN110057932A

CN110057932A - 高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法

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Publication number: CN110057932A
Application number: CN201910327358.8A
Authority: CN
Inventors: 郭华龙; 杨易可; 梁屹; 张帆; 陈小林
Original assignee: XUDONG HAIPU PHARMACEUTICAL CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: XUDONG HAIPU PHARMACEUTICAL CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN110057932B

Abstract

一种高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，以C18反相色谱柱，流动相以pH4.0的0.05M乙酸铵缓冲液和甲醇共混，实施梯度洗脱，经一次上样即对特布他林及其9种杂质实现定性和定量的检测。与现有技术相比，本发明提供的方法，不仅能检出更多的杂质，还对各种杂质有良好的灵敏度。具体应用时，根据各批次样品的检测结果，制定关键杂质的限度，极大的提高了实际生产过程中的经济适用性。

Description

高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法

技术领域

本发明涉及一种对化合物合成中涉及的杂质进行分析的方法，尤其涉及一种分析硫酸特布他林相关物质的方法。

背景技术

硫酸特布他林，英文名称为Terbutaline Sulfate，化学名称为(±)α-[(叔丁氨基)甲基]-3,5-二羟基苯甲醇硫酸盐(2:1)，分子式为C₁₂H₁₉NO₃)₂·H₂SO₄，分子量为548.66，CAS号为23031-32-5，结构式如下：

在制造药品的有效活性分子过程中，杂质是影响产品的关键质量属性。杂质的结构、理化性质和毒性情况复杂，因此有关物质的检查研究常常是药品研发中的难点之一。药品在临床使用过程中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关，与杂质的影响也密不可分。为保证临床安全用药，必须严格控制药品中的杂质。

目前硫酸特布他林原料药有关物质方法主要有中国药典2015、EP9.0及USP41方法对比如下表1所示。

表1

以上方法中国药典只检测杂质总和，USP41也是只检测杂质总和，EP和USP方法相同，但是有四个已知杂质。上述方法对杂质的检出能力有限，对产品的质量控制有待进一步提高。因此必须寻找一种更加适用的硫酸特布他林有关物质的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对硫酸特布他林合成过程中存在的各项杂质进行一步检测的方法，使得硫酸特布他林有关物质的检测更可靠，提高药品的安全性和有效性。

本发明提供的硫酸特布他林相关物质的检测方法，涉及的各项杂质如下：

(CAS:139508-58-0)、(CAS:99-10-5)、 (CAS:94120-05-5)、(CAS:94109-61-2)、 (CAS:50513-72-9)、(CAS:28917-43-3)、(CAS: 28924-21-2)、(CAS:28924-18-7)和(CAS:52144-90-8)。

一种高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，C18反相色谱柱(如：Agilent XDB-C18柱，规格为：150×4.6mm，填料粒径3.5μm)，流动相以pH4.0的0.05M乙酸铵缓冲液(取乙酸铵3.85g，加水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，用冰醋酸调节 pH值至4.0)和甲醇共混，并按如下方式实施洗脱：

先以2v/v％甲醇和98v/v％乙酸铵缓冲液共混形成流动相，洗脱10分钟；

再第一次线性洗脱10分钟，其间增加流动相中甲醇含量至75v/v％，同时减少流动相中乙酸铵缓冲液含量至25v/v％；

接着，第二次线性洗脱20分钟，其间增加流动相中甲醇含量至85v/v％，同时减少流动相中乙酸铵缓冲液含量至15v/v％；

然后，第三次线性洗脱5分钟，其间增加流动相中甲醇含量至100v/v％，同时减少流动相中乙酸铵缓冲液含量至0v/v％；

之后，使用甲醇含量100v/v％的流动相5分钟；

最后，以2v/v％甲醇和98v/v％乙酸铵缓冲液共混形成流动相，洗脱10分钟。

本发明提供的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，检测波长为270nm。

特布他林的吸收峰与CAS编号为139508-58-0的杂质峰之间的分离度应不小于2.0，理论板数按特布他林峰计算不低于3500，特布他林峰的拖尾因子应不大于2.0。

经本发明提供的方法依次将特布他林和有关物质实现分离，利于定性和定量分析，具体如下：

杂质CAS:99-10-5的保留时间为4.208分钟；

杂质CAS:94120-05-5的保留时间为6.14分钟，分离度：8.53；

杂质CAS:139508-58-0的保留时间为6.995分钟，分离度：3.35；

特布他林的保留时间为8.622分钟，分离度：5.62；

杂质CAS:94109-61-2的保留时间为18.067分钟，分离度：45.73；

杂质CAS:28917-43-3的保留时间为28.604分钟，分离度：27.55；

杂质CAS:52144-90-8的保留时间为29.086分钟，分离度：2.52；

杂质CAS:28924-21-2的保留时间为31.792分钟，分离度：13.75；

杂质CAS:28924-18-7的保留时间为33.129分钟，分离度：6.72；

杂质CAS:50513-72-9的保留时间为39.961，分离度：35.03。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，对9种杂质实现了经一次上样柱层析的定性和定量检测，提高了检测的效率。

与现有技术相比，本发明提供的方法，不仅能检出更多的杂质，还对各种杂质有良好的灵敏度。具体应用时，根据各批次样品的检测结果，制定关键杂质的限度，极大的提高了实际生产过程中的经济适用性。

与现有技术相比，本发明提供的方法对多种杂质进行分离和检测，保障硫酸特布他林终产品的质量，提高了产品的安全性。

附图说明

图1为本发明的方法应用于硫酸特布他林检测一实施例的色谱图。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本实施例中，对硫酸特布他林合成过程中可能存在的杂质进行了深入的分析，并鉴定了 10个杂质，详见表2。

表2硫酸特布他林杂质谱分析汇总表

开发过程，先采用药典方法不加离子对试剂，和甲醇梯度洗脱，主成分和3，5-二羟基苯甲酸出峰不理想故重新进行试验。由于化合物极性较小故将甲醇换成乙腈进行试验。调整梯度洗脱的比例及更换色谱柱进行试验，实验结果均不理想，由于主成分拖尾严重故加了三乙胺，结果仍不理想，故将甲酸铵换成乙酸铵进行试验，由于主峰拖尾严重所以对流动相的pH 进行了筛选。

取样品20mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释制成每1ml中约含2mg的溶液，作为供试品溶液；取硫酸特布他林杂质A对照品与硫酸特布他林对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含4μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法(通则0512)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05M乙酸铵缓冲液(取乙酸铵3.85g，加水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，用冰醋酸调节pH值至4.0)和甲醇梯度洗脱。

检测波长为270nm。取对照溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，特布他林峰与杂质A峰之间的分离度应不小于2.0，理论板数按特布他林峰计算不低于3500，特布他林峰的拖尾因子应不大于2.0；对照品溶液连续5次进样，主峰峰面积的RSD应不大于5.0％。取对照溶液50μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25％。再精密量取供试品溶液和对照溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至60min。

供试品溶液的色谱图中如有杂质峰则供试溶液中杂质A的峰面积不得过对照溶液中杂质A的峰面积(0.2％)。供试溶液中杂质B、C、D(D乘以校正因子0.3)的峰面积不得过对照溶液中的主峰面积(0.2％)。杂质E、F、H、I、J(分别乘以上表中对应校正因子)峰面积不得大于对照溶液中主峰面积的0.5倍(0.1％)；未知单杂峰面积不得过对照溶液中主峰面积的0.5倍(0.1％)。杂质总量应不得大于0.4％。

经对各类数据进行分析，本实施例用于分析特布他林及其各种杂质的的具体方法如下：

色谱柱Agilent XDB-C18柱(150×4.6mm，3.5μm)，流动相以0.05M乙酸铵缓冲液(取乙酸铵3.85g，加水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺5ml，用冰醋酸调节pH值至4.0)和甲醇梯度洗脱，洗脱方案详见表3，所得色谱图参见图1。在色谱图上分离的各个物质色谱特征详见表4

表3

表4

应用本实施例的分析方法，各个物质的检测限如下：

TBTL浓度为0.0411μg/ml时，信噪比S/N为2.3，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质A浓度为0.0211μg/ml时，信噪比S/N为5.7，相当于供试品溶液浓度的0.5w/v％；

杂质B浓度为0.0400μg/ml时，信噪比S/N为6.3，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质C浓度为0.0396μg/ml时，信噪比S/N为6.3，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质D浓度为0.0100μg/ml时，信噪比S/N为6.0，相当于供试品溶液浓度的0.25w/v％；

杂质E浓度为0.1012μg/ml时，信噪比S/N为4.7，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质F浓度为0.1033μg/ml时，信噪比S/N为4.0，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质H浓度为0.0403μg/ml时，信噪比S/N为4.7，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质I浓度为0.0415μg/ml时，信噪比S/N为3.7，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质J浓度为0.0429μg/ml时，信噪比S/N为4.7，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％。

应用本实施例的分析方法，各个物质的定量限如下：

TBTL浓度为0.1028μg/ml时，信噪比S/N为11.7，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质A浓度为0.0421μg/ml时，信噪比S/N为9.0，相当于供试品溶液浓度的1.0w/v％；

杂质B浓度为0.1001μg/ml时，信噪比S/N为18，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质C浓度为0.0991μg/ml时，信噪比S/N为8.7，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质D浓度为0.0200μg/ml时，信噪比S/N为10.7，相当于供试品溶液浓度的0.5w/v％；

杂质E浓度为0.2024μg/ml时，信噪比S/N为10.3，相当于供试品溶液浓度的5w/v％；

杂质F浓度为0.2067μg/ml时，信噪比S/N为9.0，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质H浓度为0.1008μg/ml时，信噪比S/N为12.0，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质I浓度为0.1038μg/ml时，信噪比S/N为8.7，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

杂质J浓度为0.1072μg/ml时，信噪比S/N为9.3，相当于供试品溶液浓度的2.5w/v％；

应用本实施例的分析方法，各个物质的检测定量线性如下：

1.特布他林

线性方程为A＝13,553.8449×X+876.3267

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9984；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：876.3267/57016＝1.5％。

2.杂质A

线性方程为A＝73,280.8884×X-2,823.5918

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.0421μg/ml～6.3120μg/ml)，相关系数R2为 0.9998；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为： -2823.5918/305282＝0.9％。

3.杂质B

线性方程为A＝16098.8604×X+60.6524

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9999；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：60.6524/64628＝0.1％。

4.杂质C

线性方程为A＝11996.7383×X-167.5690

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9999；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-167.5690/47506＝-0.4％。

5.杂质D

线性方程为A＝49103.9849×X-172.3282

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(即0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 1.0000；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-172.3282/197247＝ -0.1％。

6.杂质E

线性方程为A＝8934.1288×X-211.3813

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9999；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-211.3813/36030＝-0.6％。

7.杂质F

线性方程为A＝7386.8961×X-31.9662

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 1.0000；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-31.9662/30578＝-0.1％。

8.杂质H

线性方程为A＝26041.3338×X-271.5600

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 1.0000；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-271.5600/104770＝ -0.3％；

9.杂质I

线性方程为A＝20109.0121×X-483.2832

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(即0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9999；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：-483.2832/83315＝-0.6％。

10.杂质J

线性方程为A＝11249.4366×x+2523.2436

在2.5％指标浓度～150％指标浓度范围(0.1028μg/ml～6.1676μg/ml)，相关系数R2为 0.9955；线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值为：2523.2436/52329＝4.8％。

硫酸特布他林及各个杂质在定量限浓度、50％、80％、100％、120％和150％浓度范围内，线性回归系数R²均符合验证可接受标准要求(R²≥0.98)；

硫酸特布他林及各个杂质在定量限浓度、50％、80％、100％、120％和150％浓度范围内，线性回归方程的Y轴截距与100％指标浓度响应值的比值均，符合验证可接受标准要求 (≤±20.0％)。

Claims

1.一种高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于C18反相色谱柱，流动相以pH4.0的0.05M乙酸铵缓冲液和甲醇共混，并按如下方式实施洗脱：

之后，使用甲醇含量100v/v％的流动相5分钟；

最后，以2v/v％甲醇和98v/v％乙酸铵缓冲液共混形成流动相，洗脱10分钟，并分离如下杂质：

2.根据权利要求1中所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的C18反相柱的规格为：150×4.6mm，填料粒径3.5μm。

3.根据权利要求1中所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的检测波长为270nm。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的特布他林的吸收峰与CAS编号为139508-58-0的杂质峰之间的分离度应不小于2.0，理论板数按特布他林峰计算不低于3500，特布他林峰的拖尾因子应不大于2.0。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，经一次上样，即对9种杂质实现定性和定量的检测。