CN110055242A - 功能油脂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了功能油脂及其制备方法。其中，制备功能油脂的方法包括：将甘油三酯、亚麻酸、甾醇和分子筛溶于反应溶剂，以便得到预混合物；将所述预混合物中加入固定化酶，进行一锅法酶法催化反应，以便得到富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能油脂。该方法利用固定化酶制备油脂，协同效应好，催化效率高，且反应条件温和，反应步骤少，反应时间短，反应的成本低，并且制备的油脂富含多种营养成分。

Description

功能油脂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物领域，具有地，涉及功能油脂及其制备方法，更具体地，涉及制备功能油脂的方法以及该方法制备的功能油脂。
背景技术
油脂是人们日常生活中不可缺少的食物原料，但是大量摄入油脂所带来的肥胖、高血压、血管硬化等健康问题已经引起人们广泛的关注。因此，开发能代替传统食用脂肪又对人体健康有益的“功能性油脂”成了油脂加工领域研究的热点，结构脂质就是其中的一类新脂质。其中，酶法合成结构脂质以其潜在的显著优势引起了国内外学者的极大关注，然而，游离酶与底物产物分离困难，难以回收重复使用，造成产品污染及生产成本增加，这些因素严重限制了酶在工业生产中的广泛应用，20世纪60年代出现的固定化酶技术克服了游离酶的上述不足。
近年来采用固定化脂肪酶催化合成功能性油脂引起了越来越多的关注。在大多数方法中，用于功能性油脂制备的生物催化剂通常使用单一脂肪酶作为生物催化剂。然而，在许多情况下，单一酶已不能满足脂质修饰的实际需求，需要多种酶通过级联反应实现。受到自然界中多酶级联反应的启发，在单酶固定化技术的基础上又建立了多酶共固定化技术，多酶共固定化体系拥有固定化酶的高稳定性和连续操作能力，可以使不同酶催化的单一反应有机结合,缩短反应时间和减少反应步骤，实现连续催化,将底物一步转化为产物；又具有多酶的协同作用，提高催化效率。根据查阅已有文献，国内尚未有关利用多酶共固定化技术酶法改性制备功能性油脂的报道。
由此,利用固定化酶制备功能性油脂的方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备功能油脂的方法，利用该方法制备的功能油脂富含多种营养成分，并且制备方法简单，成本低。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备功能油脂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将甘油三酯、亚麻酸、甾醇和分子筛溶于反应溶剂，以便得到预混合物；将所述预混合物中加入前述的固定化酶，进行一锅法酶法催化反应，以便得到富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能油脂，其中，制备所述固定化酶的方法包括：将四氧化三铁溶于第一缓冲液中获得基材溶液，并加入多巴胺盐进行包覆处理，以便得到聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物；将非特异性脂肪酶和sn-1,3专一性脂肪酶溶于第二缓冲液中，以便得到酶缓冲液；以及将所述聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物与所述酶缓冲液接触，通过共价固定获得所述固定化酶。
发明人惊奇地发现，该方法利用固定化酶能一步反应制备油脂，该固定化酶是以四氧化三铁纳米复合物为固定载体，将sn-1,3专一性脂肪酶和非特异性脂肪酶经共固定化处理得到的。利用该固定化酶制备油脂，协同效应好，催化效率高，且反应条件温和，反应步骤少，反应时间短，反应的成本低，并且制备的油脂富含多种营养成分。
根据本发明的实施例，所述甘油三酯为选自大豆油、花生油和菜籽油中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述甾醇为选自谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述反应溶剂为选自环己烷、正己烷、异辛烷和正庚烷中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述甘油三酯、所述亚麻酸和所述甾醇的摩尔比为1:1:2-1:5:2。
根据本发明的实施例，所述预混合物中的分子筛加入量为15％。
根据本发明的实施例，所述一锅法酶法催化反应包括：将预混合物与所述固定化酶混合后在30-60℃条件下，搅拌0.5-9小时，以便得到反应混合物；将所述反应混合物进行冷却处理，以便得到冷却后的混合物；将所述冷却后的混合物进行离心处理，以便得到上清液；将所述上清液进行碱练脱酸处理，以便得到脱酸后溶液；以及将所述脱酸后溶液进行旋转蒸发处理，以便得到所述功能油脂。
根据本发明的实施例，所述固定化酶的加入量为5-25mg/mL。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：利用磁性分离从所述反应混合物中分离所述固定化酶。
根据本发明的实施例，所述非特异性脂肪酶为皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)。
根据本发明的实施例，所述sn-1,3专一性脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。
根据本发明的实施例，所述非特异性脂肪酶与所述sn-1,3专一性脂肪酶的质量比为1:0.2-7。
根据本发明的实施例，所述酶缓冲液中的所述非特异性脂肪酶和所述sn-1,3专一性脂肪酶的总浓度为0.5-3.5mg/mL。
根据本发明的实施例，所述多巴胺盐的添加量为0.5-3mg/mL。
根据本发明的实施例，所述第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为7.0-12.0。
根据本发明的实施例，所述四氧化三铁的添加量为1-6mg/mL。
根据本发明的实施例，所述第二缓冲液为PBS缓冲液，优选地，所述PBS缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为4.0-9.0。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种功能油脂。根据本发明的实施例，所述功能油脂是利用前述制备功能油脂的方法制备的。由此，该功能油脂富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸，是一种营养丰富的功能性油脂，并且生产成本低，操作简便。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的不同质量比例的CRL和TLL脂肪酶所制备的固定化酶在不同时间下制备的功能油脂中甘油二酯含量变化结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的游离酶与固定化酶在50℃下的热稳定性结果示意图；
图3显示了根据本发一个实施例的不同反应溶剂对功能油脂中甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)及甾醇酯含量的影响的结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施明例的底物比例(甾醇、亚麻酸和甘油三酯摩尔比)对功能油脂中甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)及甾醇酯含量的影响的结果示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的反应温度对功能油脂中甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)及甾醇酯含量的影响的结果示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的酶添加量对功能油脂中甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)及甾醇酯含量的影响的结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明实施例的功能油脂是利用固定化酶制备的，在此先对制备固定化酶的方法进行介绍。根据本发明实施例的制备固定化酶的方法，以四氧化三铁纳米复合物为固定载体，将sn-1,3专一性脂肪酶和非特异性脂肪酶经共固定化处理得到固定化酶。所述制备固定化酶的方法反应条件温和，操作简单，成本较低。相比于游离酶，所制备的固定化酶稳定性更好，不像游离酶对反应条件要求那样苛刻，催化效果高，且易于分离回收、重复使用效果好，便于将该酶用于工业生产。
为了便于理解该方法，在此根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：
S100载体制备
根据本发明的实施例，将四氧化三铁溶于第一缓冲液中获得基材溶液，并加入多巴胺盐进行包覆处理，以便得到聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物。四氧化三铁具有较高的机械稳定性、较大的比表面积以及独特的磁学性质，由此，以四氧化三铁纳米复合物为固定载体，通过磁性分离即可分离得到固定化酶，使固定化酶易于回收和重复利用。
根据本发明的实施例，所述多巴胺盐的添加量为0.5-3mg/mL。
根据本发明的实施例，所述第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为7.0-12.0。
根据本发明的实施例，所述四氧化三铁的添加量为1-6mg/mL。
根据本发明的实施例，所述基材溶液是通过先将四氧化三铁溶于第一缓冲液进行超声，以便获得分散均匀的四氧化三铁基材溶液，所述包覆处理是将四氧化三铁与多巴胺混合搅拌，例如，室温下搅拌反应2-8小时，使多巴胺充分包覆四氧化三铁形成纳米复合物。
S200溶解处理
根据本发明的实施例，将非特异性脂肪酶和sn-1,3专一性脂肪酶溶于第二缓冲液中，以便得到酶缓冲液。由此，采用两种酶催化可实现多功能营养成分的功能油脂的制备。
根据本发明的实施例，所述非特异性脂肪酶为皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)。
根据本发明的实施例，所述sn-1,3专一性脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。
如图1所示，根据本发明的实施例，所述非特异性脂肪酶与所述sn-1,3专一性脂肪酶的质量比为1:0.2-7。从图1可知，与CRL-PDA@Fe3O4的催化活性相比，TLL-PDA@Fe3O4在9小时后获得了更好的初始速率和更高的DAG含量。采用固定化酶作为催化剂，DAG含量随着两种脂肪酶混合物中TLL比例的增加而增加。有趣的是，固定化酶特别是CRL和TLL的比例为1：7时制备的固定化酶，与仅使用TLL-PDA@Fe3O4作为催化剂相比，催化反应制备的功能性油脂获得了更高的DAG含量。这种现象可归因于双脂肪酶之间的协同效应，并且协同效应的强度可能与两种混合脂肪酶的比例有关，优选地，CRL和TLL的比例为1:7。
根据本发明的实施例，所述酶缓冲液中的所述非特异性脂肪酶和所述sn-1,3专一性脂肪酶的总浓度为0.5-3.5mg/mL。
根据本发明的实施例，所述第二缓冲液为PBS缓冲液，优选地，所述PBS缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为4.0-9.0。
S300双酶共固定化
根据本发明的实施例，将所述聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物与所述酶缓冲液接触，通过共价固定获得所述固定化酶。由此，通过将酶进行固定化处理，相比于游离酶，其稳定性更好，不像游离酶对反应条件要求那样苛刻，催化效果高，且易于分离回收、重复使用效果好，便于将该酶用于工业生产。
根据本发明的实施例，所述固定化处理是在4℃下搅拌反应3-6小时。由此，有利于将双酶充分固定在四氧化三铁纳米粒上，固定化反应更充分，反应效率更高。
对游离酶和固定化酶的活性进行检测，如图2所示，在50℃下，随着反应时间增长，游离酶相对活性降低速度远大于固定化酶，经过约90min后，游离酶的相对活性降到了38％。在相同时间里，固定化酶相对活性仍然保持在74％以上。由此可见，固定化酶相对于游离酶，显示出优异的热稳定性。
在此基础上，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备功能油脂的方法。发明人惊奇地发现，该方法利用前述的固定化酶，能一步反应制备油脂，所述共固定化酶表现出协同效应，催化效率高，且反应条件温和，反应步骤少，反应时间短，反应的成本低，并且制备的油脂富含多种营养成分。根据本发明的实施例，该功能油脂可以是富含15.61％-19.07％甾醇酯，30.09％-37.14％甘油二酯及24.04％-30.57％亚麻酸的功能油脂。
为了便于理解该制备功能油脂的方法，在此，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：
S400预混合物配置
根据本发明的实施例，将甘油三酯、亚麻酸、甾醇和分子筛溶于反应溶剂，以便得到预混合物。由此，以甘油三酯、亚麻酸和甾醇为原料，功能油脂中富含甾醇酯、亚麻酸等多种营养物质。
根据本发明的实施例，所述甘油三酯为选自大豆油、花生油和菜籽油中的至少一种。也就是说，该甘油三酯是大豆油、花生油和菜籽油中的任意一种或多种以任意配比混合得到的。由此，可选择各种植物油作为甘油三酯的来源制备不同的功能性油脂。
根据本发明的实施例，所述甾醇为选自谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中的至少一种。也就是说，该甾醇酯是谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中的任意一种或多种以任意配比混合得到的。由此，甾醇的来源丰富、品质好，价格低。
参考图3，根据本发明的实施例，所述反应溶剂为选自环己烷、正己烷、异辛烷和正庚烷中的至少一种。由此，甘油三酯、亚麻酸和甾醇在反应溶剂中混合溶解得更充分，固定化酶催化活性和操作稳定更高。如图3所示，反应溶剂的疏水性越强，固定化酶的催化活性越高，随着使用溶剂的疏水性增强，所制备的甘油二酯和甾醇酯含量越高，催化效果约好，虽然异辛烷的疏水性大于正庚烷，所制备的甘油二酯和甾醇酯含量并未有所提高，这是由于底物在反应溶剂中的溶解度对催化效果有影响。
参考图4，根据本发明的实施例，所述甘油三酯、所述亚麻酸和所述甾醇的摩尔比为1:1:2-1:5:2。底物比例对催化效果有影响，当甘油三酯、亚麻酸和甾醇的比例升至1:3:2时，所制备的甘油二酯和甾醇酯含量最高，当进一步增大亚麻酸的比例，导致底物环境变酸，影响酶的活性。
根据本发明的实施例，将甘油三酯、亚麻酸、甾醇和分子筛溶于反应溶剂，以便得到预混合物，所述分子筛用于除去反应过程中产生的水。
根据本发明的实施例，该分子筛的加入量为15％，也就是底物甘油三酯、植物甾醇和亚麻酸总质量的15％。
S500一锅法催化反应
根据本发明的实施例，将所述预混合物与前述的固定化酶进行一锅法催化反应，以便得到富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能油脂。由此，通过所述的固定化酶，能一步反应制备油脂，共固定化酶表现出协同效应，催化效率高，且反应条件温和，反应步骤少，反应时间短，反应的成本低，并且制备的油脂富含多种营养成分。
参考图5，根据本发明的实施例，所述一锅法催化反应包括：将预混合物与所述固定化酶混合后在30-60℃条件下，搅拌0.5-9小时，以便得到反应混合物；将所述反应混合物进行冷却处理，以便得到冷却后的混合物；将所述冷却后的混合物进行离心处理，以便得到上清液；将所述上清液进行碱练脱酸处理，以便得到脱酸后溶液；以及将所述脱酸后溶液进行旋转蒸发处理，以便得到所述功能油脂。由此，反应条件温和，催化效率高，反应步骤少，反应时间短，反应的成本低。如图5所示，所制备的甘油二酯和甾醇酯含量随着温度上升而上升，当反应温度超过40℃时，甘油二酯和甾醇酯含量明显下降，优选地，反应温度为40℃。
参考图6，根据本发明的实施例，所述固定化酶的加入量为5-25mg/mL。由此，酶的用量适宜，即保证了高催化效率，又使酶的用量较低。如图6所示，随着酶用量的增加，甘油二酯和甾醇酯的含量增加，当酶用量超过20mg/mL时，甘油二酯和甾醇酯的含量没有明显的增加，优选地，酶的用量为20mg/mL。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：利用磁性分离从所反应混合物中分离所述固定化酶。由于以固定化酶以四氧化三铁为载体，利用磁性分离即可分离得到固定化酶，分离方法简单快捷，酶的重复利用次数多，活性高。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种功能油脂。根据本发明的实施例，所述功能油脂是利用前述制备功能油脂的方法制备的。由此，该功能油脂富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸，是一种营养丰富的功能性油脂，并且生产成本低，操作简便。
进一步，为了更充分的理解前述的制备固定化酶和功能油脂的方法，在此提供制备二者的一般方法，包括：
(1)四氧化三铁载体(PDA@Fe3O4NPs)的制备：共沉淀法制备Fe3O4，所制备的Fe3O4溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)缓冲溶液中，超声15min。将多巴胺盐酸盐(0.5-3mg/mL，优选2.5mg/mL)加入Fe3O4悬浮溶液中，室温下搅拌反应2-8h。反应产物用磁铁分离出来，并用超纯水清洗三遍后，将产物重悬于超纯水中备用。
(2)双酶共固定化：将不同比例的CRL和TLL脂肪酶溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中,其中脂肪酶的总浓度为0.5-3.5mg/mL，优选2.0mg/mL。加入上述制备的PDA@Fe3O4NPs，在4℃下搅拌反应2-8h后，磁性分离，用PBS溶液清洗掉未反应的酶溶液后重悬于超纯水中，于4℃储存备用。
(3)磁性固定化酶催化植物油制备功能油脂：将甘油三酯、亚麻酸和甾醇以摩尔比为1:1:2-1:5:2加入反应溶剂中，分子筛的加入量为15％(底物甘油三酯、植物甾醇和亚麻酸总质量的15％)，加热到30-60℃搅拌均匀(搅拌15min)，得到预混合物(所述混合物为甘油三酯、植物甾醇、亚麻酸和分子筛)；加入5-25mg/mL的固定化脂肪酶于混合物中，在30-60℃范围内，搅拌反应0.5-9h后停止加热，自然冷却至室温。
(4)产物的纯化：磁性分离出固定化酶，将产物置于4℃冰箱0.5-1h，离心除去分子筛和未反应的植物甾醇，碱练脱酸，随后旋转蒸发溶剂，便可得到产物。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
本实施例是基于磁性固定化酶制备富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能性油脂的方法，方法如下：
(1)PDA@Fe3O4NPs的制备：共沉淀法制备Fe3O4，取250mg Fe3O4溶解于100mL的Tris缓冲溶液(0.01M pH 8.5)中，超声15min。加入125mg多巴胺，室温下搅拌反应4h。反应产物用磁铁分离出来，并用超纯水清洗三遍后，将产物重悬于超纯水中。
(2)双酶共固定化：将CRL和TLL脂肪酶(m/m 1:7)溶解于PBS缓冲液(0.01M pH7.0)溶液中,加入上述制备的PDA@Fe3O4NPs，在4℃下搅拌反应4h后，磁性分离用纯水清洗掉未反应的酶溶液后重悬于超纯水中，于4℃储存备用。
(3)磁性固定化酶催化植物油制备功能性油脂：将大豆油(704g)、亚麻酸(334g)和甾醇(166g)加入5L反应溶剂(正庚烷)中，分子筛的加入量为15％(底物甘油三酯、植物甾醇和亚麻酸总质量的15％)，加热到40℃搅拌均匀(搅拌15min)，得到预混合物；加入20mg/mL的固定化脂肪酶于与混合物中，在40℃范围内，搅拌反应8h后停止加热，自然冷却至室温。
(4)产物的后处理：磁性分离出固定化酶，将产物置于4℃冰箱1h，离心除去分子筛和未反应的植物甾醇，碱练脱酸，随后旋转蒸发，便可得到产物，其中，甾醇酯约占15.6％，甘油二酯约占30.09％，大豆油约占54.3％，亚麻酸含量约占总脂肪酸的25.2％，产品酸价小于0.10mg/g，过氧化值小于0.09g/100g。
利用本实施例的方法制备得到的功能油脂富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸三种活性功能成分，且酸价和过氧化值低。
实施例2
本实施例是基于磁性固定化酶制备富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能性油脂的方法，方法如下：
(1)PDA@Fe3O4NPs的制备：共沉淀法制备Fe3O4，取250mg Fe3O4溶解于100mL的Tris缓冲溶液(0.01M pH 8.5)中，超声15min。加入125mg多巴胺，室温下搅拌反应4h。反应产物用磁铁分离出来，并用超纯水清洗三遍后，将产物重悬于超纯水中。
(2)双酶固定化：将CRL和TLL脂肪酶(m/m 1:7)溶解于PBS缓冲液(0.01M pH 7.0)溶液中,加入上述制备的PDA@Fe3O4NPs，在4℃下搅拌反应4h后，磁性分离用纯水清洗掉未反应的酶溶液后重悬于超纯水中，于4℃储存备用。
(3)磁性固定化酶催化植物油制备功能性油脂：将花生油(692g)、亚麻酸(334g)和甾醇(166g)加入5L反应溶剂(正庚烷)中，分子筛的加入量为15％(底物甘油三酯、植物甾醇和亚麻酸总质量的15％)，加热到40℃搅拌均匀(搅拌15min)，得到预混合物；加入20mg/mL的固定化脂肪酶于与混合物中，在40℃范围内，搅拌反应8h后停止加热，自然冷却至室温。
(4)产物的后处理：磁性分离出固定化酶，将产物置于4℃冰箱1h,离心除去分子筛和未反应的植物甾醇，溶剂萃取脱酸，随后旋转蒸发，便可得到产物，其中，甾醇酯约占19.07％，甘油二酯约占37.14％，花生油约占43.79％，亚麻酸含量约占总脂肪酸的24.04％，产品酸价小于0.20mg/g，过氧化值小于0.10g/100g。
利用本实施例的方法制备得到的功能油脂富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸三种活性功能成分，且酸价和过氧化值低。
实施例3
本实施例是基于磁性固定化酶制备富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能性油脂的方法，方法如下：
(1)PDA@Fe3O4NPs的制备：共沉淀法制备Fe3O4，取250mg Fe3O4溶解于100mL的Tris缓冲溶液(0.01M pH 8.5)中，超声15min。加入125mg多巴胺，室温下搅拌反应4h。反应产物用磁铁分离出来，并用超纯水清洗三遍后，将产物重悬于超纯水中。
(2)双酶固定化：将CRL和TLL脂肪酶(m/m 1:7)溶解于PBS缓冲液(0.01M pH 7.0)溶液中,加入上述制备的PDA@Fe3O4NPs，在4℃下搅拌反应4h后，磁性分离用纯水清洗掉未反应的酶溶液后重悬于超纯水中，于4℃储存备用。
(3)磁性固定化酶催化植物油制备功能性油脂：将菜籽油(722g)、亚麻酸(334g)和甾醇(166g)加入5L反应溶剂(正庚烷)中，分子筛的加入量为15％(底物甘油三酯、植物甾醇和亚麻酸总质量的15％)，加热到40℃搅拌均匀(搅拌15min)，得到预混合物；加入20mg/mL的固定化脂肪酶于与混合物中，在40℃范围内，搅拌反应8h后停止加热，自然冷却至室温。
(4)产物的后处理：磁性分离出固定化酶，将产物置于4℃冰箱1h,离心除去分子筛和未反应的植物甾醇，溶剂萃取脱酸，随后旋转蒸发，便可得到产物，其中，甾醇酯约占18.70％，甘油二酯约占30.13％，菜籽油约占51.17％，亚麻酸含量约占总脂肪酸的30.56％，产品酸价小于0.10mg/g，过氧化值小于0.08g/100g。
利用本实施例的方法制备得到的功能油脂富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸三种活性功能成分，且酸价和过氧化值低。
综上所述，本发明实施例采用四氧化三铁为固定载体，将sn-1,3专一性脂肪酶和非特异性脂肪酶经共固定化制得固定化酶。由于将酶进行固定化，相比于游离酶，其稳定性更好，不像游离酶对反应条件要求那样苛刻，且易于分离回收、重复使用效果好。从而，采用磁性固定化酶可以一步反应获得富含多种营养成分的功能油脂，缩短了反应时间和减少反应步骤，并且，通过多酶的协同作用，催化效率高，并且反应条件温和，生产得到的油脂出富含15.61％-19.07％甾醇酯，30.09％-37.14％甘油二酯及24.04％-30.57％亚麻酸。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种制备功能油脂的方法，其特征在于，包括：
将甘油三酯、亚麻酸、甾醇和分子筛溶于反应溶剂，以便得预混合物；以及
将所述预混合物与固定化酶进行一锅法酶法催化反应，以便得到富含植物甾醇酯、甘油二酯和亚麻酸的功能油脂，
其中，制备所述固定化酶的方法包括：
将四氧化三铁溶于第一缓冲液中获得基材溶液，并加入多巴胺盐进行包覆处理，以便得到聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物；
将非特异性脂肪酶和sn-1,3专一性脂肪酶溶于第二缓冲液中，以便得到酶缓冲液；以及
将所述聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物与所述酶缓冲液接触，通过共价固定获得所述固定化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯的来源为选自大豆油、花生油和菜籽油中的至少一种，
任选地，所述甾醇的来源为选自谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中的至少一种，
任选地，所述反应溶剂为选自环己烷、正己烷、异辛烷和正庚烷中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯、所述亚麻酸和所述甾醇的摩尔比为1:1:2-1:5:2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预混合物中的分子筛加入量为15％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一锅法酶法催化反应包括：
将预混合物与所述固定化酶混合后在30-60℃条件下，搅拌0.5-9小时，以便得到反应混合物；将所述反应混合物进行冷却处理，以便得到冷却后的混合物；
将所述冷却后的混合物进行离心处理，以便得到上清液；
将所述上清液进行碱练脱酸处理，以便得到脱酸后溶液；以及
将所述脱酸后溶液进行旋转蒸发处理，以便得到所述功能油脂，
任选地，所述固定化酶的加入量为5-25mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
利用磁性分离从所述反应混合物中分离所述固定化酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非特异性脂肪酶为皱褶假丝酵母脂肪酶，
任选地，所述sn-1,3专一性脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，
任选地，所述非特异性脂肪酶与所述sn-1,3专一性脂肪酶的质量比为1:0.2-7。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶缓冲液中的所述非特异性脂肪酶和所述sn-1,3专一性脂肪酶的总浓度为0.5-3.5mg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多巴胺盐的添加量为0.5-3mg/mL，
任选地，所述第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为7.0-12.0，
任选地，所述四氧化三铁的添加量为1-6mg/mL，
任选地，所述第二缓冲液为PBS缓冲液，优选地，所述PBS缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为4.0-9.0。
10.一种功能油脂，其特征在于，所述功能油脂是利用权利要求1-9任一项所述的方法制备的。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921452A (zh) * 2022-04-14 2022-08-19 一丰粮油有限公司 固定化脂肪酶及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103352067A (zh) * 2013-08-04 2013-10-16 中国农业科学院油料作物研究所 一种富含植物甾醇酯和甘油二酯的功能油脂的制备方法
CN104313010A (zh) * 2014-11-05 2015-01-28 太原理工大学 磁响应性复合脂肪酶的制备方法及生物柴油合成中的应用
CN104894094A (zh) * 2015-05-15 2015-09-09 华南理工大学 一种酶固定化方法及酶制剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103352067A (zh) * 2013-08-04 2013-10-16 中国农业科学院油料作物研究所 一种富含植物甾醇酯和甘油二酯的功能油脂的制备方法
CN104313010A (zh) * 2014-11-05 2015-01-28 太原理工大学 磁响应性复合脂肪酶的制备方法及生物柴油合成中的应用
CN104894094A (zh) * 2015-05-15 2015-09-09 华南理工大学 一种酶固定化方法及酶制剂

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921452A (zh) * 2022-04-14 2022-08-19 一丰粮油有限公司 固定化脂肪酶及其制备方法与应用

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