CN114921452A - 固定化脂肪酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶及其制备方法与应用,其中,固定化脂肪酶中的脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL),固定化载体为D3520大孔树脂;所述固定化脂肪酶用于催化甘油解反应制备甘油二酯,催化得到的产物中,甘油一酯的含量≤6.5wt%。本发明中固定化脂肪酶可将催化甘油解反应制备甘油二酯过程中的甘油一酯降低至6.5wt%以下,甘油二酯提升至34.5wt%以上,简化分离工艺。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶技术领域,尤其涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法与应用。
背景技术
甘油二酯是一种功能性油脂,具有与普通油脂相似的口感、风味和能量,但是它在人体内摄入后不会产生脂肪堆积,具有减肥的功效,可以预防与肥胖相关的疾病的发生。因此,甘油二酯的研究开发具有很好的应用前景。甘油二酯的制备主要有化学法和生物酶法。化学法在高温条件下进行,耗能高、产品色泽较深,并且不适于富含多不饱和脂肪酸的甘油酯的生产。生物酶法具有诸多优点,比如,反应条件温和、过程绿色、副产物少,适于含热敏性多不饱和脂肪酸甘油酯的生产,等等。因此,生物酶法制备甘油二酯具有更大的前景。
现有的生物酶催化甘油解反应制备甘油二酯过程中,不可避免地会产生一定含量的甘油一酯。具体的,在酶促甘油解反应时,一分子油脂(甘油三酯)与一分子的甘油反应,生成一分子的甘油一酯和一分子的甘油二酯。该步反应的进行生成相对较高的甘油一酯含量(所述的相对较高的甘油一酯含量是指,相对于甘油二酯而言,因为是等摩尔的甘油一酯和甘油二酯同时生成)。现有技术制备甘油二酯中,较多关注甘油二酯的含量,而较少关注甘油一酯的含量。因此,现有技术较关注该步反应的进行,而相应地,生成的甘油一酯含量也相对较高。当前,酶促甘油解反应制备甘油二酯中,甘油一酯的含量通常在20wt%左右。由于甘油一酯的凝固点较高,会导致最终甘油二酯产品的凝固点升高。因此,实际甘油二酯产品是需要除去大部分的甘油一酯,一般是通过分子蒸馏而除去(如CN104388483A、CN101225415A)。因此,在确保一定甘油二酯含量的同时,尽量降低甘油一酯的含量,对于减轻分离负担,具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种固定化脂肪酶,其可将甘油解反应制备甘油二酯过程中的甘油一酯降低至6.5wt%以下。
本发明还要解决的技术问题在于,提供一种固定化脂肪酶的制备方法。
本发明还要解决的技术问题在于,提供一种固定化脂肪酶催化制备甘油二酯的方法,其可简化分离步骤。
本发明还要解决的技术问题在于,提供固定化脂肪酶在催化甘油解反应制备甘油二酯中的应用。
本发明还要解决的技术问题在于,提供一种用于食品的甘油二酯。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种固定化脂肪酶,其中,脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,固定化载体为D3520大孔树脂;
所述固定化脂肪酶用于催化甘油解反应制备甘油二酯,催化得到的产品中,甘油一酯的含量≤6.5wt%。
相应的,本发明还提供了一种固定化脂肪酶的制备方法,用于制备上述的固定化脂肪酶,其包括以下步骤:
(1)将D3520大孔树脂依次用乙醇、酸、碱和缓冲液浸泡,得到活化后大孔树脂;
(2)将活化后大孔树脂、脂肪酶加入预设pH的磷酸缓冲液中,得到固定体系;将所述固定体系混合预设时间,固液分离、干燥后得到固定化脂肪酶。
作为上述技术方案的改进,所述固定体系中,所述活化后大孔树脂的含量为20~50g/L,所述脂肪酶的浓度为500~800μg/mL。
作为上述技术方案的改进,步骤(2)中,将所述固定体系在20~30℃固定2~5h,固定过程中进行水浴震荡。
作为上述技术方案的改进,步骤(1)包括:
(1.1)将大孔树脂浸泡于90~95%的乙醇中20~40h,过滤并采用水冲洗;
(1.2)将步骤(1.1)得到的大孔树脂浸泡于2~10%的盐酸溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
(1.3)将步骤(1.2)得到的大孔树脂浸泡于2~10%的氢氧化钠溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
(1.4)将步骤(1.3)得到的大孔树脂浸泡于pH为6.8~7.2的磷酸缓冲液中1~3h,过滤并采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为6.8~7.2,即得到活化后大孔树脂。
作为上述技术方案的改进,所述乙醇浓度为95%,所述盐酸溶液浓度为5%,所述氢氧化钠溶液浓度为5%。
相应的,本发明还公开了上述的固定化脂肪酶在催化甘油解反应制备甘油二酯中的应用。
作为上述技术方案的改进,将甘油、油脂、权利要求1所述的固定化脂肪酶混合,在50~60℃反应3~16h,固液分离即得甘油二酯成品。
作为上述技术方案的改进,甘油、油脂的摩尔比为1:(4~4.5),固定化脂肪酶的用量为甘油、油脂总重量的3.5~4.5wt%;
所述油脂选用大豆油、棕榈油、菜籽油、玉米油、花生油、山茶油中的一种或多种。
相应的,本发明还公开了一种用于食品的甘油二酯,其由如上述的固定化脂肪酶催化甘油解反应制备而得。
实施本发明,具有如下有益效果:
本发明的固定化脂肪酶,以疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL)作为脂肪酶,以D3520大孔树脂作为固定化载体。这种固定化脂肪酶可将催化甘油解反应制备甘油二酯过程中甘油一酯的含量降低至6.5wt%以下,甘油二酯的含量提高至34.5wt%以上,对于降低后期分离具有重要的意义。此外,由该固定化脂肪酶催化制得的产品在常温下呈液态,可直接应用在食品领域。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
作为本发明的第一个方面,本发明提供了一种固定化脂肪酶,其脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL),固定化载体为D3520大孔树脂。基于上述固定化脂肪酶,可将催化甘油解反应制备甘油二酯得到的甘油二酯产品中的甘油一酯含量降低至6.5wt%,甘油二酯含量提升至34.5wt%以上。需要说明的是,上述甘油一酯、甘油二酯的含量是指采用固定化脂肪酶催化甘油解反应后,经过简单固液分离后所得产物中甘油一酯、甘油二酯的含量。
作为本发明的第二个方面,本发明还公开了一种固定化脂肪酶的制备方法,包括以下步骤:
S1:将D3520大孔树脂依次用乙醇、酸、碱和缓冲液浸泡,得到活化后大孔树脂;
步骤S1包括:
S11:将大孔树脂浸泡于90~95%的乙醇中20~40h,过滤并采用水冲洗;
具体的,将大孔树脂完全淹没至乙醇中,密封避光静置浸泡,浸泡后过滤,并采用纯净水冲洗至大孔树脂无乙醇气味。
具体的,乙醇的体积浓度为90~95%,示例性的为91%、92%、93%、94%或95%,但不限于此。优选的,乙醇的体积浓度为95%。
具体的,浸泡时间为20~40h,示例性的为22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h或38h,但不限于此;优选的为24h。
S12:将步骤S11得到的大孔树脂浸泡于2~10%的盐酸溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
具体的,将大孔树脂完全淹没至盐酸溶液,密封避光静置浸泡,浸泡后过滤,并采用纯净水冲洗至滤液pH为6.8~7.2。
需要说明的是,本发明中的酸并不限于盐酸,还可选用稀硫酸、稀硝酸,但不限于此。优选的选用盐酸,且盐酸的浓度为2~10wt%,示例性的为3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%或8wt%,但不限于此。优选的,盐酸溶液的浓度为5wt%。
具体的,浸泡时间为2~5h,示例性的为3h、4h或5h,但不限于此。优选的为4h。
具体的,过滤后采用纯净水冲洗至滤液pH为6.8~7.2,优选的为7.0。
S13:将步骤S12得到的大孔树脂浸泡于2~10%的氢氧化钠溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
具体的,将大孔树脂完全淹没至氢氧化钠溶液,密封避光静置浸泡,浸泡后过滤,并采用纯净水冲洗至滤液pH为6.8~7.2。
需要说明的是,本发明中的碱并不限于氢氧化钠,还可选用氢氧化钾,但不限于此。优选的选用氢氧化钠,且氢氧化钠溶液的浓度为2~10wt%,示例性的为3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%或8wt%,但不限于此。优选的,氢氧化钠溶液的浓度为5wt%。
具体的,浸泡时间为2~5h,示例性的为2h、3h、4h或5h,但不限于此。优选的为4h。
具体的,过滤后采用纯净水冲洗至滤液pH为6.8~7.2,优选的为7.0。
S14:将步骤S13得到的大孔树脂浸泡于pH为6.8~7.2的磷酸缓冲液中1~3h,过滤并采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为6.8~7.2,即得到活化后大孔树脂。
具体的,将大孔树脂完全淹没至磷酸缓冲液中,密封避光静置浸泡,浸泡后过滤,并采用纯净水冲洗至滤液pH为6.8~7.2。
其中,磷酸缓冲溶液的pH为6.8~7.2,优选的为7.0。具体的,浸泡时间为1~3h,示例性的为1h、2h或3h,但不限于此。优选的为2h。
具体的,过滤后采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为6.8~7.2,优选的为7.0。
(2)将活化后大孔树脂、脂肪酶加入预设pH的磷酸缓冲液中,得到固定体系;将所述固定体系混合预设时间,固液分离、干燥后得到固定化脂肪酶。
其中,固定体系中活化后大孔树脂的含量为20~50g/L,示例性的为24g/L、28g/L、32g/L、36g/L、40g/L、44g/L或48g/L,但不限于此。优选的为25~35g/L。
固定体系中脂肪酶的浓度为500~800μg/mL,示例性的为540μg/mL、580μg/mL、620μg/mL、660μg/mL、700μg/mL、740μg/mL或780μg/mL,但不限于此。优选的为500~600μg/mL。
其中,磷酸缓冲液的pH为4~7,示例性的为4.5、5、5.5、6或6.5,但不限于此。优选的磷酸缓冲液的pH为4.5~5.5。磷酸缓冲溶液的浓度为20~100mmol/L,示例性的为25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、70mmol/L、75mmol/L、80mmol/L、85mmol/L、90mmol/L或95mmol/L,但不限于此。优选的为20~30mmol/L。
具体的,将固定体系在水浴震荡的条件下进行固定,固定温度为20~30℃,示例性的为22℃、24℃、26℃或28℃,但不限于此。固定时间为2~5h,示例性的为2.5h、3h、3.5h、4h或4.5h,但不限于此。
固定完成后,先过滤,再真空干燥,得到固定化脂肪酶成品。其中真空干燥温度为30℃,干燥时间为6h,真空度为-0.1MPa。
作为本发明的第三个方面,本发明还公开了上述的固定化脂肪酶在催化甘油解反应制备甘油二酯中的应用。
具体的,本发明的基于固定化脂肪酶催化甘油解反应制备甘油二酯的方法包括:将甘油、油脂、上述的固定化脂肪酶混合,在50~60℃反应3~16h,固液分离即得甘油二酯成品。
更具体的,上述方法包括以下步骤:
S100:将甘油、油脂混合均匀,加入固定化脂肪酶;反应预设时间后得到初产物;
其中,油脂选用大豆油、棕榈油、菜籽油、玉米油、花生油、山茶油中的一种或多种,但不限于此。
其中,甘油和油脂的摩尔比为1:(4~4.5),示例性的为1:4、1:4.2、1:4.4,但不限于此。
其中,固定化脂肪酶的用量为甘油、油脂总重量的3.5~4.5wt%,示例性的为3.6wt%、3.7wt%、3.8wt%、3.9wt%、4.0wt%、4.1wt%、4.2wt%、4.3wt%或4.4wt%,但不限于此。优选的为3.8~4.2wt%。
具体的,该反应的反应条件如下:反应温度50~60℃,示例性的为52℃、54℃、56℃或58℃,但不限于此。反应时间3~16h,示例性的为4h、6h、8h、10h、12h或14h,但不限于此。优选的,在反应过程中持续搅拌,搅拌速度为100~300rpm,示例性的为140rpm、200rpm、240rpm或280rpm,但不限于此。
S200:将初产物分离,即得到甘油二酯成品。
具体的,分离为固液分离(如过滤等),即去除固定化脂肪酶即可。本发明通过特定的固定化脂肪酶、反应条件,有效降低了产物中甘油一酯的产量。大幅降低了后期分离的难度。
在S200所得的甘油二酯成品中,含有甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯以及少量的游离脂肪酸。其中,甘油一酯的含量≤6.5wt%,甘油二酯的含量≥34.5wt%。需要说明的是,在生物酶催化甘油解反应制备甘油二酯过程中,主要发生以下两个反应:
上述两个反应均是可逆反应,其发生的程度受限于生物酶、固定载体、反应条件(原料比例、反应温度、时间)等的影响。传统的制备方法中,多关注的是甘油二酯的含量,因此一般考虑的是式(1-1)反应的充分性,而对如何调控式1-1反应、式1-2反应的平衡研究较少。而本发明基于降低甘油一酯的角度出发,对上述两个反应的选择性进行了调整,有效地降低了反应产物中甘油一酯的含量。
下面以具体实施例进一步说明本发明:
实施例1
本实施例提供一种固定化脂肪酶,其脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,固定化载体为D3520大孔树脂;
其制备方法为:
(1)将大孔树脂浸泡于92%的乙醇,密封避光静置浸泡20h,过滤并采用水冲洗至无乙醇气味;
(2)将步骤(1)得到的大孔树脂浸泡于8%的盐酸溶液,密封避光静置5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8;
(3)将步骤(2)得到的大孔树脂浸泡于2%的氢氧化钠溶液中,密封避光静置3h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8;
(4)将步骤(3)得到的大孔树脂浸泡于pH为7.1的磷酸缓冲液中,密封避光静置2.5h,过滤并采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为7.1,即得到活化后大孔树脂。
(5)将活化后大孔树脂、脂肪酶加入pH为4.5的磷酸缓冲液(85mmol/L)中,得到固定体系;将固定体系水浴震荡固化5h,固化完成后先过滤,然后在30℃、-0.1MPa真空度条件下真空干燥6h,即得。其中,固定体系中活化后大孔树脂的浓度为45g/L,脂肪酶的浓度为780μg/mL,固定温度为25℃。
实施例2
本实施例提供一种固定化脂肪酶,其脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,固定化载体为D3520大孔树脂;
其制备方法为:
(1)将大孔树脂浸泡于95%的乙醇,密封避光静置浸泡24h,过滤并采用水冲洗至无乙醇气味;
(2)将步骤(1)得到的大孔树脂浸泡于5%的盐酸溶液,密封避光静置4h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为7;
(3)将步骤(2)得到的大孔树脂浸泡于2%的氢氧化钠溶液中,密封避光静置4h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为7;
(4)将步骤(3)得到的大孔树脂浸泡于pH为7的磷酸缓冲液中,密封避光静置2h,过滤并采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为7,即得到活化后大孔树脂。
(5)将活化后大孔树脂、脂肪酶加入pH为5的磷酸缓冲液(25mmol/L)中,得到固定体系;将固定体系水浴震荡固化4h,固化完成后先过滤,然后在30℃、-0.1MPa真空度条件下真空干燥6h,即得。其中,固定体系中活化后大孔树脂的浓度为30g/L,脂肪酶的浓度为549μg/mL,固定温度为25℃。
对比例1
本对比例提供一种固定化脂肪酶,其与实施例2的不同之处在于,采用的大孔树脂为DA201;其余均与实施例2相同。
对比例2
本对比例提供一种固定化脂肪酶,其与实施例2的不同之处在于,采用的大孔树脂为ADS-17;其余均与实施例2相同。
对比例3
本对比例提供一种固定化脂肪酶,其与实施例2的不同之处在于,采用的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B(CALB);其余均与实施例2相同。
对比例4
本对比例提供一种固定化脂肪酶,其与实施例1的不同之处在于,采用的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(RML);其余均与实施例2相同。
实施例3
将70.4质量份菜籽油(相对分子量为880g/moL,以下实施例相同)和1.84质量份甘油(相对分子量为92g/moL,以下实施例相同)混合均匀,再加入1.5质量份本发明制备的固定化脂肪酶(实施例1),然后在200rpm,55℃反应12h,然后过滤,得到产物。产物经HPLC-ELSD分析,甘油一酯的含量为6.31wt%,甘油二酯的含量为34.92wt%,甘油三酯的含量为57.68wt%。
实施例4
将70.4质量份菜籽油和1.84质量份甘油混合均匀,再加入1.5质量份本发明制备的固定化脂肪酶(实施例2),然后在200rpm,55℃反应12h,然后过滤,得到产物。产物经HPLC-ELSD分析,甘油一酯的含量为5.85wt%,甘油二酯的含量为36.58wt%,甘油三酯的含量为56.37wt%。
实施例5
将73.92质量份菜籽油和1.84质量份甘油混合均匀,再加入1.5质量份本发明制备的固定化脂肪酶(实施例2),然后在200rpm,50℃反应9h,然后过滤,得到产物。产物经HPLC-ELSD分析,甘油一酯的含量为5.42wt%,甘油二酯的含量为35.67wt%,甘油三酯的含量为57.6wt%。
实施例6
将79.2质量份菜籽油和1.84质量份甘油混合均匀,再加入1.5质量份本发明制备的固定化脂肪酶(实施例2),然后在200rpm,50℃反应9h,然后过滤,得到产物。产物经HPLC-ELSD分析,甘油一酯的含量为5.24wt%,甘油二酯的含量为35.01wt%,甘油三酯的含量为58.47wt%。
对比例5
本对比例与实施例3的区别在于,采用对比例1的固定化脂肪酶,其余均与实施例3相同。
经测定,其产物中甘油一酯的含量为9.52wt%,甘油二酯的含量为27.34wt%,甘油三酯的含量为61.38wt%。
对比例6
本对比例与实施例3的区别在于,采用对比例2的固定化脂肪酶,其余均与实施例3相同。
经测定,其产物中甘油一酯的含量为6.84wt%,甘油二酯的含量20.14wt%,甘油三酯的含量为73.04wt%。
对比例7
本对比例与实施例3的区别在于,采用对比例3的固定化脂肪酶,其余均与实施例3相同。
经测定,其产物中甘油一酯的含量为8.04wt%,甘油二酯的含量为36.75wt%,甘油三酯的含量为54.01wt%。
对比例8
本对比例与实施例4的区别在于,采用对比例4的固定化脂肪酶,其余均与实施例3相同。
经测定,其产物中甘油一酯的含量为8.23wt%,甘油二酯的含量为38.41wt%,甘油三酯的含量为52.13wt%。
对比例9
将50质量份酸价为50KOH/(mg/g)、甘油三酯含量为74.9wt%的菜籽油与4.1质量份甘油混合均匀,再加入2.6质量份固定化酶Novozym 435(购买于Novozymes公司),然后在70℃、500rpm及抽真空的条件下搅拌反应10小时,得到产物。采用HPLC-ELSD分析产物的组成,本实施例所得产物中甘油一酯的含量为12.37wt%,甘油二酯的含量为68.10wt%,甘油三酯的含量为19.31wt%。
以上所述是发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种固定化脂肪酶,其特征在于,脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,固定化载体为D3520大孔树脂;
所述固定化脂肪酶用于催化甘油解反应制备甘油二酯,催化得到的产物中,甘油一酯的含量≤6.5wt%。
2.一种固定化脂肪酶的制备方法,用于制备如权利要求1所述的固定化脂肪酶,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将D3520大孔树脂依次用乙醇、酸、碱和缓冲液浸泡,得到活化后大孔树脂;
(2)将活化后大孔树脂、脂肪酶加入预设pH的磷酸缓冲液中,得到固定体系;将所述固定体系混合预设时间,固液分离、干燥后得到固定化脂肪酶。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述固定体系中,所述活化后大孔树脂的含量为20~50g/L,所述脂肪酶的浓度为500~800μg/mL。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,将所述固定体系在20~30℃固定2~5h,固定过程中进行水浴震荡。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)包括:
(1.1)将大孔树脂浸泡于90~95%的乙醇中20~40h,过滤并采用水冲洗;
(1.2)将步骤(1.1)得到的大孔树脂浸泡于2~10%的盐酸溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
(1.3)将步骤(1.2)得到的大孔树脂浸泡于2~10%的氢氧化钠溶液中2~5h,过滤并采用水冲洗至滤液pH为6.8~7.2;
(1.4)将步骤(1.3)得到的大孔树脂浸泡于pH为6.8~7.2的磷酸缓冲液中1~3h,过滤并采用磷酸缓冲液冲洗至滤液pH为6.8~7.2,即得到活化后大孔树脂。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述乙醇浓度为95%,所述盐酸溶液浓度为5%,所述氢氧化钠溶液浓度为5%。
7.如权利要求1所述的固定化脂肪酶在催化甘油解反应制备甘油二酯中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,将甘油、油脂、权利要求1所述的固定化脂肪酶混合,在50~60℃反应3~16h,固液分离即得甘油二酯成品。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,甘油、油脂的摩尔比为1:(4~4.5),固定化脂肪酶的用量为甘油、油脂总重量的3.5~4.5wt%;
所述油脂选用大豆油、棕榈油、菜籽油、玉米油、花生油、山茶油中的一种或多种。
10.一种用于食品的甘油二酯,其特征在于,其由如权利要求1所述的固定化脂肪酶催化甘油解反应制备而得。
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