CN110050070A - 用于组织样品的全自动化核酸提取方法 - Google Patents
用于组织样品的全自动化核酸提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110050070A CN110050070A CN201780077953.XA CN201780077953A CN110050070A CN 110050070 A CN110050070 A CN 110050070A CN 201780077953 A CN201780077953 A CN 201780077953A CN 110050070 A CN110050070 A CN 110050070A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acid
- tissue
- reagent
- glass slides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 316
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 203
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 200
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 200
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 166
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 112
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 104
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 88
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 310
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 37
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 29
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 29
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 25
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 24
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 24
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 16
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 claims description 15
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 8
- 230000015654 memory Effects 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 claims description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 124
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 40
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 27
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 25
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 13
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 13
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 10
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 4
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- -1 trypsase Proteins 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010053487 Exposure to toxic agent Diseases 0.000 description 1
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 description 1
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241001510071 Pyrrhocoridae Species 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 240000002825 Solanum vestissimum Species 0.000 description 1
- 235000018259 Solanum vestissimum Nutrition 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N bis(4-fluorophenyl)-methyl-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)silane;methyl n-(1h-benzimidazol-2-yl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1.C=1C=C(F)C=CC=1[Si](C=1C=CC(F)=CC=1)(C)CN1C=NC=N1 VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Abstract
公开了用于从置于载玻片上的一个或多个组织样品提取核酸的自动化方法。所述方法利用自动化载玻片染色装置，其将多种核酸提取试剂分配到组织样品上，从而产生提取的核酸样品。所述提取的核酸样品可以直接用于下游应用，例如核酸扩增或测序程序，或者可以进一步纯化。
Description
发明领域
本发明涉及用于组织样品的核酸提取方法，更具体地涉及用于从组织样品提取核酸(例如DNA，RNA)的自动化方法，所述组织样品例如封装在载玻片上的组织样品，包括但不限于用于组织化学染色或其他染色(例如，免疫组织化学，原位杂交，苏木精和伊红染色(H&E)等)的组织样品。
背景技术
免疫组织化学(IHC)是指使用特异性结合部分(例如对于特定抗原特异性的抗体)，来检测、定位和/或定量生物样品中的抗原(例如蛋白质)的方法。IHC提供了鉴定特定蛋白质在组织样品中的确切位置的实质性优势。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH两者均可在各种生物样品上进行，所述生物样品例如组织(例如新鲜冷冻的、福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织)和细胞学样品。可以使用各种标记(例如，生色、荧光、发光、辐射测量标记等)检测靶标的识别。
癌症患者组织样品的核酸序列分析提供了新的见解，其可用于指导对这种异质和复杂疾病的治疗和加强其理解。利用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的分子研究的成功取决于提取的DNA和/或RNA的数量和质量二者。在档案和当前分析中遇到的障碍是从广泛用于诊断疾病的FFPE组织提取核酸。从FFPE组织提取核酸通常是费力且困难的，并且提取过程很少或没有标准化。核酸的分离通常涉及将组织样品从载玻片刮入管(例如Eppendorf管)中，并使用目前已知的手动方法(例如，可商购的试剂盒)分离和纯化核酸。这些方法有几个缺点。例如，通常需要对样品进行脱蜡，并且在刮削期间存在样品损失的风险。对于小样品或稀有样品，样品丢失尤其成问题。此外，可商购的试剂盒昂贵，手动且耗时，通常需要过夜酶促消化。另外，可商购的手动核酸提取试剂盒通常需要使用危险化学品(例如，用于脱蜡的二甲苯)并且需要进一步纯化核酸，然后才能进一步用于其他下游应用。
发明内容
令人惊讶地发现，可以在自动化染色机上从FFPE组织样品提取核酸。提取程序完全在仪器上进行。此外，提取可以在仅仅几个小时(例如，仅仅两个多小时)内完成。所有步骤都是自动化的；因此，没有用户动手时间(这也有助于减少提取期间的可变性和误差)，并且没有化学品暴露于用户。由于FFPE样品的广泛使用，本发明的核酸提取方法可用于大多数解剖病理学样品。进一步的优点包括提取用于回顾性研究的核酸的能力和从先前用于组织化学(例如，免疫组织化学，原位杂交)，染色(例如H&E等)等的样品提取核酸的能力。本发明的方法可用于染色的载玻片上。在一些实施方案中，本发明的方法可用于未染色的载玻片上。另外，可以同时使用多个载玻片，例如，一次30个载玻片。
所述方法的特征在于脱蜡步骤，抗原修复步骤，蛋白酶处理步骤和用于从组织洗脱DNA或RNA的洗脱步骤(例如，加热步骤)。在一些实施方案中，所述方法(例如，RNA提取方法)的特征还在于以硫氰酸胍或等同试剂为特征的额外处理步骤。不希望将本发明限制于任何理论或机制，令人惊讶的是，通常仅在免疫组织化学(IHC)程序期间使用的抗原修复步骤有益于自动化核酸提取。
本文所述的自动化核酸提取方法提供了相比于市售试剂盒改进的样品质量以及与市售试剂盒相当至更好的样品产率。提取的核酸的分析表明，通过本文的自动化方法提取的DNA和RNA的降解远远小于使用市售方法提取的样品。本文的自动化提取方法还具有可用于组织可用性有限的情况下的潜力。对许多组织样品进行组织染色，并且没有足够的过量组织进行分子分析。本文的自动化方法已展示了有效地从先前染色的组织中回收DNA的效用，从而使用户拥有将单个组织切片染色并在相同切片上进行分子分析的独特机会，从而消除对过量组织的需要。
使用本文所述的自动化方法提取的核酸适用于各种下游应用。例如，使用本文的自动化方法提取的DNA可以是用于基于PCR的分析、凝胶分析和测序的可用模板。使用本文的自动化方法提取的RNA可用于凝胶分析，cDNA合成，后续PCR，测序等。
在一个方面，本发明的特征在于用于从置于载玻片上的一个或多个组织样品(例如，新鲜，冷冻，FFPE组织样品等)提取核酸的自动化方法。所述方法利用自动化载玻片染色机以预定顺序将多种核酸提取试剂自动分配到一个或多个组织样品，使得所述试剂与一个或多个载玻片上的一个或多个组织样品接触，以分别处理一个或多个组织样品。所述方法还包括使用所述试剂处理一个或多个样品，从而产生包含提取的核酸的一个或多个提取的核酸样品。
在另一方面，所述方法还包括将一个或多个提取的核酸样品从一个或多个载玻片移出(例如，至管或其他容器中)。所述方法可以进一步包括纯化和/或分析来自一个或多个提取的核酸样品的核酸。在一些实施方案中，所述分析可包括提取的核酸样品的扩增，提取的核酸样品的测序，其组合等。
在一些实施方案中，提取的核酸是DNA。在一些实施方案中，提取的核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸提取试剂选自脱蜡溶液，缓冲液，去污剂，表面活性剂，蛋白酶，盐，酶和醇。在一些实施方案中，组织样品是新鲜的，冷冻的，福尔马林固定或石蜡包埋的(FFPE)。在一些实施方案中，样品是液体细胞学样品。在一些实施方案中，一个或多个组织样品被染色。
如前所述，在一些实施方案中，所述方法包括对一个或多个样品进行脱蜡步骤(例如，使用脱蜡溶液、缓冲液等处理所述一个或多个样品)。在一些实施方案中，所述方法包括对一个或多个样品进行抗原修复(例如，使用抗原修复溶液、缓冲液等处理所述一个或多个样品)。在一些实施方案中，所述方法包括对一个或多个样品进行蛋白酶处理步骤(例如，使用蛋白酶、酶等处理所述一个或多个样品)。在一些实施方案中，所述方法包括对一个或多个样品进行洗脱步骤(例如，用热处理所述一个或多个样品)。
在一些实施方案中，所述方法的特征在于在上述步骤(例如，脱蜡步骤，抗原修复步骤等)之前切除不需要的组织。
在一些实施方案中，提取的核酸为10至500bp。在一些实施方案中，提取的核酸为50至500bp。在一些实施方案中，提取的核酸为100至1000bp。在一些实施方案中，提取的核酸为100至2000bp。在一些实施方案中，提取的核酸为10至3000bp。在一些实施方案中，提取的核酸长度大于3,000bpd。
本发明的特征在于用于从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取核酸(例如DNA，RNA)的自动化方法。在一些实施方案中，所述方法包括在自动化染色机中，使用脱蜡试剂处理所述一个或多个载玻片上的样品；使用抗原修复缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；使用蛋白酶缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；和加热所述一个或多个载玻片上的样品以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含来自相应样品的分离的核酸。
在一些实施方案中，所述方法还包括从一个或多个载玻片上的样品移出洗脱液。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化分离的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括对分离的核酸进行核酸扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括分析分离的核酸。在一些实施方案中，所述分析包括测序。在一些实施方案中，所述方法还包括在使用蛋白酶处理一个或多个载玻片上的样品后，使用硫氰酸胍处理一个或多个载玻片上的样品。
在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。在一些实施方案中，样品是显微切割的样品。在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是未染色的样品。在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是染色的样品。在一些实施方案中，染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
在一些实施方案中，自动化染色机包括一个或多个用于将脱蜡试剂，抗原修复缓冲液和蛋白酶分配到一个或多个载玻片上的样品的分配器。在一些实施方案中，自动化染色机还包括用于加热一个或多个载玻片上的样品的加热元件。
本发明的特征在于用于从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取RNA的自动化方法。在一些实施方案中，所述方法包括在自动化染色机中，使用脱蜡试剂处理所述一个或多个载玻片上的样品；使用抗原修复缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；使用蛋白酶处理所述一个或多个载玻片上的样品；使用硫氰酸胍处理所述一个或多个载玻片上的样品；和加热所述一个或多个载玻片上的样品以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含来自相应样品的分离的核酸。
在一些实施方案中，所述方法还包括从一个或多个载玻片上的样品移出洗脱液。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化分离的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括对分离的核酸进行核酸扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括分析分离的核酸。在一些实施方案中，所述分析包括测序。
在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是FFPE样品、新鲜样品或冷冻样品。在一些实施方案中，样品是显微切割的样品。在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是未染色的样品。在一些实施方案中，一个或多个载玻片上的样品是染色的样品。在一些实施方案中，染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
本发明的特征还在于从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取核酸(例如DNA，RNA)的自动化方法。所述方法可包括在自动化载玻片染色装置中接收包含一个或多个组织样品的一个或多个载玻片，其中所述自动化载玻片染色装置配置成将多种核酸提取试剂自动分配到一个或多个组织样品，以分别处理所述一个或多个组织样品；以预定顺序分配所述试剂，使得所述试剂与一个或多个载玻片上的一个或多个组织样品接触；和使用所述试剂处理所述一个或多个组织样品，从而产生包含提取的核酸的一个或多个提取的核酸样品。
在一些实施方案中，所述方法还包括从一个或多个载玻片移出一个或多个提取的核酸样品。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化来自一个或多个提取的核酸样品的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括分析来自一个或多个提取的核酸样品的核酸。在一些实施方案中，所述分析包括进行核酸扩增。在一些实施方案中，所述分析包括核酸测序。
在一些实施方案中，核酸提取试剂选自脱蜡溶液，缓冲液，去污剂，表面活性剂，蛋白酶，盐，酶和醇。在一些实施方案中，一个或多个组织样品是新鲜的，冷冻的，福尔马林固定或石蜡包埋的。在一些实施方案中，一个或多个组织样品被染色。
本发明的特征还在于用于从载玻片上的样品分离核酸(例如DNA，RNA)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将样品放在自动化染色机上的载玻片上；并在自动化染色机上运行提取方案。在一些实施方案中，所述方法包括将样品放在切割仪器上的载玻片上；将载玻片上的样品切割以去除不需要的组织；将样品放在自动化染色机上的载玻片上；并在自动化染色机上运行提取方案。提取方案指示自动化染色机以预定顺序分配试剂，使得所述试剂与载玻片上的样品接触，从而在载玻片上的样品上产生包含分离的核酸样品的洗脱液，所述分离的核酸样品包含分离的核酸。
在一些实施方案中，所述方法还包括移出载玻片上的样品上的洗脱液。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化分离的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括对分离的核酸进行核酸扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括分析分离的核酸。在一些实施方案中，分析包括测序。在一些实施方案中，试剂包括硫氰酸胍。在一些实施方案中，样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。在一些实施方案中，样品是未染色的样品。在一些实施方案中，样品是染色的样品。在一些实施方案中，染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
本发明的特征还在于用于在自动化染色机上的核酸提取的试剂盒。试剂盒可包含本文公开的任何试剂或其组合。例如，试剂盒可包含脱蜡缓冲液，抗原修复缓冲液和蛋白酶处理缓冲液。试剂盒可以进一步包含洗脱缓冲液。试剂盒还可包含硫氰酸胍处理试剂。
本发明还提供了工作流程方法，例如，用于从患者的肿瘤加工和制备组织切片并从如本文所述的样品提取DNA的方法。例如，所述方法可以包括从患者的肿瘤制备组织切片，例如，使用显微切片机(microtome)将患者肿瘤的FFPE组织样品切片；将组织切片封装在载玻片上；并利用自动化载玻片染色机将多种核酸提取试剂自动分配到组织切片，从而产生包含提取的核酸的提取的核酸样品。
本发明还提供了用于执行本文方法的自动化染色机。本发明还提供了自动化染色机，其包括耦合到处理器的存储器，其中所述存储器存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由所述处理器执行时，使得自动化染色机执行根据本发明的方法的操作。
本发明还提供了用于执行根据本发明方法的自动化系统，其包括载玻片保持器、试剂和分配器。在一些实施方案中，所述系统包括耦合到处理器的存储器，其中所述存储器存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由所述处理器执行时，使得自动化系统执行本文方法的操作。在一些实施方案中，分配器适于将试剂分配到载玻片保持器中的载玻片上。
本发明还提供了工作流程方法。在一些实施方案中，所述方法包括在载玻片上从患者组织制备组织切片；对所述组织切片应用根据本发明的方法，其中所述方法用于提取核酸。在一些实施方案中，患者组织是肿瘤组织。
本发明还提供了用于纯化核酸的自动化系统。在一些实施方案中，所述系统包括用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据本发明的方法，其中所述方法纯化核酸。
本发明还提供了用于分析核酸的自动化系统。在一些实施方案中，所述系统包括用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据本发明的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行用于分析纯化核酸的方法。在一些实施方案中，用于分析核酸的方法包括扩增核酸。在一些实施方案中，用于分析核酸的方法包括测序核酸。
本发明还提供了用于扩增核酸的自动化系统。在一些实施方案中，所述系统包括用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据本发明的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行用于扩增纯化核酸的方法。
本发明还提供了用于测序核酸的自动化系统。在一些实施方案中，所述系统包括用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据本发明的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行对纯化的核酸进行测序的方法。
本文描述的任何特征或特征的组合包括在本发明的范围内，条件是任何这样的组合中包括的特征不是相互矛盾的，这将由上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识而显而易见。本发明的其他优点和方面在以下详细描述和权利要求中是显而易见的。
附图简述
本申请文件包含至少一幅彩绘的图。含有彩图的本专利或专利申请的副本将在请求和缴纳必需费用后由专利局提供。
图1显示了说明本发明的核酸提取方法的实施方案的流程图。
图2显示了使用市售FFPE DNA提取试剂盒或本发明的自动化方法从未染色的载玻片提取的DNA的片段长度。图片是通过相应方法提取的纯化DNA的代表性电泳图。样品是固定扁桃体的组织切片。所有样品均来自相同的组织块，并使用连续的载玻片切片。在分析之前，对样品进行柱纯化。使用本发明的方法从载玻片提取更长的DNA片段。
图3A显示了市售FFPE DNA提取试剂盒与本发明的提取方法之间(对于GAPDH)的DNA提取效率的比较。样品包括肝脏样品(肿瘤和正常样品)，扁桃体样品，膀胱样品(肿瘤和正常样品)和胎盘样品。肝脏样品为6个月龄。扁桃体样品为7个月龄。膀胱样品为21个月龄。胎盘样品为10个月龄。样品未染色。误差线表示差异的标准误差。本发明的提取方法显示等同(或更高)的效率。
图3B显示了市售FFPE DNA提取试剂盒与本发明的提取方法之间(对于ACTB)的DNA提取效率的比较。样品包括肝脏样品(肿瘤和正常样品)，扁桃体样品，膀胱样品(肿瘤和正常样品)和胎盘样品。肝脏样品为6个月龄。扁桃体样品为7个月龄。膀胱样品为21个月龄。胎盘样品为10个月龄。样品未染色。误差线表示差异的标准误差。本发明的提取方法显示出等同(或更高)的效率。
图3C显示了市售FFPE DNA提取试剂盒与本发明的提取方法之间(对于18s rRNA)的DNA提取效率的比较。样品包括肝脏样品(肿瘤和正常样品)，扁桃体样品，膀胱样品(肿瘤和正常样品)和胎盘样品。肝脏样品为6个月龄。扁桃体样品为7个月龄。膀胱样品为21个月龄。胎盘样品为10个月龄。样品未染色。误差线表示差异的标准误差。本发明的提取方法显示出等同(或更高)的效率。
图4显示了与市售试剂盒相比，使用本发明的自动化方法的DNA提取效率(以倍数增加计)。使用的样品是H&E染色的载玻片(4微米组织切片)。
图5显示了与市售试剂盒相比，使用本发明的自动化提取方法对使用AVENIOMillisect(Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA)显微切割的载玻片的DNA提取效率(显示为相对于市售试剂盒的倍数增加)。本发明的方法优于市售试剂盒。
图6显示了在使用AVENIO Millisect (Roche Molecular Systems, Pleasanton,CA)显微切割之前和显微切割(和仪器的研磨路径)之后的4微米样品的图片(对于图5中的实例完成的切片)。在显微切割后的组织切片的图片中，白色区域指示留在载玻片上的组织。
图7显示了使用本发明的自动化方法和市售FFPE DNA提取试剂盒提取的RNA的质量的比较。图片是通过相应方法提取的纯化RNA的代表性电泳图。注意，所有浓度均归一化，且所有样品均来自相同的组织块，并使用连续的载玻片切片。使用本发明的方法提取的RNA具有更高的质量。
优选实施方案的描述
定义
如本文所用，术语“样品”和“生物样品”应指含有或假定含有生物标志物的任何组合物，或针对特定生物标志物的存在或不存在进行测试的组合物。样品可包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分，例如DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。样品可以是福尔马林固定的，石蜡包埋的(FFPE)组织样品，例如来自肿瘤或转移性病变，例如原发性肿瘤或转移性肿瘤。样品也可来自先前冷冻的或新鲜的组织，或来自液体样品，例如血液或血液组分(血浆或血清)，尿液，精液，唾液，痰液，粘液，精液，泪液，淋巴液，脑脊髓液，从拭子洗出的材料等。样品还可包括从个体获得的细胞(包括细胞系)的体外培养物的成分和组分。样品也可以由从个体直接获得的样品部分加工，例如细胞裂解物或耗尽红细胞的血液。
如本文所用，术语“组织样品”应指细胞样品，其保留细胞之间的横截面空间关系，如同它们存在于获得所述样品的受试者体内。“组织样品”应包括原代组织样品(即受试者产生的细胞和组织)和异种移植物(即植入受试者的外来细胞样品)。
如本文所用，“组织化学检测”是指涉及以允许在组织样品的结构之间的横截面关系的背景下进行对生物标志物或其他结构的显微检测的方式，用检测试剂标记组织样品中的生物标志物或其他结构的过程。实例包括福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的亲和组织化学(AHC)，免疫组织化学(IHC)，显色原位杂交(CISH)，荧光原位杂交(FISH)，银原位杂交(SISH)和H&E染色。
如本文所用，术语“切片”应指适合用于显微镜分析，通常使用显微切片机切割的组织样品的薄片。当用作动词时，术语“切片”是指制作组织样品的切片，通常使用显微切片机。
如本文所用，术语“受试者”是指任何多细胞脊椎动物生物体，例如人或非人哺乳动物(例如，兽医受试者)。
如本文所用，术语“核酸”包括DNA (脱氧核糖核酸)和RNA (核糖核酸)。
当用作名词时，术语“染色剂”应指可用于使细胞样品中的特定分子或结构可视化以进行显微镜分析的任何物质，所述显微镜分析包括明视场显微镜，荧光显微镜，电子显微镜等。当用作动词时，术语“染色”应指导致染色剂在细胞样品(例如，组织样品，细胞学样品等)上沉积的任何过程。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有如由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier (第四版，2007)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个("a"或"an")”旨在表示“一个或多个”。当在步骤或元件的描述之前时，术语“包含("comprise" "comprises"和"comprising")”旨在表示其他步骤或元件的添加是任选的并且不排除。
发明描述
本发明的特征在于用于从置于载玻片上的一个或多个组织样品提取核酸的自动化方法。所述方法利用自动化载玻片染色装置，其将多种试剂分配到组织样品上以产生提取的核酸样品。提取的核酸样品可用于各种下游应用，包括但不限于核酸扩增，测序程序，进一步纯化等。
与可商购的试剂盒相比，本发明的提取可以快得多地完成。例如，对于多个载玻片(例如，约30个载玻片)，核酸方法可在约2.5小时内完成，其中动手操作时间要求为约5分钟，以将载玻片放置在仪器上，启动仪器，以及当仪器已经完成提取过程时，移取出洗脱的核酸。FFPE DNA分离试剂盒(用于加工多个载玻片，例如约24个载玻片)花费约5小时，其中动手操作时间要求为约2.6小时，用于脱蜡，移取裂解缓冲液和蛋白酶K，涡旋，旋转，取出管，移取更多缓冲液或异丙醇，柱纯化和洗脱。对于本发明，所需时间的减少，包括所需的动手操作时间的减少，有助于降低劳动力成本，减少错误，改善标准化并改善样品的周转时间。本发明的方法还通过消除实验室人员对于可商购的试剂盒或传统方法中常用的有害化学物质的暴露来提高安全性。
简而言之，本发明的特征在于用于从置于载玻片上的一个或多个组织样品(例如，新鲜，冷冻，FFPE组织样品，液体细胞学样品等)提取核酸的自动化方法。所述方法利用自动化载玻片染色机以预定顺序将多种试剂自动分配到一个或多个组织样品，使得所述试剂与一个或多个载玻片上的一个或多个组织样品接触，以分别处理一个或多个组织样品。所述方法还包括用所述试剂处理一个或多个样品，从而产生包含提取的核酸的一个或多个提取的核酸样品。所述方法可以进一步包括将一个或多个提取的核酸样品从一个或多个载玻片移出(例如，至管或其他容器中)。
自动化染色机
本发明的方法在自动化染色机(载玻片染色机)或其他适当的自动化载玻片加工机上进行。自动化染色机(例如，IHC/ISH载玻片染色机)的具体实例包括：itelliPATH (BiocareMedical)、WAVE (Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS和DAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK XT (Ventana Medical Systems, Inc.)、BENCHMARKULTRA (Ventana Medical Systems, Inc.)、BENCHMARK GX (Ventana Medical Systems,Inc.)、VENTANA H&E 600 (Ventana Medical Systems, Inc.)、BENCHMARK SpecialStains (Ventana Medical Systems, Inc.)、DISCOVERY XT (Ventana Medical Systems,Inc.)、VENTANA DISCOVERY ULTRA (Ventana Medical Systems, Inc.)、Leica BOND，和Lab Vision Autostainer (Thermo Scientific)。自动化染色机(自动化载玻片染色机)也描述于Prichard, Overview of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol LabMed., Vol. 138, pp. 1578–1582 (2014)，其通过引用以其整体并入本文。另外，VentanaMedical Systems, Inc.是公开了用于执行自动化分析的系统和方法的许多美国专利的受让人，所述美国专利包括美国专利号5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开专利申请号20030211630和20040052685，其各自通过引用以其整体并入本文。本发明的方法可适于在任何适当的自动化染色机(或自动化载玻片加工机)上进行。
自动化载玻片染色机通常至少包括用于将试剂分配到载玻片上以实施染色方案的染色器单元。可商购的染色单元通常基于以下原理之一操作：(1) 开放式单个载玻片染色，其中载玻片水平放置并且试剂作为液体团(puddle)分配在含有组织样品的载玻片的表面上(例如在DAKO AUTOSTAINER Link 48 (Agilent Technologies)和intelliPATH(Biocare Medical)染色机上实施)；(2) 液体覆盖技术，其中试剂由沉积在样品上的惰性流体层覆盖或分配(例如在VENTANA BENCHMARK和VENTANA DISCOVERY仪器上实施)；(3) 毛细管间隙染色，其中载玻片表面紧密平行于另一个表面(其可以是另一载玻片或盖板)放置，以产生狭窄的间隙，毛细管力通过所述间隙拉起并保持液体试剂与样品接触(例如DAKOTECHMATE，Leica BOND和DAKO OMNIS染色机使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代(iterations)不混合间隙中的流体(例如在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在毛细管间隙染色的一些变型中，试剂在间隙中混合，例如平移间隙技术，其中在载玻片和弯曲表面之间产生间隙，并且表面相对于彼此的移动实现混合(参见美国专利号7,820,381，转让给Ventana Medical Systems，Inc.)；和动态间隙染色，其使用类似于毛细管间隙染色的毛细管力将样品应用于载玻片，且然后将平行表面相对于彼此平移以在孵育期间搅动试剂，从而实现试剂混合(例如在DAKO OMNIS载玻片染色机(Agilent)上实施的染色原理)。最近已提出使用喷墨技术在载玻片上沉积试剂。参见转让给Ventana Medical Systems，Inc.的PCT公开号WO 2016-170008 A1。
例如，VENTANA DISCOVERY ULTRA仪器的特征在于具有30个独立的载玻片反应室的载玻片抽屉，其具有专用的批量试剂供应管线和单独的载玻片加热器，具有35个试剂位置的试剂圆盘传送带，和在3-至6-升的机载容器中容纳多达7种不同批量试剂的能力。所述系统具有从环境温度高至约100℃的载玻片温度范围。VENTANA BENCHMARK SpecialStains仪器具有用于加工多至20个载玻片的载玻片圆盘传送带，其对每个位置具有独立的温度控制，具有25个试剂位置的试剂圆盘传送带，以及在3-至6-升的机载容器中容纳多达4种批量溶液的能力。BENCHMARK ULTRA仪器可加工多达30个载玻片，其中对每个位置具有独立的加工/功能性和温度控制。所述系统具有带有35个试剂位置的试剂圆盘传送带，和容纳多达7种不同批量试剂的能力，可以更换所述试剂而不中断加工。所述系统具有从环境温度高至约100℃的载玻片温度范围。
这个染色原理和染色机的列表并不旨在是详尽的，并且本发明的方法和系统旨在包括可用于将适当试剂施加至样品的任何染色技术和系统(已知的和将来开发的二者)。
样品
用于本发明方法中的样品是载玻片上的组织样品。组织样品可以是适合于在(如本文所述的)自动化染色机上进行组织学检查的任何类型。例如，组织样品可包括活组织检查或手术切除。组织样品可以进一步包括癌症或健康组织的切片。组织样品可以取自液体细胞学样品。
可以加工样品并将其粘附到载玻片上。涉及的加工步骤取决于计划的分析类型。例如，组织样品可以是新鲜的，冷冻的，福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)等。在一些实施方案中，固定组织样品以保持细胞或组织的形状。常用的固定剂包括甲醛，乙醇，甲醇和/或苦味酸。可以将组织片包埋在石蜡中以增加其机械强度和稳定性并使它们更易于切成薄片。
然后，可将组织样品封装到载玻片上。封装通常涉及将样品贴在显微镜载玻片上以进行观察和分析。在一些实施方案中，细胞可以直接在载玻片上生长。对于松散细胞样品(如血涂片或子宫颈抹片)，样品可直接施加到载玻片。对于其他类型的样品，使用显微切片机制作薄切片(薄片)；然后，可以使用本领域技术人员已知的方法封装这些薄片。
在一个实施方案中，组织样品可以是未染色的。在其他实施方案中，在进行本发明的核酸分离方法之前，对组织样品进行染色。例如，可以将样品浸入(在固定和封装之前或之后)染料溶液中，随后漂洗和观察。另外，染料可以沉积在封装在载玻片上的样品上。此类染色剂可包括例如苏木精和伊红染色剂，用于组织化学的染色剂(例如，免疫组织化学染色剂和原位杂交染色剂)，以及其他类型的染色剂。这些和其他类型的组织染色剂和染色技术是本领域技术人员所熟知的。然后可以通过本领域熟知的方法分析染色的载玻片，例如用显微镜或通过数字扫描。
FFPE组织的显微切割通常用于特定感兴趣区域的分子分析。在一些实施方案中，本发明的组织样品是显微切割的样品，例如，组织的一个或多个切片可以被显微切割出或分离以仅将感兴趣的组织或区域留在载玻片上。可以使用本领域技术人员已知的方法产生从组织样品分离或切割出的一个或多个部分。例如，临床分子诊断实验室中的组织切割通常通过直接从标准载玻片手动刮下组织(通过手术刀或剃刀刀片)来进行。可以使用激光捕获显微切割(LCM)仪器或AVENIO Millisect组织切割系统(Roche Molecular Systems,Pleasanton, CA)进行组织显微切割。在一些实施方案中，来自染色和封装的组织切片(例如，H&E切片)的图像被预先标记以识别感兴趣的区域(例如，肿瘤细胞)，然后用于使用切割仪器上的仪器软件指导切割，以去除组织的不感兴趣的区域(例如，非癌切片)。然后，可以对代表感兴趣组织的剩余粘附组织切片进行如本文所公开的自动化核酸提取过程。因此，与目前的手动方法相比，本发明的方法允许从较小的组织切片提取核酸。
在一些实施方案中，本发明的方法可有效地从单个4至10微米组织样品提取核酸。大多数目前的手动方法需要8到10微米的切片，或者将多个切片合并成单个样品。由于样品量小，本方法还允许提取含有稀有或不常存在的基因的切片。当可用于分析的组织量非常少时，所述方法也是有用的。
自动化提取方法的概述
图1说明了本发明的自动化核酸提取方法(100)的非限制性实施方案。例如，所述方法的特征在于使用具有一个或多个组织样品(115)的一个或多个载玻片(110)。
参考图1中的箭头(117)，自动化核酸提取方法(100)在自动化染色机(120)(例如，IHC/ISH载玻片染色机)或包括至少一个用于分配试剂的单元的其他自动化载玻片加工系统上实施。上文大体描述了自动化染色机。这个染色原理的列表并不旨在是详尽的，并且本发明的方法和系统旨在包括可用于将适当试剂施加至样品的任何染色技术(已知的和将来开发的二者)。
如果样品(115)是包埋在石蜡中的样品，则可以使用适当的脱蜡流体，用自动化染色机(120)对样品(115)进行脱蜡。在废物清除器去除脱蜡流体后，可以将任何数量的物质连续施加到样品(115)。所述物质可用于预处理，细胞裂解，变性，洗涤等。
自动化染色机(120)可以将多种核酸提取试剂(130)施加到样品。试剂(130)可包括但不限于缓冲剂，去污剂，表面活性剂，蛋白酶，盐，酶和醇。试剂(130)可以是流体(例如，气体，液体或气体/液体混合物)等。试剂(130)可以是溶液(例如，水溶液或其他类型的溶液)等。在一些实施方案中，试剂(130)包括用于包埋组织样品的脱蜡的那些试剂。此类试剂可包括例如二甲苯和醇。这些试剂具有毒性，并且作为危险化学品管理。由于本发明的方法是自动化的并且在自动化染色机(120)上进行，本方法大大降低了通常与从FFPE组织的脱蜡和核酸相关的化学暴露风险。
在一些实施方案中，自动化载玻片染色机(120)可包括一个或多个加热或冷却元件(140)。在一个实例中，如本领域技术人员已知的，这些元件(140)用于升高或降低包含一个或多个组织样品(115)的载玻片(110)的温度。
再次参考图1，自动化载玻片染色装置(120)被配置成将多种核酸提取试剂(130)自动分配到一个或多个组织样品(115)以分别处理所述一个或多个组织样品(115)。如前所述，此类核酸提取试剂(130)起作用以从组织样品(115)提取核酸。如箭头(145)所示，用提取试剂(130)处理样品(115)产生含有提取的核酸样品(150)的载玻片(110)。
如箭头(155)所示，在一些实施方案中，将提取的核酸样品(150)从载玻片(110)移出并置于容器(160)中，例如Eppendorf管或试管中。提取的样品(150)的移出可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过移取或通过自动化方法。参考箭头(165)，在移出之后，然后可以将提取的核酸样品(150)用于进一步的下游加工，例如通过核酸扩增技术或测序技术，产生加工的提取的核酸样品(180)。
参考箭头(167)，在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法进一步纯化提取的样品(150)，产生纯化的提取的核酸样品(170)。此类纯化方法可以包括，例如，提取纯化(例如，苯酚-氯仿提取)，柱纯化，磁珠纯化和电泳纯化等。参考箭头(175)，纯化的提取的核酸样品(170)然后可以用于进一步的下游加工，例如通过核酸扩增技术或测序技术，产生加工的提取的核酸样品(180)。
通过本文描述的自动化方法100收集的核酸片段的群体比通过当前手动方法收集的片段更长。较长的片段有利于测序应用以及研究单核苷酸多态性、可变剪接、外显子-外显子边界或拷贝数变异的研究。使用自动化方法(100)收集的大多数DNA片段长度超过1500个碱基对。这些片段可立即用于下游应用，如PCR，而无需纯化；但是，如图1中所示，如果需要，可以纯化样品。
在一些实施方案中，提取的核酸为10至500bp。在一些实施方案中，提取的核酸为50至500bp。在一些实施方案中，提取的核酸为100至1000bp。在一些实施方案中，提取的核酸为100至2000bp。在一些实施方案中，提取的核酸为10至3000bp。在一些实施方案中，提取的核酸为1500至3000bp。在一些实施方案中，提取的核酸的长度为至少500bp。在一些实施方案中，提取的核酸的长度为至少1500bp。在一些实施方案中，提取的核酸的长度大于3,000bp。
在一些实施方案中，洗脱液(从洗脱步骤产生的包含提取的核酸的溶液的体积)为20μl至100μl。在一些实施方案中，洗脱液为100μl至500μl。在一些实施方案中，洗脱液为50μl至500μl。在一些实施方案中，洗脱液为100μl至800μl。在一些实施方案中，洗脱液为50μl至1ml。
DNA提取方法
本文的DNA提取方法包括脱蜡步骤，抗原修复步骤，蛋白酶处理步骤和洗脱步骤(例如，加热步骤)。
例如，可以在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与脱蜡缓冲液一起孵育一段时间。脱蜡缓冲液包含用于从组织样品中去除石蜡的试剂。然后，在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与抗原修复缓冲液一起孵育一段时间。抗原修复缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的。然后，在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与蛋白酶处理溶液一起孵育一段时间。蛋白酶处理溶液包含用于酶促消化FFPE组织切片的试剂或蛋白酶。蛋白酶是本领域普通技术人员所熟知的(例如，内肽酶，例如胰蛋白酶，胃蛋白酶等)。洗脱步骤包括将洗脱缓冲液中的样品在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下孵育一段时间。在洗脱步骤之后，移出(移取)样品上的液体团。样品含有提取的DNA。
脱蜡处理步骤可以在55℃至65℃的第一温度(例如，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃等)下进行一段时间，然后在70℃至80℃的第二温度(例如，70℃，71℃，72℃，73℃，74℃，75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃等)下进行一段时间。抗原修复步骤可以在90℃至100℃的温度(例如，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃等)下进行25至45分钟的一段时间(例如，25分钟，26分钟，27分钟，28分钟，29分钟，30分钟，31分钟，32分钟，33分钟，34分钟，35分钟，36分钟，37分钟，38分钟，39分钟，40分钟，41分钟，42分钟，43分钟，44分钟，45分钟等)。蛋白酶处理步骤可以在35℃至40℃的温度(例如，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃等)下进行15至45分钟的一段时间(例如，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟，26分钟，27分钟，28分钟，29分钟，30分钟，31分钟，32分钟，33分钟，34分钟，35分钟，36分钟，37分钟，38分钟，39分钟，40分钟，41分钟，42分钟，43分钟，44分钟，45分钟等)。洗脱步骤可以在90℃至100℃的温度(例如，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃等)下进行15至25分钟的一段时间(例如，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟等)。本发明不限于上述处理温度或时间。
如上文讨论的，使用本文所述的自动化方法提取的核酸适用于各种下游应用。例如，已经证明使用本文的自动化方法提取的DNA是用于基于PCR的分析、凝胶分析和测序的可用模板。
RNA提取方法
本文的RNA提取方法包括脱蜡步骤，抗原修复步骤，蛋白酶处理步骤，硫氰酸胍步骤和洗脱步骤(例如，加热步骤)。硫氰酸胍步骤可包括硫氰酸胍或等效试剂。
例如，可以在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与脱蜡缓冲液一起孵育一段时间。脱蜡缓冲液包含用于从组织样品中去除石蜡的试剂。然后，在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与抗原修复缓冲液一起孵育一段时间。抗原修复缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的。然后，在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与蛋白酶处理溶液一起孵育一段时间。蛋白酶处理溶液包含用于酶促消化FFPE组织切片的试剂或蛋白酶。蛋白酶是本领域普通技术人员所熟知的(例如，内肽酶，例如胰蛋白酶，胃蛋白酶等)。硫氰酸胍步骤包括在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下，将样品与硫氰酸胍(或等效物)一起孵育一段时间。洗脱步骤包括将洗脱缓冲液中的样品在自动化染色机中在特定温度(或温度范围或组合)下孵育一段时间。在洗脱步骤之后，移出(移取)样品上的液体团。样品含有提取的RNA。
脱蜡处理步骤可以在55℃至65℃的第一温度(例如，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃等)下进行一段时间，然后在70℃至80℃的第二温度(例如，70℃，71℃，72℃，73℃，74℃，75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃等)下进行一段时间。抗原修复步骤可以在90℃至100℃的温度(例如，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃等)下进行25至45分钟的一段时间(例如，25分钟，26分钟，27分钟，28分钟，29分钟，30分钟，31分钟，32分钟，33分钟，34分钟，35分钟，36分钟，37分钟，38分钟，39分钟，40分钟，41分钟，42分钟，43分钟，44分钟，45分钟等)。蛋白酶处理步骤可以在35℃至40℃的温度(例如，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃等)下进行15至45分钟的一段时间(例如，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟，26分钟，27分钟，28分钟，29分钟，30分钟，31分钟，32分钟，33分钟，34分钟，35分钟，36分钟，37分钟，38分钟，39分钟，40分钟，41分钟，42分钟，43分钟，44分钟，45分钟等)。硫氰酸胍步骤可以在35℃至40℃的温度(例如，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃等)下进行10到25分钟的一段时间(例如，10分钟，11分钟，12分钟，13分钟，14分钟，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟等)。洗脱步骤可以在90℃至100℃的温度(例如，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃等)下进行15至25分钟的一段时间(例如，15分钟，16分钟，17分钟，18分钟，19分钟，20分钟，21分钟，22分钟，23分钟，24分钟，25分钟等)。本发明不限于上述处理温度或时间。
如上文讨论的，使用本文所述的自动化方法提取的核酸适用于各种下游应用。例如，使用本文的自动化方法提取的RNA可用于凝胶分析、cDNA合成和随后的PCR，以及测序或其他应用。
实施例1：提取方法的分析
实施例1描述了根据本发明的提取方法的分析。本发明不限于此实施例中的方案或试剂。
从组织，特别是FFPE组织手动提取核酸是费力且困难的过程。手动方法有许多限制。例如，试剂会是昂贵的并且提取方案可能长，通常需要过夜酶促消化。手动工作流程也会增加人为错误的可能性。如本文所述，本发明的自动化方法消除了对样品的大量手动操作并减少了脱蜡和核酸提取所需的试剂量。另外，消除手动步骤减少了提取时间。本发明的方法还提供了比手动方法质量更好的样品，并且本发明的方法在DNA提取效率方面也与手动方法相当(或更好)。
为了确定本发明的自动化方法的提取效率，将来自本发明的自动化方法的DNA产率与来自用于FFPE组织的市售DNA提取试剂盒的DNA产率进行比较。从未染色的样品、H&E染色的样品、免疫组织化学染色的样品和显微切割的样品提取DNA。提取效率根据样品类型而变化；然而，本发明的自动化方法在所有测试的样品类型中都展示等同或更好的性能。
在一项研究中，从未染色的结肠、乳房、肝脏和前列腺的连续4微米组织切片提取DNA。使用自动化方法提取的DNA悬浮在约500μl的缓冲液中。使用手动试剂盒提取的DNA在50μl洗脱缓冲液中从纯化柱上洗脱，然后用缓冲液稀释至500μl的总体积。然后，针对三种不同长度的DNA扩增子：ACTB，GAPDH和18s，对DNA样品进行实时PCR分析(参见表1)。
表1：扩增子长度
| 扩增子 | 扩增子长度 | 用途 |
| ACTB | 139 | gDNA扩增 |
| GAPDH | 58 | gDNA扩增 |
| 18S | 187 | gDNA扩增 |
| ACTB | 171 | cDNA扩增 |
| GAPDH | 122 | cDNA扩增 |
| GUSB | 81 | cDNA扩增 |
使用本发明的自动化方法以及市售手动方法的平均循环阈值(Ct)值显示在下表2中。
表2：平均循环阈值(Ct)
| DNA提取方法 | 组织 | 平均Ct值(ACTB) | 平均Ct值(GAPDH) | 平均Ct值(18S) |
| 市售试剂盒 | 结肠 | 30.76 | 28.78 | 28.71 |
| 自动化方法 | 结肠 | 29.47 | 27.59 | 25.97 |
| 市售试剂盒 | 乳房 | 33.95 | 31.84 | 29.43 |
| 自动化方法 | 乳房 | 30.42 | 29.67 | 27.05 |
| 市售试剂盒 | 肝脏 | 29.41 | 27.97 | 25.57 |
| 自动化方法 | 肝脏 | 28.72 | 27.76 | 24.95 |
| 市售试剂盒 | 前列腺 | 29.29 | 27.76 | 26.27 |
| 自动化方法 | 前列腺 | 28.59 | 26.82 | 24.95 |
对于自动化方法的所有Ct值均低于市售手动方法，表明自动化样品以更高效率扩增。相对拷贝数的统计分析显示，自动化方法具有与市售方法相比等同或更高的产率(数据未显示)。对于乳房组织，自动化方法对测试的所有三种扩增子都优于市售试剂盒。对于使用肺组织测试的任何扩增子，提取效率没有统计学上的显著差异。对于结肠和前列腺，自动化方法的效率被认为是等同或更好的，但似乎是扩增子依赖性的。该研究证实自动化方法的稳健性，证实可以从许多临床相关组织类型有效分离DNA。
在另一项研究中，从扁桃体的4微米切片提取DNA。通过生物分析仪分析，来评估使用全自动化方法和市售试剂盒从扁桃体提取的DNA片段的群体。电描记图显示两种方法之间的平均DNA片段长度变化很大(通过本发明的自动化方法收集的核酸片段的群体比通过市售手动方法收集的片段更长。使用市售方法提取的大多数片段的长度小于300bp (参见图2，顶部小图)。相反，用全自动化方法提取的大多数DNA片段长于1500bp (参见图2，底部小图)。较长的片段可以使基于PCR的测试具有更高的效率并且对于其他下游应用是有益的，所述下游应用例如测序应用、研究单核苷酸多态性、可变剪接、外显子-外显子边界或拷贝数变异的研究。如前所论述，通过本发明方法收集的片段可以立即用于下游应用而无需纯化；但是，如果需要，可以纯化样品。
图3A、图3B和图3C显示了市售FFPE DNA提取试剂盒和本发明的提取方法之间(分别对于GAPDH，ACTB和18s)的DNA提取效率的比较。样品未染色，且包括肝脏样品(肿瘤和正常样品)，扁桃体样品，膀胱样品(肿瘤和正常样品)和胎盘样品。如图3A中所示，本发明的提取方法对于使用的肝脏、扁桃体、膀胱和胎盘样品中的GAPDH提取显示出等同或更高的效率。如图3B中所示，本发明的提取方法对于使用的肝脏、膀胱和胎盘样品中的ACTB提取显示出等同或更高的效率。如图3C中所示，本发明的提取方法对于使用的肝脏、膀胱和胎盘样品中的18S提取显示出等同或更高的效率。
在许多情况下，由于缺乏组织可用性，FFPE组织的分子分析是不可行的。小组织样品和显微活检产生非常少的组织切片，其中大部分保留用于组织染色。本发明的自动化方法能够从先前染色的组织切片提取DNA，为组织有限的样品提供分子分析的机会。染色组织的使用还为用户提供了在相同组织切片上进行染色和分子分析(而不是比较不同的组织切片)的独特机会。
在测试来自染色组织的DNA提取效率的另一项研究中，对FFPE扁桃体的连续切片(4μM厚)进行H&E染色，或针对细胞角蛋白8和18表达用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)进行免疫组织化学(IHC)染色。使用自动化提取方法和手动试剂盒，从H&E和IHC染色的组织提取DNA。如上所述，稀释使用市售试剂盒提取的DNA样品。
ACTB、GAPDH和18s的实时PCR分析揭示，自动化方法从染色组织中回收的DNA显著多于市售试剂盒。两种方法的Ct值显示于下表3中。
表3：平均循环阈值(Ct)
| DNA提取方法 | 染色 | 平均Ct值(ACTB) | 平均Ct值(GAPDH) | 平均Ct值(18S) |
| 市售试剂盒 | H&E | 30.94 | 31.75 | 27.99 |
| 自动化方法 | H&E | 23.14 | 23.09 | 19.70 |
| 市售试剂盒 | DAB | 26.58 | 26.81 | 22.58 |
| 自动化方法 | DAB | 24.25 | 24.22 | 19.93 |
对于三种扩增子中的两种，当使用自动化方法与市售试剂盒相比时，扩增效率存在统计学上显著的差异(对于ACTB，p值= 0.0397；对于GAPDH，p值：0.0025；对于18s，p值：0.1602)。尽管对于18s没有观察到统计学上显著的差异，但是Ct值存在显著差异，这表明来自自动化方法的提取效率更高。
对于IHC，使用自动化方法的平均Ct值低于使用市售试剂盒的平均Ct值(参见表3)。对于所有三种扩增子，当使用自动化方法与市售试剂盒相比时，扩增效率存在统计学上显著的差异(对于ACTB，p值= 0.342；对于GAPDH，p值：0.0163；对于18s，p值：0.0241)。总之，自动化方法优于市售试剂盒，并从H&E染色的组织回收200-400倍更多的DNA (参见图4)，且从IHC染色组织回收8-10倍更多的DNA (参见图5)。
显微切割可以与本发明的自动化提取方法配对。不需要组织的去除使得感兴趣的组织区域留在载玻片上，允许仅从感兴趣的区域提取核酸，从而富集样品。在一项研究中，使用AVENIO MilliSect (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA)切割组织切片(参见图6)。使用扁桃体作为模拟肿瘤和正常的模型。将生发中心的集簇作为感兴趣的区域留在载玻片上。去除扁桃体的外套区。
切割后，通过本发明的自动化方法和市售手动试剂盒对含有感兴趣的组织区域的载玻片进行DNA提取。如上所述，稀释从市售试剂盒提取的样品。提取后，对所有样品进行qPCR分析。用于qPCR分析中的扩增子包括ACTB、GAPDH和18S。如表4中所示，对于所有三种扩增子，自动化方法的Ct值远低于市售试剂盒的Ct值。这些结果表明通过自动化方法从切割的样品中回收了更多的DNA。
表4：平均循环阈值(Ct)
| DNA提取方法 | 平均Ct值(ACTB) | 平均Ct值(GAPDH) | 平均Ct值(18S) |
| 市售试剂盒 | 31.35 | 31.97 | 28.78 |
| 自动化方法 | 23.36 | 23.88 | 18.68 |
通过自动化方法提取的DNA成功用于许多下游应用中。在上述研究中，在提取后，直接对DNA进行qPCR而无需纯化。其中悬浮DNA的洗脱缓冲液没有产生信号或扩增PCR产物(数据未显示)，从而消除了出于此特定应用进行纯化的需要。如前所述，将纯化的DNA样品用于生物分析仪分析中。
从染色和未染色的载玻片提取的DNA也成功用于测序应用中。提取后，使用KAPAPure Bead Cleanup (KAPA Biosystems Inc.)对样品进行缓冲液交换。重要的是，测序分析表明从染色的载玻片提取的DNA可以成功地用于测序应用。此外，与使用市售试剂盒提取的样品相比，使用自动化方法提取的样品显示出更大的覆盖均匀性。
自动化提取方法可用于从FFPE组织提取RNA。参考图7，将通过自动化方法的RNA提取质量与通过市售FFPE RNA提取试剂盒提取的RNA进行比较。从仪器中移出样品后，对来自自动化方法的提取的RNA进行柱纯化。纯化后，在Bioanalyzer上运行RNA。提取的RNA的生物分析仪分析表明，通过自动化方法提取的RNA比使用市售试剂盒提取的RNA的片段化少得多(图7)。对于许多下游应用，包括基于PCR的方法和一些RNA-seq，更长的RNA转录物会是期望的。
通过自动化方法提取的所有RNA都经柱纯化。纯化后，对RNA进行许多下游应用。首先，RNA直接用于生物分析仪分析中。RNA也成功地用作cDNA合成的模板，并且对cDNA进行qPCR。
实施例2：DNA提取方案
实施例2描述了对未染色组织的自动化DNA提取的方案设计的实例。本发明不限于本实施例中的方案。
用于自动化载玻片染色机的DNA提取方案(步骤2-5在自动化载玻片染色仪上进
行)
1. 将载玻片放置在仪器上
2. 脱蜡
3. 抗原修复
4. 蛋白酶处理
5. 热洗脱
6. 用户将液体移取出载玻片(液体含有提取的DNA)。
实施例3：RNA提取方案
实施例3描述了对未染色组织的自动化RNA提取的方案的实例。本发明不限于本实施例中的方案。
用于自动化载玻片染色机的RNA提取方案(步骤2-6在自动化载玻片染色仪上进
行)
1. 将载玻片放置在仪器上
2. 脱蜡
3. 抗原修复
4. 蛋白酶处理
5. 硫氰酸胍处理
6. 热洗脱
7. 用户将液体移取出载玻片(液体含有提取的RNA)。
本文描述的自动化RNA提取方法提供了与手动技术相比的改进。这种自动化方法可以在不到3小时内从30个样品提取RNA，这是与许多手动方法相比更快的周转时间。自动化方法也对比当前方法更小的问题样品有效。具体而言，自动化方法可以从单个4微米组织切片提取RNA。许多市售方法需要10微米组织切片，或合并在单个样品中的多个4微米切片。另外，不希望将本发明限制于任何理论或机制，自动化方法可以从组织释放RNA而无需冗长的蛋白酶处理。许多手动方法用蛋白酶处理多个小时。所述自动化方法使用短蛋白酶处理，产生RNA群体，其降解远低于使用手动方法提取的RNA群体。较少的降解可能表明存在更多的全长转录物，这可使对下游应用(如测序或qPCR分析)感兴趣的用户受益。
由前文描述，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。本申请中引用的每篇参考文献通过引用以其整体并入本文。
尽管已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对其进行不超出所附权利要求范围的修改。因此，本发明的范围仅受以下权利要求的限制。权利要求或说明书中引用的任何附图标记都是示例性的，并且仅为了便于由专利局审查，并且不以任何方式进行限制。在一些实施方案中，本专利申请中呈现的附图是按比例绘制的，包括角度，尺寸比等。在一些实施方案中，附图仅是代表性的，并且权利要求不受附图的尺寸限制。在一些实施方案中，本文使用短语“包含/包括”描述的本发明的描述包括可以被描述为“由……组成”的实施方案，并且因此满足请求保护一个或多个使用短语“由……组成”的本发明的实施方案的书面描述要求。
权利要求或说明书中引用的任何附图标记仅仅是为了便于本专利申请的检查，并且是示例性的，并且不旨在以任何方式将权利要求的范围限制于具有附图中的相应附图标记的特定特征。
Claims (82)
1.用于在自动化染色机中从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取核酸的自动化方法，所述方法包括：
使用脱蜡试剂处理所述一个或多个载玻片上的样品；
使用抗原修复缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；
使用蛋白酶缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；和
加热所述一个或多个载玻片上的样品以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含来自相应样品的分离的核酸。
2.权利要求1的方法，其还包括从所述一个或多个载玻片上的样品移出所述洗脱液。
3.权利要求2的方法，其还包括纯化分离的核酸。
4.权利要求2或权利要求3的方法，其还包括对分离的核酸进行核酸扩增。
5.权利要求2、3或4的方法，其还包括分析分离的核酸。
6.权利要求5的方法，其中所述分析包括测序。
7.权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA。
8.权利要求1的方法，其还包括在使用蛋白酶处理所述一个或多个载玻片上的样品后，使用硫氰酸胍处理所述一个或多个载玻片上的样品。
9.权利要求8的方法，其中所述核酸是RNA。
10.权利要求1的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。
11.权利要求1的方法，其中所述样品是显微切割的样品。
12.权利要求1的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是未染色的样品。
13.权利要求1的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是染色的样品。
14.权利要求12的方法，其中所述染色的样品是用苏木精和伊红(H&E)或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
15.权利要求1的方法，其中所述自动化染色机包括一个或多个分配器，其用于将脱蜡试剂、抗原修复缓冲液和蛋白酶分配到所述一个或多个载玻片上的样品上。
16.权利要求15的方法，其中所述自动化染色机还包括加热元件，其用于加热所述一个或多个载玻片上的样品。
17.用于在自动化染色机中从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取RNA的自动化方法，所述方法包括：
使用脱蜡试剂处理所述一个或多个载玻片上的样品；
使用抗原修复缓冲液处理所述一个或多个载玻片上的样品；
使用蛋白酶处理所述一个或多个载玻片上的样品；
使用硫氰酸胍处理所述一个或多个载玻片上的样品；和
加热所述一个或多个载玻片上的样品以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含来自相应样品的分离的核酸。
18.权利要求17的方法，其还包括从所述一个或多个载玻片上的样品移出所述洗脱液。
19.权利要求18的方法，其还包括纯化分离的核酸。
20.权利要求18或权利要求19的方法，其还包括对分离的核酸进行核酸扩增。
21.权利要求18、19或20的方法，其还包括分析分离的核酸。
22.权利要求21的方法，其中所述分析包括测序。
23.权利要求17的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。
24.权利要求17的方法，其中所述样品是显微切割的样品。
25.权利要求17的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是未染色的样品。
26.权利要求17的方法，其中所述一个或多个载玻片上的样品是染色的样品。
27.权利要求26的方法，其中所述染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
28.用于从置于一个或多个载玻片上的组织样品提取核酸的自动化方法，所述方法包括：
在自动化载玻片染色装置中，接收包含一个或多个组织样品的一个或多个载玻片，其中所述自动化载玻片染色装置被配置成将多种核酸提取试剂自动分配至所述一个或多个组织样品以分别处理所述一个或多个组织样品，所述核酸提取试剂包括脱蜡缓冲液、抗原修复缓冲液和蛋白酶缓冲液；
以预定顺序分配所述试剂，使得所述试剂与所述一个或多个载玻片上的一个或多个组织样品接触；
使用所述试剂处理所述一个或多个样品，从而产生包含提取的核酸的一个或多个提取的核酸样品。
29.权利要求28的方法，其还包括加热所述组织样品以从所述组织样品中洗脱提取的核酸。
30.权利要求28的方法，其还包括从所述一个或多个载玻片移出所述一个或多个提取的核酸样品。
31.权利要求30的方法，其还包括纯化来自一个或多个提取的核酸样品的核酸。
32.权利要求30或31中任一项权利要求的方法，其还包括分析来自一个或多个提取的核酸样品的核酸。
33.权利要求32的方法，其中所述分析包括进行核酸扩增。
34.权利要求32的方法，其中所述分析包括核酸测序。
35.权利要求28的方法，其中所述提取的核酸是DNA。
36.权利要求28的方法，其中所述试剂还包含硫氰酸胍。
37.权利要求36的方法，其中所述提取的核酸是RNA。
38.权利要求28的方法，其中所述一个或多个组织样品是新鲜的，冷冻的，福尔马林固定的或石蜡包埋的。
39.权利要求28的方法，其中所述一个或多个组织样品是染色的。
40.用于从载玻片上的样品分离核酸的方法，所述方法包括：
将所述样品放置在自动化染色机上的载玻片上；
在所述自动化染色机上运行提取方案，所述提取方案指示所述自动化染色机分配试剂，所述试剂包括脱蜡缓冲液，抗原修复缓冲液和蛋白酶缓冲液；以预定顺序分配所述试剂，使得所述试剂与载玻片上的样品接触，从而在载玻片上的样品上产生洗脱液，所述洗脱液包含分离的核酸样品，所述分离的核酸样品包含分离的核酸。
41.权利要求40的方法，其还包括加热所述样品以在载玻片上的样品上产生洗脱液。
42.权利要求40或41的方法，其还包括移出所述载玻片上的样品上的洗脱液。
43.权利要求42的方法，其还包括纯化分离的核酸。
44.权利要求42或权利要求43的方法，其还包括对分离的核酸进行核酸扩增。
45.权利要求42、43或44的方法，其还包括分析分离的核酸。
46.权利要求45的方法，其中所述分析包括测序。
47.权利要求40的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
48.权利要求40或47的方法，其中所述试剂还包括硫氰酸胍。
49.权利要求40的方法，其中所述样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。
50.权利要求40的方法，其中所述样品是未染色的样品。
51.权利要求40的方法，其中所述样品是染色的样品。
52.权利要求52的方法，其中所述染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
53.用于从载玻片上的样品分离核酸的方法，所述方法包括：
将所述样品放在切割仪器上的载玻片上；
在载玻片上切割所述样品以去除不需要的组织；
将所述样品放在自动化染色机上的载玻片上；
在所述自动化染色机上运行提取方案，所述提取方案指示所述自动化染色机分配试剂，所述试剂包括脱蜡缓冲液，抗原修复缓冲液和蛋白酶缓冲液；以预定顺序分配所述试剂，使得所述试剂与载玻片上的样品接触，从而在载玻片上的样品上产生洗脱液，所述洗脱液包含分离的核酸样品，所述分离的核酸样品包含分离的核酸。
54.权利要求53的方法，其还包括加热所述样品以在载玻片上的样品上产生洗脱液。
55.权利要求53的方法，其还包括移出所述载玻片上的样品上的洗脱液。
56.权利要求55的方法，其还包括纯化分离的核酸。
57.权利要求55或权利要求56的方法，其还包括对分离的核酸进行核酸扩增。
58.权利要求55、56或57的方法，其还包括分析分离的核酸。
59.权利要求58的方法，其中所述分析包括测序。
60.权利要求53的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
61.权利要求53或60的方法，其中所述试剂包括硫氰酸胍。
62.权利要求53的方法，其中所述样品是FFPE样品，新鲜样品或冷冻样品。
63.权利要求53的方法，其中所述样品是未染色的样品。
64.权利要求53的方法，其中所述样品是染色的样品。
65.权利要求64的方法，其中所述染色的样品是用H&E或免疫组织化学染料或原位杂交染料染色的样品。
66.自动化染色机，其用于执行根据权利要求1-51中任一项的方法。
67.自动化染色机，其包括耦合到处理器的存储器，其中所述存储器存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由所述处理器执行时，使得所述自动化染色机执行根据权利要求1-51中任一项的方法的操作。
68.自动化系统，其包括载玻片保持器，试剂和分配器，所述自动化系统用于执行根据权利要求1-51中任一项的方法。
69.权利要求68的系统，其还包括耦合到处理器的存储器，其中所述存储器存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由所述处理器执行时，使得所述自动化系统执行根据权利要求1-51中任一项的方法的操作。
70.权利要求68的系统，其中所述分配器适于将试剂分配到所述载玻片保持器中的载玻片上。
71.工作流程方法，其包括：从载玻片上的患者组织制备组织切片；对所述组织切片应用根据权利要求1-51中任一项的方法，其中所述方法用于提取核酸。
72.权利要求57的工作流程方法，其中所述患者的组织是肿瘤组织。
73.工作流程方法，其包括：
从来自患者的肿瘤切出福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织切片；
将所述组织切片封装在载玻片上；
在自动化机器中，对所述组织切片应用根据权利要求1-51中任一项的方法，所述自动化机器将多种核酸提取试剂自动分配到组织切片，从而产生包含源自所述组织切片的提取的核酸的提取的核酸样品。
74.用于纯化核酸的自动化系统，所述系统包括：用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据权利要求1-51中任一项的方法，其中所述方法纯化核酸。
75.用于分析核酸的自动化系统，所述系统包括用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据权利要求1-51中任一项的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行分析纯化的核酸的方法。
76.权利要求68的系统，其中所述分析核酸的方法包括扩增核酸。
77.权利要求68的系统，其中所述分析核酸的方法包括测序核酸。
78.用于扩增核酸的自动化系统，所述系统包括：用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据权利要求1-51中任一项的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行扩增纯化核酸的方法。
79.用于核酸测序的自动化系统，所述系统包括：用于接受样品的自动化机器，其中所述自动化机器执行根据权利要求1-51中任一项的方法，其中所述方法纯化核酸；其中所述自动化机器还执行对纯化的核酸进行测序的方法。
80.试剂盒，其包括根据权利要求1-51中任一项在自动化染色机上使用的核酸提取试剂。
81.权利要求80的试剂盒，其包括以下中的两种或多种：脱蜡缓冲液、蛋白酶试剂和抗原修复缓冲液。
82.权利要求80的试剂盒，其还包括硫氰酸胍。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662438228P | 2016-12-22 | 2016-12-22 | |
| US62/438228 | 2016-12-22 | ||
| PCT/US2017/067996 WO2018119295A1 (en) | 2016-12-22 | 2017-12-21 | Fully automated nucleic acid extraction method for tissue samples |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110050070A true CN110050070A (zh) | 2019-07-23 |
| CN110050070B CN110050070B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=61025055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780077953.XA Active CN110050070B (zh) | 2016-12-22 | 2017-12-21 | 用于组织样品的全自动化核酸提取方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11390903B2 (zh) |
| EP (1) | EP3559271A1 (zh) |
| JP (1) | JP6877550B2 (zh) |
| CN (1) | CN110050070B (zh) |
| WO (1) | WO2018119295A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057704A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种石蜡切片样本dna提取的脱蜡裂解结合液、试剂盒及方法 |
| TWI767250B (zh) * | 2020-03-27 | 2022-06-11 | 大江生醫股份有限公司 | 自動化核酸檢測系統與自動化核酸分配系統 |
| US11965898B2 (en) | 2020-03-27 | 2024-04-23 | Tci Gene Inc | Automatic nucleic acid detection system and method thereof |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014507A1 (en) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Ventana Medical Systems, Inc. | Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments |
| WO2002068639A1 (fr) * | 2001-02-28 | 2002-09-06 | Fu Wai Hospital Chinese Academy Of Medical Sciences | Facteur de proliferation cellulaire fwap10576 |
| US20030100043A1 (en) * | 2000-03-24 | 2003-05-29 | Biogenex Laboratories, Inc. | Device and methods for automated specimen processing |
| WO2011025442A1 (en) * | 2009-08-26 | 2011-03-03 | General Electric Company | Method and apparatus for antigen retrieval process |
| CN102676636A (zh) * | 2011-03-07 | 2012-09-19 | 美科生物医学技术无锡有限公司 | 一种超快速核酸检测方法 |
| CN102939381A (zh) * | 2010-06-14 | 2013-02-20 | 恰根有限公司 | 从蜡包埋样品中提取核酸 |
| WO2013057050A1 (en) * | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Victorious Medical Systems Aps | Method, apparatus and system for staining of biological samples |
| WO2014052551A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Cepheid | Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| DE102014113163B3 (de) * | 2014-09-12 | 2015-12-17 | Analytik Jena Ag | Reaktionsgefäß, Reaktionsgefäßanordnung und Verfahren zur Analyse einer Substanz |
| CN105247065A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-13 | 雅培分子公司 | 用于核酸提取的组合物和方法 |
| US20160017314A1 (en) * | 2013-06-06 | 2016-01-21 | Rbc Bioscience Corp. | Method for isolating nucleic acids from formalin-fixed paraffin embedded tissue samples |
| US20160108459A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Biochain Institute Inc. | Automated isolation and chemical reaction(s) of nucleic acids |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5595707A (en) | 1990-03-02 | 1997-01-21 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated biological reaction apparatus |
| ATE302208T1 (de) * | 1994-02-11 | 2005-09-15 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen |
| EP0877798B1 (en) * | 1996-02-02 | 2003-05-07 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Immortal human prostate epithelial cell lines and clones and their applications in the research and therapy of prostate cancer |
| US6582962B1 (en) | 1998-02-27 | 2003-06-24 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters |
| EP1056541B1 (en) | 1998-02-27 | 2017-10-25 | Ventana Medical Systems, Inc. | System and method of dispensing reagent |
| US20030211630A1 (en) | 1998-02-27 | 2003-11-13 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters |
| US6544798B1 (en) * | 1999-02-26 | 2003-04-08 | Ventana Medical Systems, Inc. | Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments |
| ATE527053T1 (de) * | 1999-12-13 | 2011-10-15 | Illumina Inc | Syntheseeinrichtung für oligonukleotide unter nutzung von fliehkraft |
| US6248535B1 (en) * | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
| US7033758B2 (en) * | 2000-06-02 | 2006-04-25 | Bayer Corporation | Highly sensitive gene detection and localization using in situ branched-DNA hybridization |
| WO2002076206A2 (en) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | University Of Ottawa | Methods and compositions for cryopreservation of dissociated primary animal cells |
| US20030170675A1 (en) * | 2001-04-11 | 2003-09-11 | The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. | Methods of manipulating nucleic acids |
| EP1771730B1 (en) | 2004-07-23 | 2014-08-20 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method and apparatus for applying fluids to a biological sample |
| US9243241B2 (en) * | 2005-05-31 | 2016-01-26 | Life Technologies Corporation | Separation and purification of nucleic acid from paraffin-containing samples |
| US10900066B2 (en) * | 2006-03-24 | 2021-01-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| US10295540B1 (en) * | 2009-02-13 | 2019-05-21 | Cancer Genetics, Inc. | Systems and methods for phenotypic classification using biological samples of different sample types |
| CN103282780B (zh) * | 2010-10-29 | 2015-07-08 | 美诺生命科技（武汉）股份有限公司 | 一种加工生物样品的设备及方法 |
| AU2012340344B2 (en) * | 2011-11-17 | 2015-10-29 | Rheonix, Inc. | Microfluidic apparatus, method, and applications |
| JP6060567B2 (ja) * | 2012-08-30 | 2017-01-18 | 凸版印刷株式会社 | 包埋組織からの核酸抽出方法 |
| WO2016004548A1 (zh) * | 2014-09-29 | 2016-01-14 | 深圳华大基因股份有限公司 | 临床微量活检石蜡包埋组织的前处理方法 |
| CN115753300A (zh) | 2015-04-20 | 2023-03-07 | 文塔纳医疗系统公司 | 用于组织学样品的试剂的喷墨沉积 |
-
2017
- 2017-12-21 EP EP17835537.6A patent/EP3559271A1/en active Pending
- 2017-12-21 JP JP2019534211A patent/JP6877550B2/ja active Active
- 2017-12-21 WO PCT/US2017/067996 patent/WO2018119295A1/en unknown
- 2017-12-21 CN CN201780077953.XA patent/CN110050070B/zh active Active
-
2019
- 2019-06-14 US US16/442,395 patent/US11390903B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-02 US US17/805,141 patent/US20220315987A1/en active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014507A1 (en) * | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Ventana Medical Systems, Inc. | Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments |
| US20030100043A1 (en) * | 2000-03-24 | 2003-05-29 | Biogenex Laboratories, Inc. | Device and methods for automated specimen processing |
| WO2002068639A1 (fr) * | 2001-02-28 | 2002-09-06 | Fu Wai Hospital Chinese Academy Of Medical Sciences | Facteur de proliferation cellulaire fwap10576 |
| WO2011025442A1 (en) * | 2009-08-26 | 2011-03-03 | General Electric Company | Method and apparatus for antigen retrieval process |
| CN102939381A (zh) * | 2010-06-14 | 2013-02-20 | 恰根有限公司 | 从蜡包埋样品中提取核酸 |
| CN102676636A (zh) * | 2011-03-07 | 2012-09-19 | 美科生物医学技术无锡有限公司 | 一种超快速核酸检测方法 |
| WO2013057050A1 (en) * | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Victorious Medical Systems Aps | Method, apparatus and system for staining of biological samples |
| WO2014052551A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Cepheid | Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| US20150252354A1 (en) * | 2012-09-28 | 2015-09-10 | Cepheid | Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| CN105247065A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-13 | 雅培分子公司 | 用于核酸提取的组合物和方法 |
| US20160017314A1 (en) * | 2013-06-06 | 2016-01-21 | Rbc Bioscience Corp. | Method for isolating nucleic acids from formalin-fixed paraffin embedded tissue samples |
| DE102014113163B3 (de) * | 2014-09-12 | 2015-12-17 | Analytik Jena Ag | Reaktionsgefäß, Reaktionsgefäßanordnung und Verfahren zur Analyse einer Substanz |
| US20160108459A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Biochain Institute Inc. | Automated isolation and chemical reaction(s) of nucleic acids |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 普冬;郝宏刚;郭军辉;: "全自动核酸纯化系统在临床分子检测中的应用研究", 中国热带医学, no. 10 * |
| 潘鑫艳;王丽;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;蔡琳;: "石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较", 西南国防医药, no. 02 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057704A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种石蜡切片样本dna提取的脱蜡裂解结合液、试剂盒及方法 |
| CN111057704B (zh) * | 2019-12-31 | 2022-07-05 | 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 | 一种石蜡切片样本dna提取的脱蜡裂解结合液、试剂盒及方法 |
| TWI767250B (zh) * | 2020-03-27 | 2022-06-11 | 大江生醫股份有限公司 | 自動化核酸檢測系統與自動化核酸分配系統 |
| US11965898B2 (en) | 2020-03-27 | 2024-04-23 | Tci Gene Inc | Automatic nucleic acid detection system and method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020503023A (ja) | 2020-01-30 |
| US11390903B2 (en) | 2022-07-19 |
| EP3559271A1 (en) | 2019-10-30 |
| JP6877550B2 (ja) | 2021-05-26 |
| WO2018119295A1 (en) | 2018-06-28 |
| US20190316179A1 (en) | 2019-10-17 |
| CN110050070B (zh) | 2023-12-22 |
| US20220315987A1 (en) | 2022-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220315987A1 (en) | Fully automated nucleic acid extraction methods for tissue samples | |
| JP2018186836A (ja) | 固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法 | |
| JP6021898B2 (ja) | 液体試料中の細胞の検出方法およびこの方法を実施するための装置 | |
| CN107922940B (zh) | 从ffpe组织中分离核酸的方法 | |
| US20110124530A1 (en) | Pseudo-tissues and uses thereof | |
| JP2003510571A (ja) | 組織試料中の分子標的の臨床的有用性を評価するための高処理量システム | |
| Raghavachari | Microarray technology: basic methodology and application in clinical research for biomarker discovery in vascular diseases | |
| CN104232616A (zh) | 福尔马林固定石蜡包埋样本核酸萃取方法 | |
| EP1451304A2 (en) | Kits and methods for preparing cell samples optimized for dual staining | |
| Bidarimath et al. | Laser capture microdissection for gene expression analysis | |
| Field et al. | Laser microdissection for gene expression profiling | |
| EP2948750B1 (en) | Rt-qpcr analysis of micro-dissected material from stained ffpet section | |
| Tajbakhsh | Covisualization of global DNA methylation/hydroxymethylation and protein biomarkers for ultrahigh-definition epigenetic phenotyping of stem cells | |
| Shaalan et al. | A protocol for extracting immunolabeled murine cardiomyocytes of high-quality RNA by laser capture microdissection | |
| Gan | Troubleshooting immunohistochemistry | |
| Diaz et al. | Fluorescent in situ mRNA detection in the adult mouse cochlea | |
| JP2015173657A (ja) | 免疫染色組織からの核酸抽出方法 | |
| Tan et al. | Initial experience with tissue microarray in a surgical pathology laboratory: technical considerations | |
| Reichard et al. | Detection of genetic translocations in lymphoma using fluorescence in situ hybridization | |
| JP2008541019A (ja) | 組織学のための異種移植組織の対照 | |
| Kashyap | Tumor Tissue and Cancer Cell Microprocessing for Local Molecular Analysis Using the Microfluidic Probe | |
| Gužvić | Single Cell Analysis: Methods and Protocols | |
| Vries et al. | How we do: Bone marrow biopsy diagnostics within two days | |
| US20150285720A1 (en) | Method of formalin based tissue fixation | |
| Bocsi et al. | Specimen Identification Through DNA Analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |