CN110050058A - 用于高密度细胞生长和代谢物交换的基质 - Google Patents

用于高密度细胞生长和代谢物交换的基质 Download PDF

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Abstract

被优化用于生长细胞的聚合物或其他基质，其采用具有透气侧的微薄袋的形式。袋的侧面可以采用在其间延伸的许多微小的微柱或其他间隔件而彼此保持固定距离，这将袋保持在预定的厚度并防止袋塌陷以及防止侧面粘在一起。在其他实施方案中，侧面可以仅通过气体压力保持分开。袋外部上的生物相容性涂层控制袋材料的渗透性，并且为细胞生长提供生物安全区域。进入多个袋的管可以被连接至歧管，该歧管递送气态氧或移除二氧化碳和其他废气。多个袋可以采用在之间的o形环间隔件而被紧密地堆叠在一起，并且被容纳在容器内以形成高表面积、超紧凑的细胞生长系统。

Description

用于高密度细胞生长和代谢物交换的基质
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年7月12日提交的美国临时申请第62/361,390号的权益，该临时申请据此为了所有目的以其整体并入。
关于在联邦政府资助的研究与开发下进行的发明的权利的声明
不适用
背景
1.技术领域
本发明的实施方案大体上涉及用于培养微生物和生长细胞的生物反应器设备以及制造和使用方法，所述生物反应器设备包括具有微制造特征(microfabricatedfeature)和涂层的透气的不可折叠和/或不可膨胀的袋。
2.相关技术的描述
大规模高密度细胞培养对许多生物技术应用是重要的，在这些应用中，细胞被用来产生特定的分子、蛋白质、病毒或其他产品。增加细胞密度允许每单位体积更大的产量，这可以通过空间节省和更浓缩的产品来降低成本。
高密度细胞生长的挑战起因于质量传输限制，特别是关于氧气、营养物和废物的质量传输限制。在低密度细胞培养系统中，代谢物的被动扩散通常足以满足细胞的代谢需求；然而，在高密度细胞培养系统中，细胞的代谢需求超过了来自单独的扩散的供给，需要另外的质量传输机制，例如对流。
高密度细胞培养的另外的要求是高的表面积与体积比，特别是对于粘附细胞群体(adherent cell population)。这是因为许多细胞在单层中生长，并且在它们达到汇合(confluence)之后，它们的生长被抑制。
已经开发了提高细胞密度的几种技术，包括细胞工厂系统、带有微载体的波动/搅拌生物反应器和灌注透析膜系统。
细胞工厂系统与常规的烧瓶培养系统是最相似的，除了细胞工厂系统在单个烧瓶内容纳多层的生长基质(growth substrate)。由于层之间的大间距，可以实现的细胞密度不是很高，这导致低的表面与体积比并且依赖于所有代谢物的扩散传输。
波动和搅拌生物反应器系统通过在培养基的容器内轻轻地混合细胞微载体来增加对流以增强质量传输，所述细胞微载体是具有适合于细胞粘附和生长的表面化学的小的中性漂浮颗粒(neutrally buoyant particle)。与细胞工厂系统相比，由微载体提供的高表面积和对流混合的结合允许实现更高的细胞密度。然而，对流混合还在细胞上引起剪切力，这可以导致细胞死亡，从而限制了可以实现的混合的程度和向细胞的质量传输。由于需要通过混合来增强质量传输，这样的系统通常是剪切限制的而不是表面积限制的。
灌注透析膜系统通过经由紧密堆叠的半透性透析管灌注气体并允许扩散以将氧气递送至细胞来克服剪切问题。然而，透析管的几何形状阻止了实现非常高的表面积与体积比。此外，存在关于从细胞在其上生长的高度多孔的膜中的细胞移除的挑战。
总之，高密度细胞生长的一些挑战包括：1)实现高生长表面积与体积比；2)在系统内保持足够的代谢物传输；以及3)将细胞所经受的剪切力保持低于致死水平。虽然若干现有的技术已经试图克服这些挑战，但是对于该技术仍存在很大的改进空间。
简要概述
大体上，提供了具有内部连接点的阵列的非常薄的透气塑料袋，所述内部连接点例如防止膨胀的微制造的焊接点和/或防止塌陷的内部间隔件。袋涂覆有薄的(例如2μm和10μm厚)生物相容性涂层，例如聚对二甲苯，以控制渗透性并为细胞粘附提供表面。生物相容性涂层可以经受氧等离子体处理和/或氨等离子体处理，并且可以应用琼脂糖等的另外的涂层以便进一步改进细胞粘附。
带有表层(skin)的开孔泡沫也可以被形成为抗膨胀、抗塌陷的袋。外表层与生物相容性涂层层叠在一起以控制渗透性并为细胞生长提供清洁的表面，并且边缘密封以形成袋。入口允许空气、氧气或其他气体进入袋的内部。
在使用中，将袋浸入到富含营养物的液态水培养物中，并且提供有或以其他方式充有气态氧，以充当用于细胞生长的基质。将其自身附着至袋的细胞通过袋的气体渗透膜被供给有温和的气态氧流，并且其可以通过袋排出气态二氧化碳或其他废气。同时，周围的液体为细胞提供营养，并带走其废物。
许多这样的透气袋可以堆叠在一起，并且它们的入口通过o形环连接以形成方便的歧管。叠层(stack)可以浸没在类似水族箱的外壳(enclosure)中，该外壳将袋紧紧地保持在叠层中。o形环以及珠或其他间隔件用于保持袋分离，因此存在大量的表面积用于细胞生长。离袋越远，就存在氧气的减少，但是袋之间的距离可以被优化，使得两个袋之间的中心点具有足够的氧气用于细胞生长。
本发明的一些实施方案涉及细胞生长基质设备。该装设备包括一对透气的聚合物片材；在聚合物片材的面之间的连接点的阵列，所述连接点具有小于或等于2000μm的中心到中心间距；密闭地密封的边缘(hermetically sealed edge)，所述密闭地密封的边缘将片材的周边结合在一起，将连接点封闭在片材之间的内腔中以形成抗膨胀的袋；至袋的入口，所述入口与内腔流体地连接；以及在透气片材中的至少一个的外部上的生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.01μm和1000μm之间的厚度。
连接点的中心到中心间距可以在100μm和1000μm之间。该设备还可以包括在连接点处连接片材的间隔件的阵列，所述间隔件具有足以使抗膨胀的袋抗塌陷的高度。间隔件的高度可以等于或大于连接点的中心到中心间距的五分之一。间隔件可以与透气片材中的一个整体形成。该设备可以包括多于一个的外部间隔件，所述外部间隔件邻接抗膨胀的袋的外部。外部间隔件可以是涂覆有生物相容性涂层的多孔管或多孔球体。外部间隔件可以与透气片材中的一个整体形成。
生物相容性涂层可以包括选自包括以下的组的聚对二甲苯涂层：N型聚对二甲苯、C型聚对二甲苯、D型聚对二甲苯和AF-4型聚对二甲苯。聚对二甲苯涂层的厚度可以在2μm和10μm之间。优选地，聚对二甲苯涂层的厚度可以在5μm和6μm之间。生物相容性涂层上的表面处理区域可以被配置成改进细胞粘附。表面处理区域可以是氧等离子体处理、氨等离子体处理或氧等离子体处理和氨等离子体处理两者的产物。琼脂糖、胶原蛋白、乳酸、层粘连蛋白、聚-d-赖氨酸或聚-l-赖氨酸的涂层可以在表面处理区域上以进一步增强细胞生长。
透气的聚合物片材的材料可以是选自包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯和聚氨酯的组的聚合物。透气的聚合物片材的厚度可以小于200μm。自所述袋的出口可以与内腔流体地连接。具有与至袋的入口或自袋的出口流体地连接的管腔(lumen)的管可以被附接至袋。入口可以穿过袋的密闭地密封的边缘中的孔。阵列中的连接点可以在几何上彼此规则地间隔开，或不规则地间隔开。
一些实施方案涉及细胞生长基质设备，所述设备包括聚合物开孔泡沫的片材，所述聚合物开孔泡沫的片材在两个相对的侧面上具有透气的表层片材；密闭地密封的边缘，所述密闭地密封的边缘将透气的表层片材的周边结合在一起，将开孔泡沫封闭在透气的表层片材之间的内腔中，以形成抗膨胀且抗塌陷的袋；至袋的入口，所述入口与内腔流体地连接；以及在透气的表层片材中的至少一个的外部上的生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有0.01μm至1000μm的厚度。聚合物开孔泡沫的片材可以是0.1mm至1.5mm的厚度。
一些实施方案涉及细胞生长基质设备，所述设备包括不透水的容器；在容器内的生物相容性材料涂覆的、平坦的、抗膨胀的透气袋的叠层，每个袋具有至袋的内腔的相关入口；以及在抗膨胀的透气袋之间的间隔件。
透气袋可以堆叠在垂直平面中。该叠层可以包括被折叠在自身上的至少一个透气袋。该叠层可以包括围绕自身缠绕的至少一个透气袋。该设备还可以包括o形环，所述o形环将每个袋间隔开并且将袋的入口彼此密封。
一些实施方案涉及制造细胞生长设备的方法。该方法包括铸造在一侧上具有间隔件的柱撑透气片材(pillared gas permeable sheet)，所述透气片材具有足以允许在标准室温和大气压下气态分子氧从中透过但是防止液态水从中透过的厚度；制造第二透气片材；将第二透气片材接合至柱撑透气片材，其间具有间隔件；将透气片材的周边密闭地密封在一起以形成抗膨胀的袋；在抗膨胀的袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度；以及处理生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
柱撑透气片材和第二透气片材可以包含聚合物，并且每种片材可以具有小于200μm的厚度。该方法还可以包括在抗膨胀的袋中形成入口和/或向第二透气片材应用粘合剂。
一些实施方案涉及制造细胞生长设备的方法。该方法包括将一对透气的聚合物片材紧密地接触在一起；将具有通孔的阵列的隔热掩模(mask)抵着聚合物片材放置，所述通孔具有小于或等于2000μm的中心到中心间距；将加热的烙铁(iron)抵着与聚合物片材相对的隔热掩模压制，所述加热的烙铁的温度和压制的持续时间足以在通过掩模通孔暴露的聚合物片材之间形成焊缝的阵列(array of weld)；将聚合物片材的周边密闭地密封在一起，以形成具有内部部分的袋；在袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度；以及处理生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
通孔可以在掩模中通过光刻法形成，使得它们是微小的。聚合物片材可以包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)，并且隔热掩模包括有机硅橡胶。
一些实施方案涉及生长和收获细胞的方法。该方法包括提供抗膨胀的、透气的聚合物袋的叠层，每个袋具有与歧管连接的入口，每个袋具有生物相容性涂层，所述袋通过球形珠彼此隔开；将细胞接种到珠和袋之间的间隙空间中；使营养物的液体培养物在间隙空间之间流动；通过歧管将分子氧气体加压到抗膨胀的袋中；等待细胞生长，所述营养物和分子氧气体支持细胞的生长；向细胞应用胰蛋白酶以使其与袋或珠分离；以及从珠中冲洗细胞。
该方法还可以包括从珠中移除袋。该方法还可以包括用病毒感染细胞，其中细胞的生长用于复制病毒；以及从冲洗的细胞中分离复制的病毒。
附图简述
图1A是根据实施方案的透气的、抗膨胀的、抗塌陷的袋的立体图。
图1B图示出了图1A的横截面B-B。
图1C图示出了图1A的横截面C-C。
图2A是根据实施方案的具有间隔管(spacer tube)的透气袋的立体图。
图2B是图2A的透气袋的分解图。
图3A是根据实施方案的透气的微制造的阵列焊接袋(array-welded bag)的立体图。
图3B图示出了图3A的横截面B-B。
图4是根据实施方案的开孔泡沫透气袋的立体分解图。
图5图示出了根据实施方案的由间隔管分开的多个袋。
图6图示出了根据实施方案的由珠分开的多个袋。
图7是根据实施方案的具有堆叠的透气袋的生物反应器容器的立体图。
图8是根据实施方案的具有相互交叉的营养物和气体递送袋的生物反应器的立体图。
图9A是横截面并且图示出了根据实施方案的微制造的袋制造工艺的一部分。
图9B图示出了图9A的制造工艺的一部分。
图9C图示出了图9A的制造工艺的一部分。
图9D图示出了图9A的制造工艺的一部分。
图9E图示出了图9A的制造工艺的一部分。
图9F图示出了图9A的制造工艺的一部分。
图10A是根据实施方案的原型抗膨胀的、抗塌陷的袋(prototype expansionresistant,collapse resistant bag)的照片。
图10B是图10A的原型抗膨胀的、抗塌陷的袋的一角的照片。
图11是根据实施方案的工艺的流程图。
图12是根据实施方案的工艺的流程图。
图13是根据实施方案的工艺的流程图。
详细描述
描述了能够进行非常高密度细胞培养的培养系统(例如盒、容器、其他部件)。发明人认识到，由于分子氧(O2)在细胞培养基中的低溶解度，分子氧是对于细胞生长的最限制性的代谢物。通过将气体对流递送与其他营养物递送分开，可以在不增加有害剪切力的情况下显著地增加对细胞的氧气递送。
形成袋的可灌注气体的(gas perfusable)、透气的膜片材提供高表面积，同时递送足够的氧气和气体交换用于高密度细胞生长。这些袋可以被折叠或堆叠以实现高的表面积与体积比。细胞可以在膜的表面上或在夹在膜之间的基质上直接生长。
虽然使用单独的膜用于氧气递送是有用的，但是还存在其他方面，包括递送和移除其他营养物、溶液、细胞和病毒。例如，在堆叠的膜之间的空隙(gap)可以用溶液灌注，以将组分递送至膜叠层中或从膜叠层中移除组分。可以选择空隙和灌注的速率，以便在装置内保持合适的剪切速率。在另一个实例中，可以在整个系统中采用管或通道的网络，用于与气体供应分开递送。管或通道可以包含孔隙(pore)，以允许从分子到细胞范围内的各种尺寸的颗粒进入或离开管道。这是一种手段(means)，通过该手段，可以将细胞接种在装置内和/或可以将病毒递送至感染细胞。在另一个实例中，孔隙可以被形成在膜本身中，以提供垂直于其表面灌注堆叠的膜的手段。在这种布置中，由于流动的方向不平行于细胞，流动在细胞上引起最小的剪切力；然后营养物通过扩散远离这些孔隙到达细胞。
当接种细胞时，膜的两侧可以同样接种。这可以通过使膜和流动定向为平行于重力场来实现。由于细胞在培养基中自然沉降，因此可以应用与沉降速度大小相等但方向相反的培养基的灌注，使得细胞相对于膜的净速度接近于零。通过对称性，细胞同样可能地粘附至膜的任一侧，这导致均匀的接种。
就膜材料而言，那些具有高气体传输性质的材料是最合适的。这可以通过使用具有高气体渗透率(溶解度和扩散速率的函数)的材料来实现，例如有机硅树脂，包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
可选择地，其可以通过使用非常薄的膜来实现，因为气体传输速率通常与膜厚度成反比。在非常薄的尺寸，材料的渗透性也可以显著地增加，例如在薄的聚对二甲苯(<10μm)的情况下观察到的。利用这一事实，常规上被认为是气体屏障的聚合物可以变得合适地可传输的。还可以使用多孔膜材料，因为小孔隙的发泡点(blow point)可以足够高以允许用中空膜驱动压力，而不会导致气体鼓泡通过表面。还可以使用方法的组合来实现膜的期望的高气体传输性质。
袋的表面处理可以实现细胞粘附和增殖。广泛地可适用的方法是用聚对二甲苯的薄层涂覆膜，并且使用氧等离子体处理和/或氨等离子体处理对其进行等离子体蚀刻以使其亲水。
另外的方法包括用蛋白质(例如琼脂糖、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白)或其他涂层(例如乳酸、层粘连蛋白、聚-D-赖氨酸或聚-L-赖氨酸)涂覆。
术语
“透气的”材料或“半透性的”材料包括允许气体透过但防止液态水透过的材料，或者如本领域中以其他方式可适用的并且已知的材料。渗透性可以在标准室温(即25℃)和大气压或其他可适用的温度和压力测量。例如，对于哺乳动物细胞的培养物的标准温度是37℃。对于嗜热生物，温度可以到高达122℃。压力可以从标准大气压或低于标准大气压升高，例如采用静水压力以防被浸没。气体可以是分子氧、二氧化碳、一氧化碳、普通空气或如以其他方式可适用的气体。
“柱(pillar)”或“微柱(micropillar)”包括从表面垂直地延伸的柱状物或其他结构，或者如以其他方式在本领域中已知的。“微柱”包括小的柱，并且不限于微米(micrometer)(微米(micron))或微英寸级的柱。
“间隔件的阵列”包括微柱或其他间隔件的在几何上规则或不规则的图案，其中间隔件的高度和中心到中心间距被配置成使片材彼此保持为固定距离，或者如在本领域中以其他方式已知的。
“抗塌陷的袋”包括以下的袋：该袋在其内部具有间隔件，使得在正常操作中，相对侧的内表面被防止彼此接触。
“抗膨胀的袋”包括以下的袋：该袋具有防止袋在加压时变得像气球形状的内部焊接点、连接的间隔件或其他连接，或者如本领域中以其他方式已知的。抗膨胀的袋可以基本平坦地放置。其可以具有凸的和凹的凹部和曲线。
“密闭地密封的”简单地意指被密封成气密的，或者至少不可透过液体但可能可透过气体，或者如本领域中以其他方式已知的。
可以与某些实施方案相容的开孔泡沫包括具有依照ASTM D3183的表层的Atlantic Gasket Corp.Style AG1300-S或AG1300-SM开孔有机硅泡沫，以及McMaster-Carr有机硅泡沫片材。
图1A-图1B图示出了根据实施方案的透气的、抗膨胀的、抗塌陷的袋。系统100包括一对透气的PDMS聚合物片材102和103。片材的周边已经围绕其边缘被密闭地密封，以形成具有内腔113的抗膨胀的袋101。
底部片材103具有围绕其周边整体形成的边缘112和沿一个面的间隔件，间隔件是微制造的柱104。微柱104呈在几何上规则的列和行的阵列。每列的微柱分开距离110，并且每行的微柱分开距离111。在一些实施方案中，距离是不同的；在其他实施方案中，距离是相同的。
设想其他配置，包括具有交错的行或列的在几何上规则的阵列、柱的圆弧、子形状(sub shape)和其他图案，以及在几何上不规则的阵列，例如柱的随机分布的斑纹(speckle)。
在制造期间，片材102或微柱的顶部和片材103的边缘涂覆有未固化的聚合物，并且然后在固化之前将片材102放置在片材103的顶部。片材102和片材103以及中间部分112形成层的抗塌陷的夹层。
在片材102和片材103的外部上是聚对二甲苯生物相容性涂层115。生物相容性涂层具有在0.01μm和1000μm之间的厚度，这可以控制下面的片材的透气性。也就是说，PDMS在其标称厚度可以透过液体；然而，聚对二甲苯的薄涂层防止液体穿过它们但允许气体穿过，从而使片材透气。
表面处理116覆盖生物相容性涂层115的一部分。聚对二甲苯经受氧等离子体处理和氨等离子体处理，以便改进细胞粘附。
在图1C中，从顶部到底部，顶部生物相容性涂层115具有厚度105，片材102具有厚度106，微柱104具有相等的高度107，片材103具有厚度108，并且底部生物相容性涂层115具有厚度109。如果生物相容性涂层是N型聚对二甲苯、C型聚对二甲苯、D型聚对二甲苯或AF-4型聚对二甲苯，则生物相容性涂层的厚度在2μm和10μm之间，优选地在5μm和6μm之间。
微柱间隔件104的高度107大于微柱连接点的中心到中心间距的五分之一。该高度防止相对的片材102和片材103向内弯曲并在内腔中彼此贴住，这有助于使袋抗塌陷。
入口114被形成为穿过顶部片材102和生物相容性层115的孔。入口114可以被用于从袋101供应气体或移除气体。
图2A-图2B图示了根据实施方案的具有间隔管的透气袋。袋201包括在具有中间层212的片材202和片材203上的生物相容性层215。入口214被形成在片材202及其生物相容性层215中，其中表面处理216在生物相容性层215上示出。还示出了袋内的剖视图，其中微柱204防止袋塌陷。
在袋201下方是外部间隔管217。每个间隔管217具有多个孔218，这些孔218允许流体、营养物、种子细胞(seed cell)和其他材料从其中流出。间隔管类似于法国排水沟(French drain)或花园浸洗软管(garden soaker hose)。然而，间隔管是微制造的，这允许细胞大小的或更小的材料相对均匀地分布。因此，如果袋201与其他袋堆叠在一起并被间隔管分隔开，则间隔管可以被用来均匀地接种细胞、传播营养物并积累排出的废物。
图3A-图3B图示出了透气的微制造的阵列焊接袋。在系统300中，袋301包括片材并且没有另外形成的内部柱来保持片材分开。代替地，这些片材通过袋的内部的温和的气体压力保持分开。
连接点319的阵列是通过将加热的烙铁抵着片材压制而形成的，其中在其间具有隔热掩模，使得仅被焊接的区域是那些通过掩模中的通孔暴露的区域。焊缝周围的区域允许空气自由移动。这有点类似于可充气的游泳池气垫。然而，该实施方案的连接点彼此分开小于或等于(≤)2000μm。在一些实施方案中，连接点焊缝的中心到中心间距在100μm和1000μm之间。这样的微小的间距可以使用诸如光刻法的微制造技术形成。此外，在示例性的实施方案中，聚合物片材的厚度小于200μm。
周边边缘312被密闭地密封以形成袋301，并且孔314被形成在片材中的至少一个中；这里，孔314被形成在片材302中。生物相容性层315在片材302和片材303的外部。
当通过入口孔314提供氧气时，内部部分313打开并膨胀。如果所提供的空气的压力足够大，即使浸没的袋的干燥内部部分313也打开，使得气体可以自由地流到袋的最远可达范围(farthest reach)。然后，氧气均匀地透过片材302和片材303，透过生物相容性层315，到达外部的消耗细胞(consuming cell)。
图4图示出了开孔泡沫透气袋。在系统400中，0.1mm至1.5mm厚的聚合物开孔泡沫的垫421在相对侧具有透气的表层片材420。也就是说，在该泡沫的相对侧上自然形成的表层可透过气体。泡沫的周边边缘412(在图中分解地显示为远离中心泡沫区域)被密闭地密封，以便将表层420结合在一起并将开孔泡沫封闭在内腔中。泡沫防止袋膨胀和塌陷。因此，形成抗膨胀、抗塌陷的袋。
生物相容性涂层415层叠在袋的外表层420上，并且其具有0.01μm至1000μm的厚度。
图5图示出了由间隔管分开的多个袋。每个袋501以横截面示出，并且每个袋具有穿过两个片材的孔514。以横截面示出的o形环525将袋以预定的距离间隔开，并且将袋的内部彼此密封。空气或氧气可以通过o形环被供应，使得气体流入每个袋。
除了o形环之外，间隔开袋501的还有管间隔件517，其以横截面示出。管间隔件517可以具有孔、狭缝或其他部分，营养物、种子细胞或其他材料可以通过所述孔、狭缝或其他部分被输送以被均匀地分布。
在一些实施方案中，管间隔件517可以被定向成使得它们向上和向下延伸，如与它们如何被显示的(即，进出页面)相反。在其他实施方案中，管间隔件可以在袋之间迂回前进。
图6图示出了由珠分开的多个袋。每个袋601以横截面示出，并且每个袋具有穿过两个片材的孔614。以横截面示出的o形环625将袋以预定的距离间隔开，并且将袋的内部彼此密封。
袋601被球形珠626保持分开。珠为细胞生长提供了比只有袋更大的表面积。细胞可以接种在珠和袋之间的间隙空间627内，并且营养物的液体培养物可以从中流过。珠的外部可以被处理用于更好的细胞粘附，以保持营养物等。同时，气体通过o形环歧管被提供到袋的干燥的内部。
在细胞已经生长之后，可以通过拉出袋或将袋之间的珠排出从珠中移除袋。然后可以对珠进行加工以从珠中移除细胞。例如，可以加入胰蛋白酶来裂解细胞和珠(和袋)之间的键，或者可以剧烈地洗涤珠使得细胞脱落。
图7是具有堆叠的透气袋的生物反应器容器的立体图。在系统700中，袋701以预定的量被间隔开，并且它们被悬挂在垂直平面中，使得它们的壁相对于重力垂直。在其他配置中，长的袋可以像纸巾卷那样围绕自身缠绕。
不透水的容器730容纳袋并将其浸入在液体培养物中。当歧管向袋递送氧气或空气时，液体可以被轻轻地循环。袋的开口可以彼此连接，例如在图5-图6中，或者具有连接至袋的内部的管腔的管可以与公共歧管连接。
图8是具有相互交叉的营养物和气体递送袋的生物反应器的立体图。在系统800中，气体袋膜(gas bag membrane)813的结构831与营养物递送膜826交错。这形成了非常紧凑的结构，其中在整个生物反应器中提供气体和营养物。
生物反应器可以容纳在容器(图中未示出)中，以容纳液体和细胞营养物。
图9A-图9F图示出了微制造的袋的制造工艺。在图9A中，具有升高边缘的连续干膜模具(continuous dry film mold)被设置在平坦硅基质的顶部。在图9B中，干膜模具通过光刻法被蚀刻以在干膜中产生通孔。在图9C中，PDMS被施加在模具上并且允许固化。结果是具有微柱以及围绕其周边的高边缘的PDMS片材。
在图9D中，PDMS被施加在类似于图9A的模具的模具上并且被允许固化。结果是PDMS的平坦的片材。然后将两个PDMS的片材放在一起，第一片材的柱侧在它们之间，并且使用薄PDMS层粘合，然后该PDMS层固化以产生袋。微柱防止微制造的袋膨胀并且防止其塌陷。
在图9E中，管被插入袋的侧面，使得管的管腔通过袋的密闭地密封的边缘中的孔与袋的内腔连接。在图9F中，使用化学气相沉积(CVD)将聚对二甲苯涂覆在袋的顶部、底部和侧面上。聚对二甲苯为细胞提供了清洁的、生物相容性的表面。聚对二甲苯还控制片材的渗透性。聚对二甲苯可以被等离子体处理用于更好的细胞粘附性质。
图10A-图10B是原型抗膨胀、抗塌陷的袋的显微镜照片。袋是透明的，使得人们可以看到其在其内部中的微柱。图中明显的是袋内的微柱的在几何上规则的图案、列和行。这些行和列相距约100μm。还示出的是袋的密封的边缘，其在显微照片中显示为深色。
中空的PDMS袋/膜(120μm厚的膜，具有120μm中心空隙)涂覆有等离子体处理的C型聚对二甲苯的薄层(～0.5μm)，用于细胞粘附。袋的边缘用管道连接，并且连接到受调节的氧气供应以用氧气灌注袋的中空部分。这个空隙内的氧气能够通过PDMS膜扩散到周围的培养基中以滋养细胞。细胞可以以与组织培养瓶相当的速率直接在膜上生长。
图11是根据实施方案的工艺1100的流程图。在操作1101中，铸造在一侧具有间隔件的柱撑透气片材。透气片材具有足以允许在标准室温和大气压下气态分子氧从中透过但是防止液态水从中透过的厚度。在操作1102中，制造第二透气片材。在操作1103中，将粘合剂应用于第二透气片材。在操作1104中，将第二透气片材接合至柱撑透气片材，其中在其间具有间隔件。在操作1105中，将柱撑透气片材和第二透气片材的周边密闭地密封在一起以形成抗塌陷的袋。在操作1106中，在抗塌陷的袋中形成入口。在操作1107中，在袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度。在操作1108中，处理生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
图12是根据实施方案的工艺1200的流程图。在操作1201中，使一对透气的聚合物片材紧密地接触在一起。在操作1202中，将具有通孔的阵列的隔热掩模抵着聚合物片材(在一侧上)放置，所述通孔具有小于或等于1000μm的中心到中心间距。在操作1203中，将加热的烙铁抵着与聚合物片材相对的隔热掩模压制，所述加热的烙铁的温度和压制的持续时间足以将在通过掩模通孔暴露的聚合物片材的部分焊接在一起。在操作1204中，将聚合物片材的周边密闭地密封在一起以形成袋。在操作1205中，在袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度。在操作1206中，处理生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
图13是根据实施方案的工艺1300的流程图。在操作1301中，提供抗膨胀的、透气的聚合物袋的叠层，每个袋具有与歧管连接的入口，每个袋具有生物相容性涂层，袋通过球形珠彼此隔开。在操作1302中，将细胞接种到珠和袋之间的间隙空间中。在操作1303中，使营养物的液体培养物在间隙空间之间流动。在操作1304中，通过歧管将分子氧气体加压至抗膨胀的袋中。在操作1305中，等待细胞生长和繁殖，营养物和分子氧气体支持细胞的生长。在操作1306中，将胰蛋白酶应用于细胞。在操作1307中，从珠中冲洗细胞。
已经参考各种具体的和说明性的实施方案描述了本发明。然而，应理解，可以做出许多变型和修改，同时保持在所附权利要求的精神和范围内。

Claims (38)

1.一种细胞生长基质设备，包括：
一对透气的聚合物片材；
在所述聚合物片材的面之间的连接点的阵列，所述连接点具有小于或等于2000μm的中心到中心间距；
密闭地密封的边缘，所述密闭地密封的边缘将所述片材的周边结合在一起，将所述连接点封闭在所述片材之间的内腔中以形成抗膨胀的袋；
至所述袋的入口，所述入口与所述内腔流体地连接；以及
在所述透气片材中的至少一个的外部上的生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.01μm和1000μm之间的厚度。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述连接点的所述中心到中心间距在100μm和1000μm之间。
3.如权利要求1所述的设备，还包括：
在所述连接点处连接所述片材的间隔件的阵列，所述间隔件具有足以使所述抗膨胀的袋抗塌陷的高度。
4.如权利要求3所述的设备，其中所述间隔件的高度等于或大于所述连接点的所述中心到中心间距的五分之一。
5.如权利要求3所述的设备，其中所述间隔件与所述透气片材中的一个整体形成。
6.如权利要求1所述的设备，还包括：
多于一个的外部间隔件，所述外部间隔件邻接所述抗膨胀的袋的外部。
7.如权利要求6所述的设备，其中所述外部间隔件是多孔管。
8.如权利要求6所述的设备，其中所述外部间隔件是涂覆有生物相容性涂层的球体。
9.如权利要求6所述的设备，其中所述外部间隔件与所述透气片材中的一个整体形成。
10.如权利要求1所述的设备，其中所述生物相容性涂层包括选自由以下组成的组的聚对二甲苯涂层：N型聚对二甲苯、C型聚对二甲苯、D型聚对二甲苯和AF-4型聚对二甲苯。
11.如权利要求10所述的设备，其中所述聚对二甲苯涂层的厚度在2μm和10μm之间。
12.如权利要求11所述的设备，其中所述聚对二甲苯涂层的厚度在5μm和6μm之间。
13.如权利要求1所述的设备，还包括：
在所述生物相容性涂层上的表面处理区域，所述表面处理区域被配置成改进细胞粘附。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述表面处理区域是氧等离子体处理、氨等离子体处理或者氧等离子体处理和氨等离子体处理两者的产物。
15.如权利要求13所述的设备，还包括：
在所述表面处理区域上的琼脂糖、胶原蛋白、乳酸、层粘连蛋白、聚-D-赖氨酸或聚-L-赖氨酸的涂层。
16.如权利要求1所述的设备，其中所述透气的聚合物片材的材料是选自由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯和聚氨酯组成的组的聚合物。
17.如权利要求1所述的设备，其中每个透气的聚合物片材的厚度小于200μm。
18.如权利要求1所述的设备，还包括：
自所述袋的出口，所述出口与所述内腔流体地连接。
19.如权利要求1所述的设备，还包括：
管，所述管具有与至所述袋的入口或自所述袋的出口流体地连接的管腔。
20.如权利要求1所述的设备，其中所述入口穿过所述袋的所述密闭地密封的边缘中的孔。
21.如权利要求1所述的设备，其中所述阵列中的所述连接点彼此在几何上规则地间隔开。
22.一种细胞生长基质设备，包括：
聚合物开孔泡沫，所述聚合物开孔泡沫在两个相对的侧面上具有透气的表层片材；
密闭地密封的边缘，所述密闭地密封的边缘将所述透气的表层片材的周边结合在一起，将所述开孔泡沫封闭在所述透气的表层片材之间的内腔中，以形成抗膨胀且抗塌陷的袋；
至所述袋的入口，所述入口与所述内腔流体地连接；以及
在所述透气的表层片材中的至少一个的外部上的生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有0.01μm至1000μm的厚度。
23.如权利要求22所述的设备，其中所述聚合物开孔泡沫的所述片材的厚度是0.1mm至1.5mm。
24.一种紧凑的细胞生长设备，包括：
不透水的容器；
在所述容器内的生物相容性材料涂覆的、平坦的、抗膨胀的透气袋的叠层，每个袋具有至所述袋的内腔的相关入口；以及
在所述抗膨胀的透气袋之间的间隔件。
25.如权利要求24所述的设备，其中所述透气袋堆叠在垂直平面中。
26.如权利要求24所述的设备，其中所述叠层包括被折叠在自身上的至少一个透气袋。
27.如权利要求24所述的设备，其中所述叠层包括围绕自身缠绕的至少一个透气袋。
28.如权利要求24所述的设备，还包括：
o形环，所述o形环将每个袋间隔开并且将所述袋的所述入口彼此密封。
29.一种制造细胞生长装置的方法，所述方法包括：
铸造在一侧上具有间隔件的柱撑透气片材，所述透气片材具有足以允许在标准室温和大气压下气态分子氧从中透过但是防止液态水从中透过的厚度；
制造第二透气片材；
将所述第二透气片材接合至所述柱撑透气片材，其中在其间具有所述间隔件；
将所述透气片材的周边密闭地密封在一起以形成抗膨胀的袋；
在所述抗膨胀的袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度；以及
处理所述生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述柱撑透气片材和所述第二透气片材包含聚合物，并且每种片材具有小于200μm的厚度。
31.如权利要求29所述的方法，还包括：
在所述抗膨胀的袋中形成入口。
32.如权利要求29所述的方法，还包括：
将粘合剂应用于所述第二透气片材。
33.一种制造细胞生长装置的方法，所述方法包括：
将一对透气的聚合物片材紧密地接触在一起；
将具有通孔的阵列的隔热掩模抵着所述聚合物片材放置，所述通孔具有小于或等于2000μm的中心到中心间距；
将加热的烙铁抵着与所述聚合物片材相对的所述隔热掩模压制，所述加热的烙铁的温度和所述压制的持续时间足以在通过所述掩模的通孔暴露的所述聚合物片材之间形成焊缝的阵列；
将所述聚合物片材的周边密闭地密封在一起，以形成具有内部部分的袋；
在所述袋的至少一侧上沉积生物相容性涂层，所述生物相容性涂层具有在0.1μm和1000μm之间的厚度；以及
处理所述生物相容性涂层以便改进细胞粘附。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述通孔的所述阵列在所述掩模中通过光刻法形成。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述聚合物片材包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)，并且所述隔热掩模包含有机硅橡胶。
36.一种生长和收获细胞的方法，所述方法包括：
提供抗膨胀的、透气的聚合物袋的叠层，每个袋具有与歧管连接的入口，每个袋具有生物相容性涂层，所述袋通过球形珠彼此隔开；
将细胞接种到所述珠和所述袋之间的间隙空间中；
使营养物的液体培养物在所述间隙空间之间流动；
通过所述歧管将分子氧气体加压到所述抗膨胀的袋中；
等待所述细胞生长，所述营养物和分子氧气体支持所述细胞的生长；
向所述细胞应用胰蛋白酶；以及
从所述珠中冲洗所述细胞。
37.如权利要求36所述的方法，还包括：
从所述珠中移除所述袋。
38.如权利要求36所述的方法，还包括：
用病毒感染所述细胞，其中所述细胞的生长用于复制病毒；以及
从所冲洗的细胞中分离所复制的病毒。
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