CN110041283A

CN110041283A - 板蓝根中具有抗多种病毒活性的含硫类化合物及其用途

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Publication number: CN110041283A
Application number: CN201810033331.3A
Authority: CN
Inventors: 石建功; 郭庆兰; 陈明华; 蒋建东; 李玉环; 朱承根; 徐成博
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN110041283B

Abstract

本发明公开了板蓝根水提取物种分离得到的新型含硫类化合物I‑V的结构及其抗多种病毒活性。该类化合物是包含表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体，且结构单元的丁烯基之间通过单、双或三硫烷键连接，经过活性评价，发现其具有明显的抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒的活性，有望成为预防和治疗由流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等病毒感染引发疾病的治疗药物。

Description

板蓝根中具有抗多种病毒活性的含硫类化合物及其用途

技术领域

本发明涉及从中药板蓝根中提取分离纯化得到的由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体及其药用盐类在制备预防和治疗由流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等病毒感染引发的疾病的应用。属医药技术领域。

背景技术

自上世纪80年代艾滋病出现以来，尤其是本世纪初SARS^[1-8]、H5N1禽流感^[9,10]、H1N1猪流感^[11,12]和EV17手足口病^[13-15]等的相继爆发和流行，病毒性感染疾病对人类健康构成了巨大威胁，在全球范围内引起了恐慌。因此，抗病毒药物是全世界高度重视的研究内容。

病毒是由RNA或DNA核与外壳蛋白构成，自身不能独立繁殖，寄生于被感染的宿主细胞内，在病毒基因提供的遗传信息调控下，依赖宿主细胞代谢系统合成病毒核酸和蛋白质，在胞浆内装配为成熟的感染性病毒体实现增殖和复制，然后以各种方式自宿主细胞释出而感染其他细胞。病毒的种类繁多，可侵犯不同组织器官，感染不同的体细胞引起各种疾病，如艾滋病、SARS、流感、手足口病、肝炎、脑炎、腮腺炎、麻疹、小儿麻痹和疱疹病等。尽管少数病毒性疾病通过接种疫苗已得到有效控制，但是绝大多数情况下需要药物治疗。

自上世纪50年代第一个抗病毒药物疱疹净(Idoxuridine)用于临床以来，针对病毒感染引起的不同疾病，已经研制了50余个作用于病毒生命周期不同环节的抗病毒药物^[16,17]。

然而，由于新型流感病毒的爆发以及病毒变异和耐药病毒株出现，治疗药物显得十分缺乏，例如目前尚无针对SARS的治疗药物，耐药H1N1^[18-22]和H5N1^[23-25]病毒株的出现，使得现有的抗流感病毒药物无能为力。同时，已有药物存在诸多不足之处，比如：盐酸金刚烷胺、利巴韦林和拉米夫啶等绝大多数抗病毒药物在治疗过程中，易产生赖药性，临床应用受到极大限制；干扰素对乙肝病毒、流感病毒、巨细胞病毒等感染有一定疗效，用药后可阻滞疾病的发展，但停药后易复发，并有发烧、头痛等副作用，且价格昂贵。因此，寻找和研制新型抗病毒药物是一项十分迫切的任务。

从现有小分子抗病毒的结构不难看出，多数是基于天然产物的衍生物，如核苷类抗病毒药物是天然核苷类化合物的衍生物，神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物是天然产物唾液酸的衍生物，具有新型作用机制的抗艾滋病毒药物贝韦立马是在活性天然产物白桦脂酸酸的结构改造产物等。另外，中草药不但在我国流感和艾滋病的常规防治中发挥着十分重要的作用，而且在SARS、禽流感和手足口病疫情暴发和流行中起到了关键作用^[26-28]。因此，利用现代科学方法，从疗效确切的常用中草药中发现具有抗病毒活性的化学物质，是开发新型抗病毒药物的重要基础和途径。

板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，全国各地均有栽培，资源丰富。板蓝根是我国传统常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上多用于治疗流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性乙型肝炎、单疱病毒性角膜炎、咽炎、扁平疣、红眼病、泪囊炎、水痘、麻疹等病毒性感染疾病^[29,30]；尤其是板蓝根及其制剂在SARS和禽流感防治中，作为我国推荐应急的中药品种之一发挥了重要作用。

以往板蓝根的药理学研究主要集中在其水或醇提取物及其制成的注射液和分离得到部位的活性评价方面，相关研究结果显示板蓝根注射液对甲型流感病毒、乙型脑炎病毒和腮腺炎病毒等有抑制感染和抑制增殖作用，对出血热病毒、单疱病毒有明显的杀病毒作用^[29,30]，对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)及HBV-DNA有显著抑制作用^[31]；板蓝根提取物或分离得到的部位具有抑制人单纯性疱疹病毒HSV-I及HSV-Ⅱ型病毒、抑制TK基因转录^[32,33]、抑制HSV-I对Hep-2细胞感染、HSV-I灭活^[34]、抑制狗肾细胞(MDCK)接种人甲1型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)复制^[35,36]、抑制人巨细胞病毒HCMV^[14]、抑制hela细胞系转染流行性腮腺炎病毒^[37]和抑制猪肾脏细胞感染假性狂犬病毒前及后细胞病变^[38]等作用。并且在一些评价中显示板蓝根提取物的活性与阳性对照阿昔洛韦(Aciclovir)、齐多夫定(Zidovudine，AZT)或聚肌胞的活性相当或更强。另外，板蓝根乙醇提取物及其分离部位对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有抑制作用，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶引起的足肿胀有显著抑制作用，效果与阳性对照药吲哚美辛相当^[39-41]。由此可见，板蓝根提取物的抗病毒作用确切肯定。

从上世纪80年代开始，国内外学者对板蓝根及其叶的化学成分也进行了持续研究，已分离鉴定了包括生物碱^[42-49]、木脂素^[50-53]、神经酰胺^[51]和黄酮^[54,55]，以及表告依春^[52]和2-羟基-3-丁烯基硫氰酸^[56,57]等结构多样的近80余个化合物。尽管在研究中也发现吲哚生物碱类成分如靛玉红衍生物、色胺酮类、2,4(1H,3H)-喹唑二酮、腺苷等成分分别具有一定的抗肿瘤、抗菌和抗病毒等药理活性^[58-60]；丁香酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸和4(3H)-喹唑酮等成分有显著的抗内毒素、抑制TNFα和NO释放等作用^[61-68]，以及抑制5-脂氧化酶的活性或降低细胞分泌白三烯B(4)水平的作用^[69-71]。然而由于样品量和药理评价模型的限制，绝大多数化合物并未进行活性测定评价，特别是已报道化合物的含量和活性强度等难以与板蓝根提取物和分离部位显示出的抗多种病毒的强活性相对应。由此可见板蓝根提取物中的抗病毒活性成分目前尚不完全清楚，值得深入研究。

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基于以上背景，结合以往板蓝根化学成分研究中，多数用乙醇或甲醇进行提取，而板蓝根的传统应用和药理评价多以水煎煮为主的情况，我们开展了板蓝根水煎煮提取物的研究，并从中分离获得了本发明专利中的5个由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体，且结构单元的丁烯基之间通过单、双或三硫烷键连接的新型含硫类化合物。到目前为止，本发明涉及的由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体，且结构单元的丁烯基之间通过单、双或三硫烷键连接的新型含硫类化合物，不但尚无人从板蓝根中得到，也无人通过分离纯化从其他动植物及微生物中分离得到或通过化学合成及生物合成等方法制备得到；更无人报道这些化合物或其衍生物具有抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒的功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一类新的具有抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒作用的药物。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一种如式I-V所示的由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体及其药用盐类。

具体而言，提供了如式I-V所示的化合物及其药学上可接受的盐：

本发明技术方案的第二方面是提供了第一方面所述化合物的制备方法。

板蓝根饮片50kg，用水煎煮提取3次，每次100L，每次提取2小时，提取液合并，减压回收溶剂得到棕褐色冻状浸膏(32Kg)。将浸膏溶解于120L水中，进行大孔树脂柱色谱分离色谱分离，分别用分别用H₂O(50L，A部位),50％EtOH(125L，B部位)和95％EtOH(100L，C部位)洗脱。其中B部位(0.9Kg)溶解于水中经MCI gel柱色谱分离，依次用H₂O(10L),30％EtOH(30L),50％EtOH(20L),95％EtOH(10L)和Me₂CO(8L)洗脱，对应得到5个组分B1-B5。B2(547g)组分进行硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脱(100:0－0:100)，最后用30％乙醇洗脱，其中乙酸乙酯-甲醇100:0－50:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1。B2-1(16.3g)经Sephadex LH-20柱色谱分离(3.2L石油醚－氯仿－甲醇5:5:1洗脱)得到B2-1-1－B2-1-10。B2-1-1(前800mL流动相洗脱得到，2.5g)经硅胶柱色谱分离(氯仿－丙酮100:1洗脱－0:100)，其中氯仿－丙酮30:1－15:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-3(54.3mg)再经反相HPLC半制备色谱(流动相为MeCN－H₂O 63:37)得到IV和V。氯仿－丙酮15:1－10:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-4(120.1mg)经凝胶柱色谱(900mL氯仿－甲醇1:1洗脱)得到B2-1-1-4-1(前300mL流动相洗脱得到)和B2-1-1-4-2(后600mL流动相洗脱得到)。B2-1-1-4-1(34.2mg)经TLC制备薄层色谱(氯仿－丙酮15:1洗脱)得到I。B2-1-1-4-2(74.5mg)经反相HPLC半制备色谱(流动相为MeCN－H₂O 63:37)得到II。B2-1-1经硅胶柱色谱，氯仿－丙酮7:1－5:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-6(122.7mg)，再经闪式组合反相C18柱色谱(甲醇－水0-100％梯度洗脱)，其中甲醇-水40-55％洗脱部分，合并得到III。

本发明技术方案的第三方面是提供了一种药物组合物，其中包括作为有效成分的如式I-V所示的由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体及其药用盐类，和制药领域中常用的载体。

通常本发明药物组合物含有0.1-95％重量的本发明化合物。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等，优选口服。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明提取物或化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明提取物或化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明提取物或化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物、药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的提取物或化合物的用量为0.001-150mg/kg体重，优选为0.01-100mg/kg体重，更优选为0.01-60mg/kg体重，最优选为0.1-10mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物、组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

本发明技术方案的第四方面是提供了如I-V所示的由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体及其药用盐类在制备用于预防或治疗由流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等病毒感染引发的疾病的药物中的应用。

发明人发现本发明的化合物I-V及药学上可接受的盐具有较高的抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒作用。因此，本发明的化合物I-V及药学上可接受的盐另一方面涉及预防、治疗和改善与由流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等病毒感染引发的疾病的方法。所述方法包括对需要治疗的患者给予治疗有效量的式I-V或药学上可接受的盐的化合物或其药物组合物。

本发明显示化合物I-V具有较高的抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒的作用。化合物I-V或药学上可接受的盐未见公开报道。

有益技术效果

本发明的发明人在对传统中药板蓝根的活性成分研究过程中，通过活性跟踪的方法从板蓝根水提取物中分离得到了由表告依春氮原子通过甲酰基与丁烯胺形成脲结构单元的新型二聚体I-V。通过病毒感染的细胞模型，对该类化合物进行了活性评价，结果显示化合物II和IV具有很好的抗抗流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV等多种病毒的作用，属于抗病毒药物研发过程中的结构非常新颖的先导化合物。

具体实施方式

下面的实验实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1、化合物I-V为从板蓝根中提取分离纯化的新型含硫类化合物，其分离纯化过程如下：

板蓝根饮片50kg，用水煎煮提取3次，每次100L，每次提取2小时，提取液合并，减压回收溶剂得到棕褐色冻状浸膏(32Kg)。将浸膏溶解于120L水中，进行大孔树脂柱色谱分离色谱分离，分别用H₂O(50L，A部位),50％EtOH(125L，B部位)和95％EtOH(100L，C部位)洗脱。其中B部位(0.9Kg)溶解于水中经MCI gel柱色谱分离，依次用H₂O(10L),30％EtOH(30L),50％EtOH(20L),95％EtOH(10L)和Me₂CO(8L)洗脱，对应得到5个组分B1-B5。

B2(547g)组分进行硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脱(100:0－0:100)，最后用30％乙醇洗脱，其中乙酸乙酯-甲醇100:0－50:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1。B2-1(16.3g)经Sephadex LH-20柱色谱分离(3.2L石油醚－氯仿－甲醇5:5:1洗脱)得到B2-1-1－B2-1-10。B2-1-1(前800mL流动相洗脱得到，2.5g)经硅胶柱色谱分离(氯仿－丙酮100:1洗脱－0:100)，其中氯仿－丙酮30:1－15:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-3(54.3mg)再经反相HPLC半制备色谱(流动相为MeCN－H₂O 63:37)得到IV和V。氯仿－丙酮15:1－10:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-4(120.1mg)经凝胶柱色谱(900mL氯仿－甲醇1:1洗脱)得到B2-1-1-4-1(前300mL流动相洗脱得到)和B2-1-1-4-2(后600mL流动相洗脱得到)。B2-1-1-4-1(34.2mg)经TLC制备薄层色谱(氯仿－丙酮15:1洗脱)得到I。B2-1-1-4-2(74.5mg)经反相HPLC半制备色谱(流动相为MeCN－H₂O 63:37)得到II。B2-1-1经硅胶柱色谱，氯仿－丙酮7:1－5:1洗脱部分，经TLC检测合并，得到B2-1-1-6(122.7mg)，再经闪式组合反相C18柱色谱(甲醇－水0-100％梯度洗脱)，其中甲醇-水40-55％洗脱部分，合并得到III。

化合物I：无色胶状物；(+)-HR-ESIMS m/z 483.1204[M+H]⁺(calcd forC₂₀H₂₇N₄O₄S₃,483.1189)；505.1017[M+Na]⁺(calcd for C₂₀H₂₆N₄NaO₄S₃,505.1008)；¹H NMR(Me₂CO-d₆,500MHz)δ:3.15(2H,d,J＝4.5Hz),3.23(2H,d,J＝6.0Hz),3.94(2H,m,overlap),3.99(2H,m,overlap),4.02(2H,overlap),4.48(2H,dd,J＝9.5,10.5Hz),5.35(2H,dd,J＝8.0,16.0Hz),5.43(2H,d,J＝10.5Hz),5.54(2H,d,J＝17.5Hz),5.59(2H,overlap),5.71(2H,overlap),6.09(4H,overlap),9.57(1H,brs),9.62(1H,brs).

化合物II：无色胶状物；(+)-HR-ESIMS m/z 483.1204[M+H]⁺(calcd forC₂₀H₂₇N₄O₄S₃,483.1189)；¹H NMR(Me₂CO-d₆,500MHz)δ:3.11(4H,d,J＝3.0Hz),3.93(4H,m,overlap),4.01(2H,dd,J＝8.0,11.5Hz),4.47(2H,dd,J＝9.0,11.5Hz),5.35(2H,dd,J＝8.0,16.0Hz),5.42(2H,d,J＝10.5Hz),5.52(2H,d,J＝17.0Hz),5.65(4H,overlap),6.09(4H,ddd,J＝6.0,10.5,17.0Hz),9.61(2H,brs).

化合物III：无色胶状物；(+)-HR-ESIMS m/z 515.0918[M+H]⁺(calcd forC₂₀H₂₇N₄O₄S₄,515.0910)；537.0736[M+Na]⁺(calcd for C₂₀H₂₆N₄NaO₄S₄,537.0729)；¹H NMR(Me₂CO-d₆,500MHz)δ:3.58(4H,d,J＝7.5Hz),3.97(4H,d,J＝5.5Hz),4.01(2H,dd,J＝8.0,11.5Hz),4.47(2H,dd,J＝9.0,11.5Hz),5.35(2H,dd,J＝8.0,16.0Hz),5.42(2H,d,J＝10.5Hz),5.54(2H,d,J＝17.0Hz),5.77(2H,overlap),5.78(2H,overlap),6.08(4H,ddd,J＝7.0,10.5,17.0Hz),9.64(2H,brs).

化合物IV：无色胶状物；(+)-HR-ESIMS m/z 547.0639[M+H]⁺(calcd forC₂₀H₂₇N₄O₄S₅,547.0630)；569.0452[M+Na]⁺(calcd for C₂₀H₂₆N₄NaO₄S₅,569.0450)；¹H NMR(Me₂CO-d₆,500MHz)δ:3.37(4H,d,J＝6.0Hz),3.96(4H,m),4.01(2H,dd,J＝8.0,11.0Hz),4.47(2H,dd,J＝9.0,11.0Hz),5.35(2H,dd,J＝8.0,16.0Hz),5.42(2H,d,J＝10.0Hz),5.53(2H,d,J＝17.0Hz),5.70(4H,overlap),6.09(4H,ddd,J＝6.0,10.0,17.0Hz),9.64(2H,brs).

化合物V：无色胶状物；(+)-HR-ESIMS m/z 515.0916[M+H]⁺(calcd forC₂₀H₂₇N₄O₄S₄,515.0910)；¹H NMR(Me₂CO-d₆,500MHz)δ:3.37(2H,m),3.57(1H,m),3.67(1H,m),3.97(2H,m,overlap),4.04(2H,m,overlap),4.47(2H,dd,J＝9.5,9.5Hz),5.23(1H,d,J＝17.0Hz),5.30(1H,d,J＝17.0Hz),5.37(2H,dd,J＝8.0,16.5Hz),5.42(2H,d,J＝10.5Hz),5.53(2H,d,J＝17.5Hz),5.76(1H,overlap),5.77(1H,overlap),5.78(2H,overlap),6.05(4H,overlap),9.64(1H,brs),9.72(1H,brs).

实施例2、流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)复制抑制活性

以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。

病毒株：流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2011.5)，-80℃保存。

样品处理：样品配成适宜初始浓度,再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。

阳性对照药：病毒唑(RBV)，新乡制药股份有限公司(批号20081227)；达菲,上海药物所(批号20090712)。

测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板,置5％CO₂，37℃培养24小时。MDCK细胞加入流感甲型病毒10^-4(316TCID₅₀),37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物的维持液。同时设病毒对照和细胞对照，37℃培养待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)(约37小时)，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果：与模型组组比较，化合物II和IV具有明显的流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)复制抑制活性，IC₅₀值分别为0.60和1.92μM，阳性对照药达菲和RBV的IC₅₀值分别为0.65和0.97μM。

实施例3、抗疱疹病毒I型(HSV-1)活性

以Vero(非洲绿猴肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制疱疹病毒I型引起Vero细胞病变程度。

病毒株：HSV-1、VR733由ATCC提供。

样品处理：样品临用前DMSO配成母液，检测时用培养液稀释成一定浓度后再作3倍稀释，共8个稀释度。

阳性对照药：无环鸟苷(ACV)，由湖北科益制药厂生产。

测试方法：Vero细胞种96孔培养板，24小时后感染疱疹病毒I型1/210^-4，吸附2小时，弃病毒液，按以上稀释度加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对疱疹病毒I型的半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果：与模型组组比较，化合物II和IV具有明显的抗疱疹病毒活性，IC₅₀值分别为3.70和2.87μM，阳性对照药ACV(μg/ml)的IC₅₀值为0.71μM。

实施例4、抗柯萨奇病毒活性

以Vero(非洲绿猴肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制柯萨奇病毒B3型引起Vero细胞病变程度。

病毒株：Cox B3，由ATCC提供。

阳性对照药：利巴韦林(RBV)，由湖北科益制药厂生产。

测试方法：Vero细胞种96孔培养板，24小时后感染柯萨奇病毒B3型1/2×10^-5，吸附2小时，弃病毒液，按以上稀释度加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时观察各组细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对柯萨奇病毒B3型的半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果：与模型组组比较，化合物IV具有明显的抗柯萨奇病毒活性，IC₅₀值为0.71μM，阳性对照药RBV(μg/ml)和Pleconaril(ng/ml)的IC₅₀值分别为222.22和0.41μM。

Claims

1.如式I-V所示的化合物及其药学上可接受的盐：

2.根据权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中，所述药学上可接受的盐选自化合物I-V与有机酸或无机酸所成的盐。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1-2任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。

4.权利要求1-2任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐或权利要求3所述的药物组合物在制备预防或治疗病毒感染疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的病毒感染疾病选自流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒和HIV病毒感染疾病。