CN110038016A - 一种射血分数保留的心衰小鼠模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种射血分数保留的心衰小鼠模型的制备方法，包括步骤如下:取小鼠，给予高脂饮食，给与新戊酸脱氧皮质酮。本发明成功构建了射血分数保留的心衰小鼠大鼠模型，可以用于射血分数保留的心衰研究，应用前景优良。
Description
技术领域
本发明涉及一种射血分数保留的心衰小鼠模型的建立。
背景技术
心力衰竭是全球导致死亡和残疾的主要原因之一，根据射血分数不同将心力衰竭分为两种，即心脏射血分数降低的心力衰竭(HFREF)和射血分数正常的心力衰竭(HFPEF)。HFREF即射血分数(EF)≤40％，而HFPEF即射血分数(EF≥50％)，同时伴随肺淤血，呼吸困难和运动耐受能力降低等心衰症状。HFpEF的主要特点是左心室舒张功能降低，可能与心肌纤维化，心肌肥厚，室壁僵直，血管内皮功能障碍，心血管储备功能降低等相关。HFpEF患者一般属高龄，女性居多，主要的危险因素包括糖尿病、高血压、肥胖、心肌梗死等。
HFpEF是一个多因素疾病，病人的异质性并不局限于心脏，还涉及到影响整个心血管系统并发症，病理生理改变包括心肌肥厚、心肌纤维化、舒张功能不全、血管内皮舒张功能降低、血管内皮炎性反应，运动耐量降低，但是射血分数正常。由于缺乏适当的HFpEF动物模型，其治疗药物的治疗方法的而研究非常受限，制备HFpEF动物模型的难点在复制HFpEF动物模型的临床特征，特别是很难模拟HFpEF血流动力学特征。
因此，建立能够有效模拟HFpEF临床特征的动物模型非常重要。
发明内容
本发明提供了一种新的射血分数保留的心衰小鼠模型的建立方法及其应用。
本发明射血分数保留的心衰小鼠模型的制备方法，取小鼠，给予高脂饮食，注射新戊酸脱氧皮质酮。
本发明射血分数保留的心衰小鼠，即是射血分数正常的心衰小鼠。
其中，所述小鼠是线粒体功能障碍小鼠。
线粒体功能障碍小鼠，是指线粒体膜损伤，呼吸链抑制、复合物酶活性降低等导致的线粒体氧化磷酸化产能减少的小鼠。
其中，所述小鼠的年龄为2～4个月，优选3个月。
其中，所述新戊酸脱氧皮质酮的给与时间是高脂饮食后12～14个月，优选为13个月。
其中，所述高脂饮食由如下百分比的组分组成：脂肪酸50～70％，碳水化合物占15～25％，蛋白质占15～25％；优选由如下百分比的组分组成：脂肪酸60％，碳水化合物占20％，蛋白质占20％。
其中，所述给与新戊酸脱氧皮质酮的方式是腹腔注射。
其中，所述新戊酸脱氧皮质酮的给药量为60～90mg/kg，优选给药量为75mg/kg
其中，所述新戊酸脱氧皮质酮的给与时间是高脂饮食后10～12个月，优选为12个月。
本发明还提供给了前述方法制备的动物模型在筛选治疗射血分数保留的心衰小鼠模型的药物中的用途。
本发明还提供给了一种筛选治疗射血分数保留的心衰的药物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、按照前述方法，建立射血分数保留的心衰小鼠模型；b、将候选药物施用于动物模型；c、用动物模型评价潜在的治疗射血分数保留的心衰的药物。
本发明成功构建了射血分数保留的心衰小鼠大鼠模型，可以用于射血分数保留的心衰研究，应用前景优良。
附图说明
图1.高脂饮食使线粒体功能障碍的小鼠体重增长迅速，葡萄糖耐受能力更差，但超声未见明显的心脏功能改变。(A)：高脂喂养小鼠每周的体重变化情况；(B)：IGTT实验，小鼠血糖浓度的变化情况；(C)：根据血糖随时间的变化情况，计算的曲线下面积。数据以Mean±SEM形式呈现，每组5-6只小鼠，两组间的比较用T-test方法行统计学分析，两组以上的统计分析采用one-way ANOVA方法(*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001)。
图2.长时间的高脂饮食的线粒体功能障碍小鼠，伴随明显的高血压，运动耐量下降。(A)：各组小鼠收缩压变化情况；(B)：各组小鼠舒张压变化情况；(C)：跑步机测得小鼠运动耐量；(D)：转棒仪获取的小鼠的运动耐量情况。数据以Mean±SEM形式呈现，每组5-8只小鼠，两组间的比较用T-test方法行统计学分析，两组以上的统计分析采用one-way ANOVA方法(*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001)。
图3.经过长期的高脂饮食并给予新戊酸脱氧皮质酮促炎后，P-V Loop显示线粒体功能障碍的小鼠出现明显的舒张功能障碍，射血分数基本正常。(A)：各组小鼠舒张末容积情况；(B)：各组小鼠每搏量情况；(C)：各组小鼠心输出量情况；(D)：各组小鼠等容舒张期左心室压力下降的最大速率情况；(E)各组小鼠心率情况；(F)：各组小鼠射血分数情况；(G)等容收缩期左心室内压力上升的最大速率；(H)：各组小鼠全肺重量/胫骨长度比值示意图。数据以Mean±SEM形式呈现，每组5-6只小鼠，两组间的比较用T-test方法行统计学分析，两组以上的统计分析采用one-way ANOVA方法(*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001)。
图4.模型小鼠出现明显的心肌肥厚，炎细胞浸润以及纤维化改变。(A)：各组小鼠心脏重量与胫骨长度比值；(B)：各组小鼠心肌WGA染色典型图片；(C)：基于各组小鼠心肌WGA染色，计算心肌细胞大小结果；(D)：HE染色结果的典型组学图片；(E)Masson染色结果的典型组学图片。数据以Mean±SEM形式呈现，每组5-6只小鼠，两组间的比较用T-test方法行统计学分析，两组以上的统计分析采用one-way ANOVA方法(*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001)。
图5.模型小鼠血管内皮依赖性的舒张功能障碍及血管内皮炎性反应明显。(A)：各组小鼠大动脉免疫荧光染色CD68典型图片；(B)：CD68荧光强度分析结果图；(C)：各组小鼠大动脉免疫荧光染色DHE典型图片；(D)：DHE荧光强度分析结果图；(E)硝普钠诱导的小鼠大动脉非内皮依赖的舒张功能示意图；(F)：乙酰胆碱诱导的小鼠大动脉内皮依赖的舒张功能示意图。数据以Mean±SEM形式呈现，每组5-6只小鼠，两组间的比较用T-test方法行统计学分析，两组以上的统计分析采用one-way ANOVA方法(*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001)。
具体实施方式
实施例1本发明射血分数保留的心衰小鼠模型的建立
1实验目的
建立射血分数保留的心衰小鼠模型(即射血分数正常的心衰小鼠模型)。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
选用普通对照小鼠以及线粒体功能障碍(SITR3-KO,NDUFS4-KO)的小鼠为实验对象，雌雄各半，自由摄食、进水，12小时光照/黑暗，室温控制在22±1℃。线粒体功能障碍(SITR3-KO,NDUFS4-KO)小鼠购买于Jackson实验室。所有动物实验和饲养处置均经四川大学华西医院动物护理与使用委员会批准。
2.1.2实验药物、试剂
1)D-葡萄糖(美国Sigma公司)
2)DHE(美国Cayman公司)
3)CD68(美国Proteintech公司)
4)硝普钠(旭东海普药业有限公司)
5)戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)
6)乙酰胆碱(成都市科隆化工试剂厂)
7)福尔马林(新乡市新龙化工有限公司)
8)DAPI(百灵威公司)
9)高脂饲料(美国Research Diets公司)
10)DOCP(美国USP公司)
11)WGA(美国Sigma公司)
12)氯化钠(美国Sigma公司)
13)肝素(旭东海普药业有限公司)
14)Masson试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)
15)无水乙醇(成都市科隆化工试剂厂)
16)HE试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)
17)樱花OCT冷冻切片包埋剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)
18)氯化钾(美国Sigma公司)
19)硫酸镁(美国Sigma公司)
20)氯化钙(美国Sigma公司)
21)碳酸氢钠(成都市科隆化工试剂厂)
22)葡萄糖(美国Sigma公司)
23)丙酮酸(美国Sigma公司)
24)EDTA(美国Sigma公司)
2.1.3主要实验仪器
1)天平(瑞士Mettler Toledo公司)
2)血糖仪(瑞士Roche公司)
3)彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司)
4)Organ Bath(西班牙Panlab公司)
5)正置荧光显微镜(美国Olympus公司)
6)小鼠无创血压仪(美国Visitech公司)
7)小鼠跑步机(意大利UGO公司)
8)小鼠转棒仪(美国MED Associates公司)
9)压力容积导管(休斯敦millar仪器公司)
10)Power Lab(Adinstrument公司)
11)包埋机(德国Leica公司)
12)冰冻切片机(德国Leica公司)
13)石蜡切片机(德国Leica公司)
14)烘箱(Thermo Fisher Scientific)
15)十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)
16)Seahorse XFe24(美国Agilent公司)
17)掌式离心机(大龙兴创实验仪器有限公司)
18)涡旋振荡器(大龙兴创实验仪器有限公司)
2.2实验方法
2.2.1模型制备
a.选用3个月大的线粒体功能障碍小鼠，给予高脂饮食13个月，此高脂饮食的能量供应脂肪酸占60％，碳水化合物占20％，蛋白质占20％。
b.记录小鼠每天的摄食情况，并每周测量小鼠的体重变化。
c.高脂喂养3月后，鉴定小鼠是否已出现葡萄糖耐受能力异常。
d.每间隔4个月测定小鼠的无创血压，收缩压大于120mmHg，即可认为模型小鼠出现高血压。
e.模型小鼠高脂饮食到12个月时，经腹腔注射新戊酸脱氧皮质酮(75mg/kg)，继续高脂饲养一个月。
f.注射新戊酸脱氧皮质酮一月后，检测模型小鼠的运动功能，包括小鼠跑步机和转棒仪测定运动耐量。
g.上述检测完成后，利用Millar压力容积导管，通过LabChart 9记录心室压力-容量曲线(pressure-volume loop；P-V Loop)，获取心率(HR)，射血分数(EF)，左室舒张末容积(Ved)，每搏输出量(SV)，心输出量(CO)，等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(+dp/dt),等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt)等。
h.上述检测结束后，处死模型小鼠，取心脏，大动脉血管以及全肺组织待用，测量模型小鼠胫骨长度。
①心脏，称量心脏重量，切取心脏横断面，10％福尔马林固定72小时后，石蜡包埋，切片，通过HE染色检测心肌的炎性浸润情况，Masson染色评估心肌的纤维化程度，麦胚凝集素(WGA)染色计算心肌细胞大小。
②大动脉血管，取2mm的新鲜血管，利用Organ Bath检测血管内皮依赖性的舒张功能和非内皮依赖性的舒张功能。其余大部分用OCT冷冻切片包埋剂包埋，冰冻储存，用于血管内皮的炎性相关因子(CD68)及血管内皮的活性氧(DHE)染色。
③模型小鼠全肺，称量湿重后放入80℃烘箱，72小时后取出称量肺干重。计算模型小鼠肺的干湿比。
2.2.3检测方法
a.小鼠运动耐量测试，选用Ugo Basile公司的小鼠跑步机，测试前训练3-5天。训练当天，提前1小时将小鼠放入测试房间适应环境，并设定跑步机倾斜角(5°)，电击频率(3Hz)和强度(0.5mA)；将小鼠放在跑道上，打开跑步机，从2m/min的速度开始适应，每两分钟增加2m/min，直到速度增加到10m/min后停止，换下一批模型小鼠进行训练，每次跟换小鼠时需把跑步机跑道用酒精清理干净，连续训练3-5天，每天20分钟。模型小鼠的运动耐量测试时，设定跑步机5°倾斜角，模型小鼠在跑步机上以10m/min的速度开始逐渐增加到16m/min，直到小鼠在电击网上被电击5次都不能再跑时，记录时间及距离。
b.转棒测试，选用Ugo Basile公司的小鼠转棒仪，待模型小鼠在测试房间内适应1小时后，将其放在转棒上，从最低速度4rpm/min开始，5分钟内逐渐增加至40rpm/min，如此反复，每天训练20分钟。训练3天后，转棒以30rpm/min的匀速测定小鼠运动量，当模型小鼠连续3次在10秒内落下，终止测试，并记录运动时间。
c.P-V Loop：经腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，待模型小鼠麻醉后，在颈部中间切开，分离气管，剪开一小口插管；暴露右侧颈总动脉，置入Millar压力容积导管，导管沿着右侧颈内动脉进入左心室，固定导管位置，连接压力转换器，用LabChart 9记录稳定的P-VLoop。同时暴露右侧颈内静脉，置入PE10注射管，向颈内静脉内注射30％NaCl溶液10ul，记录P-V Loop波形变化。记录结束后，用肝素浸润过的注射器抽取颈内静脉血，注入定标套件，进行容量定标。
d.免疫组化染色：取10％福尔马林固定后的石蜡包埋心脏标本，利用石蜡切片机切4μm厚的切片，分别按照HE染色试剂盒和Masson染色试剂盒染色，在光镜下观察心脏切片的炎性浸润和胶原沉积情况。
f.大血管免疫荧光染色：取OCT冷冻切片包埋剂包埋的大血管标本，用冰冻切片机切5μm厚的切片，经福尔马林固定、BSA封闭后，用CD68抗体4℃孵育过夜，PBS反复洗3遍后，常温孵育荧光二抗1小时，PBS反复洗3遍，复染DAPI，封片剂封片后，荧光显微镜拍照。对于DHE染色，则是37℃避光孵育30min，PBS反复洗3遍后，复染DAPI，封片剂封片后，荧光显微镜拍照。
f.WGA染色：取10％福尔马林固定后的石蜡包埋心脏标本，利用石蜡切片机切4μm厚的切片，5μg/ml WGA染料常温避光孵育10min，PBS反复洗3遍，复染DAPI，封片剂封片后，荧光显微镜拍照。
g.血管内皮功能检测：取小鼠主动脉动脉环2-3mm挂在两个不锈钢挂钩之间。并浸泡在含10ml Krebs-Henseleit(KH)溶液(118mM氯化钠，5.3mM氯化钾，1.2mM硫酸镁，1.2mM氯化钙，25mM碳酸氢钠，10mM葡萄糖，0.5mM丙酮酸0.5mM EDTA；pH 7.4，37℃)的浴槽内，并连续供给95％的氧气和5％的二氧化碳。给予1g的静息拉力，稳定1小时后加入30mM的氯化钾，观察到血管明显的收缩，清洗含氯化钾的KH液，再次待血管稳定60min后，在1g的静息张力下，加入苯肾上腺素(10-7M)导致血管收缩后，依次分别加入乙酰胆碱(10-9～10-5mM)或硝普酸钠(10-9～10-5mM)观察血管的舒张变化情况。
3结果
HFpEF是一个多因素参与的全身性的疾病，并非局限于心脏，合并高血压、肥胖或冠状动脉疾病老年患者，发生HFpEF的风险居高，其主要病理生理改变包括心肌肥厚、心肌纤维化、舒张功能不全、血管内皮舒张功能降低、血管内皮炎性反应，运动耐量降低。
采用本发明方法建模之后，相关的检测结果如图1～图5所示：
如图1所示，高脂饮食使线粒体功能障碍的小鼠体重增长迅速，葡萄糖耐受能力更差，但超声未见明显的心脏功能改变。
如图2所示，长时间的高脂饮食的线粒体功能障碍小鼠，伴随明显的高血压，运动耐量下降。在跑步机和转棒仪上的运行时间显着减少，表现出明显的运动能力的下降。
如图3所示，经过长期的高脂饮食并注射新戊酸脱氧皮质酮促炎后，P-V Loop显示线粒体功能障碍的小鼠出现明显的舒张功能障碍，射血分数基本正常。线粒体功能障碍小鼠利用Millar导管测定左心室P-V Loop评估心脏功能状态，发现上述处理后的线粒体功能障碍小鼠的心肌等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt)和舒张末期容积(EDV)降低明显降低，表明其心肌舒张功能障碍；但与对照相比左室的射血分数(EF)未见明显改变。另一方面心输出量(CO)、每搏量(SV)和等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(+dp/dt)也降低，表明其收缩功能也下降，并伴随着肺湿/干比例增加，即出现了肺淤血。
如图4所示，模型小鼠出现明显的心肌肥厚，炎细胞浸润以及纤维化改变。
如图5所示，模型小鼠血管内皮依赖性的舒张功能障碍及血管内皮炎性反应明显。整个处理后观察到氧化应激(DHE)和炎症(CD68)引起的内皮依赖性血管舒张功能受损，组织病理学染色可见心肌显着的炎性浸润，胶原沉积和间质纤维化。
可以看出，本发明建模方法制备的小鼠，有明显的高血压，运动耐量下降，同时出现明显的舒张功能障碍，而射血分数基本正常，出现明显的心肌肥厚、炎细胞浸润以及纤维化改变，血管内皮依赖性的舒张功能障碍及血管内皮炎性反应明显，表明经过长期高脂处理和DOCP注射后的线粒体功能障碍小鼠可出现HFpEF典型的病理特征，成功构建了射血分数保留的心衰小鼠大鼠模型。
实施例2用本发明模型筛选治疗射血分数保留的心衰的药物
a、按照实施例1的方法，建立射血分数保留的心衰小鼠模型；
b、将候选药物施用于动物模型；
c、观察候选药物对射血分数保留的心衰的各种指标的影响情况，评价潜在的治疗射血分数保留的心衰的药物。
综上，本发明成功构建了射血分数保留的心衰小鼠大鼠模型，可以用于射血分数保留的心衰研究，应用前景优良。
Claims (10)
1.一种射血分数保留的心衰小鼠模型的制备方法，包括步骤如下:取小鼠，给予高脂饮食，注射新戊酸脱氧皮质酮。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述小鼠是线粒体功能障碍小鼠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述小鼠的年龄为2～4个月，优选3个月。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高脂饮食的给与时间是至少10个月，优选为13个月。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：所述高脂饮食由如下百分比的组分组成：脂肪酸50～70％，碳水化合物占15～25％，蛋白质占15～25％；优选由如下百分比的组分组成：脂肪酸60％，碳水化合物占20％，蛋白质占20％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述给与新戊酸脱氧皮质酮的方式是腹腔注射。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述新戊酸脱氧皮质酮的给药量为60～90mg/kg，优选给药量为75mg/kg。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述新戊酸脱氧皮质酮的给与时间是高脂饮食后12～14个月，优选为13个月。
9.权利要求1～8任意一项所述方法制备的动物模型在筛选治疗射血分数保留的心衰小鼠模型的药物中的用途。
10.一种筛选治疗射血分数保留的心衰的药物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、按照权利要求1～8任意一项所述方法，建立射血分数保留的心衰小鼠模型；b、将候选药物施用于动物模型；c、用动物模型评价潜在的治疗射血分数保留的心衰的药物。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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