CN110004078A - 一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。该方法中所用培养基为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/LNaCl，0.002～0.003mol/L KCL；菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油；感受态细胞分装后即刻用液氮速冻后再进行超低温保存。本发明对临床菌感受态细胞的制备工艺进行了优化，包括培养基和工艺条件的优化，培养基中不加入MgCl₂/MgSO₄，并筛选优化了合适配比的培养基配方，以及制备、保存条件，按照该方法制备的革兰氏阴性临床菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，解决了目前临床菌感受态制备的一个大问题，且该方法更简单高效，具有很好的应用价值和前景。

Description

一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。

背景技术

感受态是指细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。将细菌制备成感受态有助于获取目的蛋白，有助于研究未知基因功能，同时，为实验室研究细菌遗传背景提供技术手段。

感受态可分为工程菌感受态和临床菌株感受态。工程菌感受态：对细菌进行基因改造后，使细菌能够按照人们的设想工作；工程菌感受态成为实验室常用来扩增质粒、表达蛋白的工具，有利于外源基因高效表达。如常用的JM109，DH5α，BL21等，这些菌株都是工程菌株，经过人为改造，有成熟的制备感受态体系，制备起来比较简单。

而临床菌株的感受态是指以直接来源于病人、动物、环境中的细菌制作的感受态。由于细菌具有很强的适应性和遗传积累的特性，在实验室研究过程，常常需要对临床菌株进行机制研究，以了解细菌在环境中进化的情况，以了解当下细菌的流行情况(比如了解当下多重耐药菌株的耐药机制)，而此时往往需要将临床菌株做成感受态来进行基因敲除和过表达验证。如多重耐药菌在全球流行，对人类的健康构成威胁，为了研究多重耐药菌的耐药机制，需要对引起病人发病的临床菌株进行机制的研究，以应对多重耐药的广泛流行的现状。然而临床菌株的遗传背景复杂，感受态的转化率低，这是目前临床菌感受态制备的一个大问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有临床菌感受态制备技术的缺陷和不足，提供一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法，所用培养基配方为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/L NaCl，0.002～0.003mol/LKCL。

优选地，所用培养基配方为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.01mol/L NaCl，0.0025mol/L KCL。

优选地，该方法中，菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油。

优选地，该方法中，菌体的清洗和重悬均使用10％甘油。

优选地，该方法中，菌体分装后即刻用液氮速冻，再进行保存。

另外，具体优选地，该方法包括如下步骤：

(1)获取菌株单菌落；

(2)单菌落进行初培养；

(3)再扩大培养至OD_600nm在0.4～0.5之间；

(4)步骤(3)所得菌液离心，菌体沉淀用甘油清洗；

(5)按照浓缩280～320倍的要求，用甘油重悬菌体，分装后液氮速冻，超低温保存。

其中优选地，步骤(4)所述离心的条件为0～8℃、3000～5000rcf离心5～15min。

更优选地，步骤(4)所述离心的条件为4℃、4000rcf离心10min。

优选地，步骤(5)中浓缩倍数为300倍。

优选地，步骤(5)所述超低温为-100℃～-20℃(如-80℃)。

更具体地，所述方法包括如下步骤：

(1)获取单菌落：

将菌株在无抗生素的LB琼脂培养板上划线，37℃培养15～24h后，在琼脂培养板密度低的位置选取单菌落；

(2)单菌落初培养：

取1个单菌落的菌体加入1～3mL培养基中，37℃、200rpm摇菌培养6～10h；

(3)扩大培养

把步骤(2)所得菌液按照体积比0.15％的接种量转接到新鲜的培养基中37℃、200rpm摇菌培养至OD_600nm在0.4～0.5之间；

(4)菌体清洗

把步骤(3)所得菌液4℃、4000rcf离心10min，倒去培养基，沉淀用甘油反复清洗；

(5)菌体重悬、分装保存

按照浓缩倍数的要求，加入甘油重悬菌体，分装后用液氮速冻，-80℃保存。

更优选地，步骤(3)中的培养瓶需要预热：培养容器37℃、200rpm预摇1～1.5h(目的是预热和使培养基充氧)。

优选地，甘油需要预冷。如-4℃或-20℃预冷。

优选地，步骤(3)中甘油清洗的操作重复2～3次，每次清洗时，加入甘油后在冰上轻轻摇动到把菌体完全悬浮，再离心。

另外，经过大量实验验证，本方法适用于大多数的革兰氏阴性临床菌感受态细胞的制备，尤其是大肠杆菌、沙门氏菌。

本发明具有以下有益效果：

本发明对临床菌感受态细胞的制备工艺进行了优化，包括培养基和工艺条件的优化，培养基中不加入MgCl₂/MgSO₄，并筛选优化了合适配比的培养基配方，以及制备、保存条件，按照该方法制备的革兰氏阴性临床菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，假阳性显著减少，解决了目前临床菌感受态制备的一个大问题，具有很好的应用价值和前景

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、标准菌株：大肠杆菌K12

2、培养基配方1L：20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2mL 5M NaCl，2.5mL 1M KCl(注意：本实验的培养基必须不含MgCl₂/MgSO₄)。

配制500mL 10％甘油。

3、感受态细胞制备方法如下：

(1)获取单菌落：

第一天下午2:00：将菌株在一块LB琼脂培养板(无抗生素)上划线(保证出现密度低的多个单菌落)，37℃培养过夜。

第二天上午8:00：首先开启小摇床(设定37℃)。在琼脂培养板密度低的位置选取单菌落。

(2)单菌落初培养：

用移液器取2μL培养基洗脱1个单菌落的菌体，加入到1管1.5mL培养基。在小摇床(设定37℃)摇菌培养(200rpm)。

(3)扩大培养

把1L大三角瓶放入大摇床，设定37℃、200rpm，预摇约1～1.5h(目的是预热和使培养基充氧)。

下午4:30：在超净台中，将1.5mL的菌液接种到1L大三角瓶中，200rpm摇动培养约两个小时，在超净台中从三角瓶中取适量菌液加入到比色杯中测定OD_600nm。培养至OD_600nm在0.4～0.5之间。

(4)菌体清洗

把步骤(3)的菌液倒入离心瓶，4℃、4000rcf离心10min，倒去培养基。往离心瓶倒入适量预冷的10％甘油，以洗去瓶壁上的培养基残液，轻轻倒掉洗液。

向瓶中加入适量的10％甘油，盖上盖，在冰上轻轻摇动到把菌体完全悬浮，4℃、4000rcf离心10min，倒去上清。重复操作甘油清洗的步骤。

(5)菌体重悬、分装保存

按照浓缩300倍的要求，加入1～1.5mL 10％甘油，重悬菌体，分装到1.5mL离心管中，用液氮速冻，-80℃冰箱保存。

实施例2

将菌株换为临床菌株大肠杆菌E4，按照实施例1的方法制备感受态。

实施例3

将菌株换为沙门氏菌标准菌株ATCC14028，按照实施例1的方法制备感受态。

实施例4

将菌株换为沙门氏菌临床菌株D14，按照实施例1的方法制备感受态。

实施例5

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基配方变为：18g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，0.015mol/L NaCl，0.003mol/L KCL。

实施例6

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基配方变为：22g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.005mol/L NaCl，0.002mol/L KCL。

实施例7

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：所使用甘油的浓度为8％。

实施例8

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：所使用甘油的浓度为12％。

对比例1

整体方法与实施例1相同，唯一不同之处在于：培养基中加入10mM MgCl₂。

对比例2

整体方法与实施例2相同，唯一不同之处在于：培养基中加入10mM MgSO₄。

对比例3

整体方法与实施例3相同，唯一不同之处在于：培养基中加入10mM MgCl₂。

对比例4

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基中加入10mM MgSO₄。

对比例5

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基中加入10mM MMgCl₂。

对比例6

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基中略去KCl。

对比例7

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基中KCl替换为MgSO₄。

对比例8

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基中KCl替换为MgCl₂。

对比例9

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：步骤(4)中菌体的清洗先使用ddH₂O水清洗、再使用甘油清洗。

对比例10

整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：步骤(5)中分装后直接-80℃保存。

将上述各实施例和各对比例所制备的感受体细胞进行转化实验

1、转化实验方法如下：

(1)在75％酒精浸泡保存的电击杯，在超净台取出后就在超净台里倒置晾干，正置紫外灯过夜照射灭菌；第二天盖好盖子，用一个干净的保鲜膜(最好是灭过菌)装起来放-20℃预冷(电击杯使用完后先用水流冲干净，再用纯水冲洗，然后纯酒精泡一夜，最后用75％酒精浸泡保存)。

(2)取1μL(100ng)质粒与100μL感受态细胞混合，于2.5KV，5mS的条件下电击，电击后迅速加入1mL的SOC培养基(37℃预热)，于37℃培养2h。

(3)在1块LB抗性平板的半块中涂100μL，另半块涂10μL(要添加50μL灭菌水或LB才好涂开)培养15h后计算转化效率。

2、结果如表1所示：

表1各组感受态转化效率

组别	转化效率
		实施例1	9.2×10<sup>8</sup>/μg
对比例1	7.1×10<sup>8</sup>/μg
		实施例2	5.6×10<sup>8</sup>/μg
对比例2	4.1×10<sup>8</sup>/μg
		实施例3	8.9×10<sup>8</sup>/μg
对比例3	7.5×10<sup>8</sup>/μg
		实施例4	6.7×10<sup>8</sup>/μg
对比例4	3.2×10<sup>8</sup>/μg
		实施例5	5.9×10<sup>8</sup>/μg
实施例6	6.0×10<sup>8</sup>/μg
		实施例7	6.2×10<sup>8</sup>/μg
实施例8	6.1×10<sup>8</sup>/μg
		对比例5	3.1×10<sup>8</sup>/μg
对比例6	3.7×10<sup>8</sup>/μg
		对比例7	2.8×10<sup>8</sup>/μg
对比例8	2.9×10<sup>8</sup>/μg
		对比例9	6.6×10<sup>8</sup>/μg
对比例10	4.2×10<sup>8</sup>/μg

注：转化效率为1μg质粒做转化所能长出的阳性克隆数。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法，其特征在于，所用培养基的配方为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/L NaCl，0.002～0.003mol/L KCL。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所用培养基的配方为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.01mol/L NaCl，0.0025mol/L KCL。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，菌体的清洗和重悬均使用10％甘油。

5.根据权利要求1～4任一所述方法，其特征在于，感受态细胞分装后即刻用液氮速冻，再进行保存。

6.根据权利要求1～4任一所述方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取菌株单菌落；

(2)单菌落进行初培养；

(3)再扩大培养至OD_600nm在0.4～0.5之间；

(4)步骤(3)所得菌液离心，沉淀用甘油清洗；

(5)按照浓缩280～320倍的要求，用甘油重悬沉淀，分装后液氮速冻，超低温保存。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的条件为0～8℃、3000～5000rcf离心5～15min。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(5)中浓缩倍数为300倍。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(5)所述超低温为-100℃～-20℃。

10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取单菌落：

将菌株在无抗生素的LB琼脂培养板上划线，37℃培养15～24h后，在琼脂培养板密度低的位置选取单菌落；

(2)单菌落初培养：

取1个单菌落的菌体加入1～3mL培养基中，37℃、200rpm摇菌培养6～10h；

(3)扩大培养

把步骤(2)所得菌液按照体积比0.15％的接种量转接到新鲜的培养基中37℃、200rpm摇菌培养至OD_600nm在0.4～0.5之间；

(4)菌体清洗

把步骤(3)所得菌液4℃、4000rcf离心10min，倒去培养基，沉淀用甘油反复清洗；

(5)菌体重悬、分装保存

按照浓缩倍数的要求，加入甘油重悬菌体，分装后用液氮速冻，-80℃保存。