CN113481229A - 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法 - Google Patents

一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113481229A
CN113481229A CN202110773406.3A CN202110773406A CN113481229A CN 113481229 A CN113481229 A CN 113481229A CN 202110773406 A CN202110773406 A CN 202110773406A CN 113481229 A CN113481229 A CN 113481229A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
concentration
competent cells
buffer
chloride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110773406.3A
Other languages
English (en)
Inventor
曲红金
吕妍
万兵兵
曹禺
汪子喻
覃佐菊
李俊实
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Zorun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Zorun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Zorun Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Zorun Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110773406.3A priority Critical patent/CN113481229A/zh
Publication of CN113481229A publication Critical patent/CN113481229A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD600值；对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；再对重悬液离心，收集第二沉淀；采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；将所述感受态细胞冷冻保存。本发明使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达5*10^9cfu/μg DNA。保存半年转化效率都不会发生改变，质量稳定，使用方便，可以极大程度降低科研人员的实验成本，提高研究效率。

Description

一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生命科学和基础医学科研领域，特别是涉及一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法。
背景技术
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2， RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，虽然RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率已可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-80℃下保存，能保存半年，因此CaCl2法使用更广泛。
但是在CaCl2制备方法中，感受态细胞产品的转化效率还存在着巨大的进步空间，距离国际水平存在明显差距，尤其从转化效率上看，使用pUC19质粒DNA 检测，目前我国市场上的感受态细胞产品转化效率多数不足10^8cfu/μg DNA，仍需要不断进步。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，其优点是能快速制备，转化效率更高，更加稳定，广泛适用于基础科研领域，提高科研人员实验效率。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：
步骤1：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；
步骤2：将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；
步骤3：当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD600值；
步骤4：对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；
步骤5：采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；
步骤6：再对重悬液离心，收集第二沉淀；
步骤7：采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；
步骤8：滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；
步骤9：将所述感受态细胞冷冻保存。
在本发明一个较佳实施例中，将制备的感受态进行分装，并迅速在液氮中冷冻。最终将其放置在-80℃长期保存。
在本发明一个较佳实施例中，步骤2中所述振荡培养的温度为20-25℃，时间为20-48小时。
在本发明一个较佳实施例中，步骤2中所述培养基为包括细菌培养用胰化蛋白胨和酵母混合而成的培养基，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为3-5％ w/v，所述酵母的浓度为0.4-0.7％w/v。
在本发明一个较佳实施例中，步骤2中所述培养基的制备过程为将胰化蛋白胨、酵母、氯化钠和氯化钾混合，加压蒸汽灭菌，再加入氯化镁和硫酸镁制得培养基。
在本发明一个较佳实施例中，步骤3中，当溶液的OD600值为0.5-0.7时，将溶液取出冷却。
在本发明一个较佳实施例中，步骤4中所述离心是在转速为2300-2600g下，溶液离心8-11分钟。
在本发明一个较佳实施例中，步骤5中所述缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的pH值为6.4-6.7，所述哌嗪-1,4-二乙磺酸的浓度为7-15mM，所述氯化钙的浓度为25-33mM，所述氯化钾的浓度为210-300mM，所述氯化锰的浓度为50-60mM。
在本发明一个较佳实施例中，步骤6中所述离心是在转速为2300-2600g下，重悬液离心7-9分钟。
在本发明一个较佳实施例中，步骤8中滴加至所述二甲基亚砜的体积浓度为5-9％。
在本发明一个较佳实施例中，步骤9中所述冷冻是在液氮中冷冻的，所述保存是在-80℃下长期保存。
本发明的有益效果是：本发明的获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，经过特殊工艺处理得到的感受态细胞，使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达5*10^9cfu/μgDNA。将得到的感受态细胞放置在-80℃的温度环境下，保存半年转化效率都不会发生改变，质量稳定，使用方便，可以极大程度降低科研人员的实验成本，提高研究效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明所述获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法的步骤1-3的示意图；
图2是本发明所述获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法的步骤4-9的示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
请参阅图1和图2，提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，具体操作步骤为：
(一)所需材料
E.coli DH5α或其他菌株、pUC19质粒DNA(购买或实验室自制)、Eppendorf 管。
(二)所需实验设备
恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、紫外分光光度计、微量移液枪。
(三)准备所需试剂
LB固体培养基、调配好的培养基(A)、缓冲液(B)、DMSO。
(1)调配好的培养基(A)
所述培养基为包括细菌培养用胰化蛋白胨和酵母混合而成的培养基，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为3-5％w/v，所述酵母的浓度为0.4-0.7％w/v。在本实施例中，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为4％w/v，所述酵母的浓度为 0.5％w/v。所述培养基的制备过程为将胰化蛋白胨、酵母、氯化钠和氯化钾混合，高压蒸汽灭菌，再加入氯化镁和硫酸镁制得培养基。所述氯化钠的浓度为 8-11mM，所述氯化钾的浓度为2-3mM，所述氯化镁的浓度为3-7mM，所述硫酸镁的浓度为3-7mM，在本实施例中，所述氯化钠的浓度为8.55mM或10mM，所述氯化钾的浓度为2.5mM，所述氯化镁的浓度为5mM，所述硫酸镁的浓度为 5mM。所述加压时的压力为0.1Mpa，温度为110-130℃，时间为15-25min。
见下表，具体制备过程为，当配制1升培养基时，向水中加入40g细菌培养用胰化蛋白胨Bacto-Tryptone C38和5g酵母Yeast Extract C39，及1.71mL浓度为8.55mM的氯化钠、625μL氯化钾，在121℃下加压蒸汽灭菌20min。结束后再加入5mL氯化镁、5mL硫酸镁，制得培养基。其他体积的培养基制备方法类似。本发明专利增加了MgSO4，试剂组分更多元化，提高了感受态制备的稳定性及高产。并且添加了Mg2+的培养基替代传统的LB培养基培养细菌，可以提高感受态的转染效率。
Figure BDA0003153315360000061
(2)缓冲液(B)：
所述缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的pH值为6.4-6.7，所述哌嗪-1,4-二乙磺酸的浓度为7-15mM，所述氯化钙的浓度为25-33mM，所述氯化钾的浓度为210-300mM，所述氯化锰的浓度为50-60mM。在本实施例中，所述哌嗪-1,4-二乙磺酸的浓度为10mM，所述氯化钙的浓度为30mM，所述氯化钾的浓度为250mM，所述氯化锰的浓度为 55mM，优选地，所述缓冲液的pH值为6.6。
见下表，具体制备过程为，当制备200mL缓冲液时，将8mL哌嗪-1,4-二乙磺酸PIPES、3mL氯化钙和12.5mL氯化钾混合，加水并用氢氧化钾调节缓冲液的pH值到6.7，再加入2.18g氯化锰，加水至200mL，得到pH值为6.6的缓冲液。制备100mL缓冲液、40mL缓冲液及其他体积的缓冲液的制备类似相似。
缓冲液(B) Stock 200mL 100mL 40mL
10mM PIPES 0.25M 8mL 4mL 1.6mL
30mM CaCl<sub>2</sub> 4M 3mL 1.5mL 0.6mL
250mM KCl 4M 12.5mL 6.25mL 2.5mL
55mM MnCl<sub>2</sub> solid 2.18g 1.09g 0.436g
常规缓冲液内的K-MES缓冲液换为本发明专利中的PIPES，配方成分进行了改变，大肠杆菌的特征是一样的，但经过本发明使用的缓冲液处理之后，细胞膜可以更加敏感，融合性更强，使质粒更易引入受体细胞。
(四)超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：
步骤1：前夜接种受体菌(DH5α甘油菌)，在LB固体培养基平板上划线，将受体菌活化，稀释菌液，在37℃过夜培养(约20小时)，获取单克隆；
步骤2：挑选6-12个直径为2-3毫米的单克隆至配好的250mL培养基(A) 中，在24℃摇床上振荡培养36-48小时(205rpm)；注意在振荡培养至约20小时时进行观察，考量浑浊程度，如果肉眼发现较原先发生变化了，即可取出；
步骤3：浑浊后，需要测定溶液的OD600值(600波长下的细胞度值)。使用紫外分光光度计测定溶液OD600，当数值达到约0.6时将之取出，于冰上放置10 分钟冷却；
步骤4：在4℃，转速为2500g下，溶液低温离心10分钟，收集沉淀；
步骤5：加入80mL预冷的缓冲液(B)温和吹打沉淀，将沉淀重悬。在冰上放置10分钟。
步骤6：再次在转速为2500g，4℃下，低温离心8min，并收集沉淀。
步骤7：将沉淀温和地重悬于10mL缓冲液(B)中。
步骤8：逐滴加入二甲基亚砜DMSO，使DMSO的最终浓度变为7％。于冰上放置10分钟。
步骤9：将制备的感受态进行分装，并迅速在液氮中冷冻。最终将其放置在 -80℃长期保存。
实施例二：
传统感受态制备方法与超级感受态细胞制备方法的比较：
对于步骤1，传统感受态制备方法可从LB固体培养基平板挑取DH5α单克隆，也可直接取甘油菌至4mL LB培养基中，37℃，220rpm过夜活化。区别是本发明超级感受态必须通过划线挑单克隆。
对于步骤2，传统感受态制备方法取1mL过夜培养物转接于100mL LB培养基中，在37℃摇床上振荡培养约2.5-3小时，OD600为0.3-0.4(200-230rpm)。区别是本发明采用不同的培养基，接种大肠杆菌方式不同，优化了振荡培养的时间和培养温度。
对于步骤3，传统感受态制备方法将0.1M CaCl2溶液于冰上预冷，将摇瓶中100mL菌液转入预冷的离心管中。区别是因本发明制备方法的不同，本发明的OD600值需达到0.5-0.7。
对于步骤4，传统感受态制备方法在4℃，转速为3000g下低温离心5分钟。区别是本发明根据制备方法设置离心时间和转速。
对于步骤5，传统感受态制备方法：弃去上清，加入50mL预冷的0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟。区别是本发明相较传统方式，采用了缓冲液(B)，根据制备方法设置冰上放置时间。
对于步骤6，传统感受态制备方法在4℃，转速为3000g下，冷冻离心5分钟。区别是本发明根据制备方法设置离心时间和转速。
对于步骤7，传统感受态制备方法：弃去上清，加入4mL预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。区别是本发明采用了缓冲液(B)。
对于步骤8和9，传统感受态制备方法：细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15％-20％甘油)后超低温冷冻贮存备用(70℃)。区别是本发明优化了DMSO浓度，采用不同与传统方式的冷冻方式和保持温度。
本发明的制备方法对整体实验流程进行了质量把控，使得制备大肠杆菌感受态细胞的转化效率更高以及更加稳定。
实施例三：
计算方法：
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率(转化子数/每μg质粒DNA)＝转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数/感受态细胞总数
经计算，使用pUC19质粒DNA检测，本发明的大肠杆菌超级感受态细胞 (E.coliDH5α)的细胞转化效率可达5*10^9cfu/μg DNA以上。
本发明专利中的大肠杆菌(E.coli)超级感受态细胞的制备方法，满足科研人员在分子生物学中的实验需求如普通质粒构建、重组质粒构建、蓝白斑筛选、慢病毒和腺病毒载体构建、分子克隆、甲基化DNA克隆、文库构建、高质量质粒提取及蛋白表达等。感受态细胞是科研工作者们不可或缺的基因改造研究工具。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤为：
步骤1：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；
步骤2：将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；
步骤3：当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD600值；
步骤4：对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；
步骤5：采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；
步骤6：再对重悬液离心，收集第二沉淀；
步骤7：采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；
步骤8：滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；
步骤9：将所述感受态细胞冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述振荡培养的温度为20-25℃，时间为20-48小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述培养基为包括细菌培养用胰化蛋白胨和酵母混合而成的培养基，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为3-5％w/v，所述酵母的浓度为0.4-0.7％w/v。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述培养基的制备过程为将胰化蛋白胨、酵母、氯化钠和氯化钾混合，加压蒸汽灭菌，再加入氯化镁和硫酸镁制得培养基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，当溶液的OD600值为0.5-0.7时，将溶液取出冷却。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述离心是在转速为2300-2600g下，溶液离心8-11分钟。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的pH值为6.4-6.7，所述哌嗪-1,4-二乙磺酸的浓度为7-15mM，所述氯化钙的浓度为25-33mM，所述氯化钾的浓度为210-300mM，所述氯化锰的浓度为50-60mM。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6中所述离心是在转速为2300-2600g下，重悬液离心7-9分钟。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤8中滴加至所述二甲基亚砜的体积浓度为5-9％。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤9中所述冷冻是在液氮中冷冻的，所述保存是在-80℃下长期保存。
CN202110773406.3A 2021-07-08 2021-07-08 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法 Pending CN113481229A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110773406.3A CN113481229A (zh) 2021-07-08 2021-07-08 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110773406.3A CN113481229A (zh) 2021-07-08 2021-07-08 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113481229A true CN113481229A (zh) 2021-10-08

Family

ID=77938275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110773406.3A Pending CN113481229A (zh) 2021-07-08 2021-07-08 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113481229A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574367A (zh) * 2022-04-25 2022-06-03 济宁学院 一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045525A (zh) * 2013-01-22 2013-04-17 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103805548A (zh) * 2014-03-11 2014-05-21 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤
CN103897994A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN106047753A (zh) * 2016-06-06 2016-10-26 厦门生命互联科技有限公司 一种高转化效率感受态细胞的制备方法
CN110004078A (zh) * 2019-03-20 2019-07-12 华南农业大学 一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103897994A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103045525A (zh) * 2013-01-22 2013-04-17 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103805548A (zh) * 2014-03-11 2014-05-21 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤
CN106047753A (zh) * 2016-06-06 2016-10-26 厦门生命互联科技有限公司 一种高转化效率感受态细胞的制备方法
CN110004078A (zh) * 2019-03-20 2019-07-12 华南农业大学 一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘忠民: "临床分子生物学检验技术实验指导 供医学检验技术等专业使用", 华中科学技术大学出版社, pages: 93 - 94 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574367A (zh) * 2022-04-25 2022-06-03 济宁学院 一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Inoue et al. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids
Lee et al. Replication deficiencies in priA mutants of Escherichia coli lacking the primosomal replication n'protein.
Donohue et al. [22] Genetic techniques in rhodospirillaceae
CN112813085B (zh) 焦磷酸酶基因的用途
Chuanchuen et al. Benchtop and microcentrifuge preparation of Pseudomonas aeruginosa competent cells
Duilio et al. Recombinant protein production in Antarctic Gram-negative bacteria
CN110066820B (zh) 一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用
CN110904140A (zh) 一种蛋白动态表达调控系统及其在莽草酸生产中的应用
CN113481229A (zh) 一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法
Lin Electrotransformation of agrobacterium
CN108220219A (zh) 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用
WO2024207806A1 (zh) 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用
Wovcha et al. Amplification of D-xylose and D-glucose isomerase activities in Escherichia coli by gene cloning
WO2006083315A2 (en) Non-dividing donor cells for gene transfer
CN111690581B (zh) 利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法
Löfblom et al. Selection of affibody molecules using staphylococcal display
US20060105432A1 (en) Method for the production of vitamin b12
TWI414602B (zh) 新穎之大腸桿菌與其用途以及製備勝任細胞的方法
Rajkumar et al. A Comparative study on plasmid isolation from strains of Enterobacter aerogenes using different optimized procedures
EP0212444B1 (en) Process of producing highly transformable cells and cells produced thereby
CN116042416B (zh) 高产ε-聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株及方法与应用
US20210355434A1 (en) Methods of Producing Cannabinoids
CN101892228A (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN118812672A (zh) 转录调控因子突变体及其在生产l-色氨酸中的应用
JP3682530B2 (ja) 酵母の形質転換方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination